高丁醇比丙酮丁醇梭菌及其培养方法与应用

摘要

本发明提供了一种丙酮丁醇梭菌EA2018菌株，它是丙酮丁醇梭菌的突变菌株，具有在发酵生产溶剂中丁醇比高达67-72％的特性。本发明还提供了包括分离、选育、复壮、保藏的培养方法以及工业生产工艺，工艺中设计了种子质量监控方法，本菌株高丁比性状稳定，耐温性好，可以48％高粱替代玉米发酵，发酵效率高，是一种适合工业生产的优良菌种。

说明书

本发明涉及一种高丁醇比丙酮丁醇梭菌，这种菌株的培养方法及其在溶剂发酵工业中的应用。

丁醇是一种极为有用的化工和制药工业的重要原料，在化学工业中，丁醇在油漆、塑料、树脂等有机合成领域有广泛的应用，在制药工业中，特别在青霉素等抗生素的提炼过程中必须大量使用由丁醇而得到的丁酯类溶剂，丁醇可以由石油化工合或技术取得，但制药工业则优先采用由生物发酵生产的丁醇。同时，在石油开采发生危机(1973-1974)之后，人们对微生物发酵生产溶剂的兴趣重现，特别是在石油资源缺乏或石油化工业技术较差的国家地区，以再生资源淀粉质进行溶剂发酵仍是丁醇生产的重要途径，最近两次(1990和1994)的国际工业微生物遗传学术会议都有专题讨论梭菌遗传、生化代谢与基因克隆等内容，充分反映了这个传统生产方法的重要意义。

传统的发酵法生产丙酮丁醇是以玉米或玉米加薯干为淀粉质原料，直接接入典型的丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(Clostridiumacetobutylicum)。其生产工艺是玉米→粉碎→配醪→蒸煮→后熟→醪冷却→接种→在一定温度和时间下完成发酵→蒸馏，得到丁醇、丙酮、乙醇。在发酵过程中产生的丁醇对菌体生长和产生溶剂有抑制作用，发酵醪液中溶剂的浓度受到限制。传统法生产溶剂的主要缺点是溶剂比例不尽人意，丁醇、丙酮、乙醇三种溶剂的比例为6∶3∶1，在国内，此法生产所得到的丁醇，比例还要略低一些，约在57％-60％。

因此如何来提高溶剂中丁醇的比例是广大研究者的一致目的，但现有技术均采用传统的丙酮丁醇梭菌Clostridiumacetobutylicum，注重在发酵工艺上研究改进。如申请号为87103534，名称为“吸附法固定化细胞直接发酵淀粉质原料生丙酮丁醇的方法”的一项发明专利申请，申请人提出用丙酮丁醇梭菌经5％玉米醪培养基中培养和筛选得到对数生产期的丙酮丁醇菌液，制备吸附法固定化细胞然后采用吸附法固定化细胞直接发酵淀粉质原料生产丙酮丁醇溶剂。该项发明所提出的方法目前仍停留在实验室阶段，另外由于这种方法采用传统的菌种，故肯定不能达到用本发明的菌种在发酵生产中所能达到的高丁醇的比例。

本发明的目的在于提供一种能产生高比例丁醇的新菌株，这种新菌株的包括分离、选育、复壮、保藏的培养方法及其在现有发酵工业设备条件下生产溶剂的工艺。

本发明的目的就是结合本研究所承担的国家重点科技攻关项目的任务，经过近十年的由实验室至工业规模大生产的不懈研究，终于圆满完成任务。根据本发明人对丙酮丁醇梭菌的生理生化和代谢途径的研究以及在菌种化学诱变与选育方面的经验积累，提出本发明的技术方案是：采集大豆种植区大豆根际的土样为分离新菌株的来源，以新鲜马铃薯块茎作为培养物的载体，厌氧、37℃水浴保温培养，产生气泡时把培养物移种到玉米醪试管中，在37-39℃高温条件下进行厌氧培养，将培养物移到固体平板上在37-39℃高温条件下厌氧培养出单菌落，再接种于玉米醪试管中在上述条件下进行初筛，选择较优菌株用诱变剂作诱变处理并在加拮抗剂的条件下选育得到丙酮丁醇梭菌的突变菌株EA2018。为保持菌种优良性状，取发酵醪液对EA2018菌株进行复壮，冷冻保藏菌株以供生产备用。

根据上述技术方案所培养出来的菌株，命名为丙酮丁醇梭菌EA2018菌株(Clostridium acetobutylicum EA2018)，属于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，是丙酮丁醇梭菌的突变菌株，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期是1994年11月18日，保藏编号是CCTCC NO：M94061，该培养物(株)的存活性经该保藏中心于1994年12月10日检测完毕，结果为存活。该菌株具有在发酵生产所得的溶剂中丁醇比例高达67-72％的特性。

具体的做法是：在7-8月份，从上海郊县的大豆种植区采集根际土样共64份。在马铃薯块茎上用打孔器形成1.0-1.5厘米深的小洞，放入适量土样，石腊封口并将其放入水钵中，37℃保温培养。新鲜马铃薯的淀份质营养即可支持土样中的某些微生物进行厌氧生长。当浸没在水中的马铃薯块的小洞封口处产生气泡时，将薯块取出、打开封口，并把培养物移种到5-7％的玉米醪试管(15×150毫米)中，玉米醪装量7毫升，37℃静置培养。培养中，玉米醪液内不断产气并有絮状物出现，即醪盖逐渐形成，经40-48小时的37℃培养，取少量醪液涂布在固体平板上，平板置于干燥器中，抽除空气，37℃培养4-5天，平板表面出现单菌落。

固体平板的培养基配方(克/升)为：牛肉膏5、蛋白胨10、酵母膏5、葡萄糖5、氯化钠5、琼脂25、调节酸碱度至PH6.5。

产溶剂菌株的筛选：分别将上述单菌按常规技术接入5-6％玉米醪试管(规格15×150毫米)中，每支试管装料7毫升，37℃培养48小时，从64个土样中共分离纯化得到产溶剂的菌株1200余株。对这些菌株的发酵醪液进行气相色谱分析，以比较各菌株的溶剂总量和丙酮、丁醇、乙醇三种成份的相对比例。经多次发酵筛选，从中选出较优的5个菌株：4号、11号、12号、17号和19号，进一步发酵筛选证明4号菌株的丁醇产量较高，即以4号菌为出发菌进行诱变育种。

              表1：4号菌株的溶剂产量(克/升)和丁醇比例丙酮     丁醇     乙醇     总溶剂    丁醇比例2.643    7.932    0.437    11.013    72％2.673    7.963    0.606    11.242    70.8％

4号菌株经诱变选育得20号菌株，该菌株在7％玉米醪中发酵，总溶剂产量13.0克/升，其中丁醇占67.2％，20号菌株进一步多次诱变，经平板筛选而得EA2018、EA2019。选育过程见表2。

        表2：高丁醇比菌株选育谱系

     ↓                ↓

丙：4.835g/L      丙：5.372g/L

乙：0.665g/L      乙：0.713g/L

丁：12.767g/L     丁：13.g73g/L

总：18.267g/L     总：20.058g/L

丁：69.9％        丁：69.7％

表中数据是典型发酵结果

诱变育种的方法如下：诱变剂采用EMS(甲基磺酸乙酯)或NTG(亚硝基胍)，拮抗剂选用丙烯醇。

出发菌菌液过滤去醪盖后，取5毫升菌液加入5毫升0.2M的EMS溶液于PH6.0-7.5、0.2M磷酸缓冲溶液中，充分混合并置于37℃的往复式摇床以100次/分的速率振荡处理2小时然后取出，加入适量硫代硫酸纳使反应终止，取菌液涂布到加有丙烯醇(2毫升/300毫升培养基)的固体平板上，置于干燥器内，抽去空气，37℃培养48-72小时后，挑单菌到玉米醪中进行筛选。或称取NTG溶于PH6.0-7.5磷酸缓冲液中，使浓度为4毫克/毫升，在6毫升菌液中加入NTG溶液2毫升，摇匀后37℃保温半小时，稀释涂在加有丙烯醇的平板上，将平板置于干燥内，37℃厌氧培养48-72小时，即可挑单菌到玉米醪中进行筛选。

高丁醇比丙酮丁醇梭菌菌株的复壮及保藏技术。

与其他的工业发酵菌株一样，对于高丁醇比菌种也需要经常进行菌种的选育、复壮，以保证优良性状得以保存，与常规的丙酮丁醇菌相比，本发明高丁醇比菌株不采用高温处理去除弱孢子的方法，其复壮技术是将发酵醪液用纱布过滤，取0.1毫升滤液涂平板后置于干燥器内，37℃厌氧培养5天，得到单菌落，接入5-6％玉米醪试管37℃培养48小时，再接7％-8％玉米醪250毫升三角烧瓶，37℃发酵48小时，气相色谱测定溶剂总量和丁醇比例，择优保藏。

其保藏方法是：复壮后菌液用纱布过滤去废醪后，以3000～4000转/分速率离心5分钟，去上清液，将沉淀(孢子)悬浮于20％甘油中，-30℃冷冻保藏。

高丁醇比丙酮丁醇梭菌的工业生产工艺及其监控方法：传统的丙酮丁醇梭菌工业生产的工艺流程是试管醪(菌种)→按试管醪在100℃加热1.5分钟以去除弱孢子，然后在37-39℃下培养→6公升种子瓶→种母罐→发酵罐。

本发明保藏之菌种经复壮后，于固体平板上作单菌落分离并接种于5％-6％玉米醪试管，37℃培养40小时，然后同步分别转接7％玉米醪的试管和250毫升三角瓶(装醪150毫升)，37℃培养48小时，醪液作气相色谱分析，择发酵性能良好者接入6公升醪液种子瓶，37℃培养36小时，转入50吨种母罐扩种后进入发酵罐连续发酵，整个生产流程见表3。

         表3：工业生产规模的工艺流程甘油管→涂平板→置于干燥器抽真空，37℃培养5天

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            挑单菌到5％玉米醪

            37℃培养，40小时

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               传一代试管

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              250毫升三角瓶

                   ↓

        溶剂三成份分析，择优接种

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              六公升种子瓶

                   ↓

                 种母罐———————→发酵罐

本生产工艺中设计了在种子进入6公升种子瓶前对种子质量监控的技术，保证了高质菌种入罐发酵。

混合发酵原料的应用。

可供发酵法生产溶剂所使用的淀粉质原料种类很多，如糖蜜、大米、玉米、薯干。为适应不同地区的原料不同、价格差异、运输等因素，菌株对原料的适应性很重要。本发明提供的高丁醇比菌种除能适用单一玉米发酵外，亦能用于玉米/薯干，玉米/高梁混合发酵，当以玉米醪浓度为7％，其中可用20％薯干替代玉米，即玉米5.6％，薯干1.4％进行发酵，结果见表4：表4：以玉米/薯干为原料，高丁醇比菌种发酵溶剂总量及比例表菌号      丙酮   丁醇      乙醇     总溶剂    丁醇比例EB2018    4.6    12.954    1.014    18.578    69.7EB2019    4.291  12.961    1.031    18.285    70.8所产溶剂量以及丁醇所占比例与7％纯玉米醪发酵结果相似。

当以玉米/高梁为混合原料发酵作规模生产时，也得到理想结果。玉米醪浓度为7％时，高梁的替代比例可高达48％左右，详见表5。表5：玉米/高梁混料发酵中溶剂月产量(吨)和三成份所占几例(％)

混料色种     月耗毛粮日期     丙    酮     乙    醇       丁    醇   吨         ％   吨  ％   吨 ％    吨  ％玉米高梁439.058      52.4398.970      47.095.336.63922.411.5327.1115.13370.5玉米高梁328.869      51.1315.210      48.995.426.52218.98.586.1105.48675.0

本发明的优点十分明显突出，这种高丁醇比丙酮丁醇梭菌生产高丁醇溶剂性状稳定、对高温的耐受性强、对发酵原料的适应性好、发酵效率高，是一种适合工业生产的优良菌株。

1、生产溶剂性状稳定，所产正丁醇比例比现有技术高10％。在溶剂厂培菌室进行6公升发酵试验以考察高丁比菌株的稳定性，对EA2018和EA2019两菌株进行了多次发酵和溶剂分析测试，结果见表6表6：高丁醇比菌株多批发酵中的溶剂产量(克/升)和丁醇比例(％)

(7％玉米醪，37℃，48小时)菌株     实验批号    丙酮    丁醇     乙醇    总溶剂    丁醇比例EA2018      1        4.44    11.69    0.53    16.69       70.0

        2        4.47    11.81    0.57    16.96       70.0

        3        4.49    11.86    0.64    16.99       69.9

        4        4.84    12.77    0.67    18.29       69.8

        5        5.34    14.24    0.75    20.37       70.1

        6        5.43    14.52    0.73    20.70       70.2菌株     实验批号    丙酮    丁醇     乙醇    总溶剂    丁醇比例EA2019      1        4.42    11.60    0.64    16.66       69.6

        2        4.72    12.24    0.65    17.61       69.5

        3        5.37    13.97    0.71    20.06       69.7

        4        5.14    13.12    0.64    18.90       69.4

5    4.65    12.21    0.66    17.51    69.7

6    4.99    13.23    0.66    18.89    70.1

对EA2018菌株做连续传代试验，同一菌株在7％玉米醪液中，连续转换传代，对每一代的发酵醪液作溶剂总量和三成分的测定，证明高丁比性状在十五次传代中仍较稳定。

2、高丁醇比菌种对温度的适应性好

一般而言，丙酮丁醇梭菌的最适发酵温度为37℃，但在工业生产操作中.有时因进醪温度偏高，而影响发酵正常进行，因此，菌种以能对温度有一定耐受性为佳，温度对EA2018发酵影响见表7：

                  表7：高丁比菌株EA2018的耐温性发酵温度                   溶剂产量(克/升)

       丙酮     丁醇    乙醇    总溶剂    丁醇比例(％)37℃      4.84    12.60    0.67    18.11        69.939℃      4.45    13.05    0.86    18.36        71.140℃      4.45    11.90    1.30    17.68        67.4

由此可见，EA2018在39℃，发酵完全正常，当温度升到40℃时，总溶剂量和丁醇比例均略有下降，但并不严重，因此，这一菌种能适于工业生产应用。

3、本发明的菌种对发酵原料的适应性好，不仅可采用玉米为原料还可以部分更为价廉的高梁来替代玉米。

4、发酵效率较现有水平高0.5％-1％。

综上所述，我所微生物代谢调节研究室，通过土样筛选、菌种选育、诱变处理、发酵优化、获得了可供工业规模应用的高丁比丙酮丁醇发酵菌株。在不改变国内现有发酵生产设备的条件下，发挥菌种优势，以6-7％玉米醪或同样醪浓度的玉米(52％)高梁(48％)混料发酵，控制37-39℃罐温，气相色谱分析结果：总溶剂17-18克/升，丙酮(A)/丁醇(B)/乙醇(E)之比为23％∶70％∶7％。该高丁醇比菌种经某溶剂厂工业规模7只100吨罐连续发酵近一年的生产考察，实际生产成品入库率的ABE之比为21.0％∶71.4％∶7.6％。发酵平均效率在24.5％和25.5％之间。该菌种大大提高了工业生产的经济效益。