乌比美克及含乌比美克的药物组合物治疗病毒性肝炎的用途

摘要

本发明涉及乌比美克或其盐及含乌比美克或其盐的药物组合物治疗病毒性肝炎，尤其是慢性乙型肝炎的用途。

说明书

本发明涉及乌比美克或其盐及含乌比美克或其盐的药物组合物治疗病毒性肝炎的用途。

病毒性肝炎是严重危害人类健康的全球性传染病，现已发现至少有五种病毒性肝炎病源体，即甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)，它们均可诱发急性肝炎，其中乙、丙、丁型肝炎病毒诱发的肝炎可形成慢性肝炎。急性肝炎一般具自限性，即患者可完全恢复，因此治疗病毒性肝炎研究的重点和难点在慢性肝炎方面，特别是发病率高的慢性乙型肝炎。目前全世界携带乙肝表面抗原(HBsAg)的人数超过2.8亿，慢性乙型肝类患者约7800万。

目前治疗慢性乙型肝炎的药物主要有以下几种：

1.抗病毒药物，如干扰素。干扰素目前被认为是治疗慢性肝炎较为理想的药物，其在临床治疗上可使30-45％的患者病情缓解(HBeAg转阴，肝组织学有改善)及5-25％的患者得到治愈(HBeAg和HBsAg均消失)。但干扰素不能口服给药，费用较高，对不需住院治疗的慢性肝炎患者及普及使用很不方便，另外其副作用明显，如高热(38-40℃)，战栗、低血压、恶心、腹泻、肌痛、头痛及倦怠等。这些使其广泛应用受到很大限制。

2.其它抗病毒药物：如阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、阿昔洛韦、磷甲酸、叠氮胸苷、苏拉明、聚肌胞、2’，3’-二脱氧胞苷等，这些药物或因临床效果不能确定或因毒副作用大而未能得到广泛使用。

3.免疫调节药物，如(1)细胞因子，如胸腺素、免疫核糖核酸、转移因子、白细胞介素-2等；(2)激素类药物，如肾上腺皮质激素、前列腺素等；(3)特异的或非特异的抗原或特异性抗体，如乙肝疫苗、卡介苗、草分枝多糖、高效价免疫球蛋白等；(4)影响细胞内环核苷酸的化合物，如咪唑类药物。但目前这些免疫调节药物仍处于试验阶段。

4.来自中国传统医学药物的药物，如猪苓多糖、山豆根注射液、苦参碱注射液、香茹多糖等，但这些药物的疗效目前还有待于进一步验征。

因此，寻找并开发具有疗效高、副作用低，给药方便的新的抗病毒性肝炎药物仍是十分迫切的。

本发明的目的是寻找具有疗效高，副作用低的抗病毒性肝炎药物。

本发明人经广泛深入地研究，现已出人意料地发现乌比美克或其盐对病毒性肝炎，尤其是慢性乙型肝炎具有优良的治疗效果，且副作用很低，本发明基于上述发现得以完成。

乌比美克是已知具有下式的化合物，其化学名称为N-〔(2S，3R)-4-苯基-3-氨基-2-羟基丁酰〕-L亮氨酸。该化合物首先是由梅沢浜夫等人从橄榄网状链霉菌MD₉₇₆-C₇菌株的发酵液中分离得到，并发现其对氨肽酶B和亮氨酸氨肽酶有明显抑制活性〔J：Antibiotics，29，97-99(1976)〕。

乌比美克目前主要用作抗癌剂(见日本特公昭60-9487，公开特许公报平4-193827)、放射线副作用减轻剂(见日本公开特许公报平3-110150)、抗血栓形成剂(见日本公开特许公报昭62-72613)和末梢镇痛剂(US4,308,256)等。但至今尚无任何人报道涉及其在治疗病毒性肝炎方面的用途。

因此，本发明第一方面涉及的是乌比美克或其盐治疗病毒性肝炎，尤其是慢性乙型肝炎的用途，其包括将治疗有效量的乌比美克或其盐用于治疗病毒性肝炎患者，尤其是慢性乙型肝炎患者。

本发明第二方面涉及的是含乌比美克或其盐的药物组合物在治疗病毒性肝炎，尤其是慢性乙型肝炎的用途，其包括将该药物组合物用于治疗病毒性肝炎患者，尤其是慢性乙型炎患者。该药物组合物包括乌比美克或其盐，有或没有其它可用于病毒性肝炎药物，及制药领域中所用的辅助。

本发明再一方面涉及乌比美克或其盐用于制备治疗病毒性肝炎药物的方法，其包括将治疗量乌比美克或其盐，与有或没有已知其它可用于治疗病毒性肝炎的药物，及制药领域中所用的辅剂混合。

根据本发明，本发明的乌比美克及含乌比美克的药物组合物可以各种适宜的给药途径给药，优选口服给药。给药的剂量范围根据患者的年龄、性别、体重、所患肝炎的严重程度及给药途径而变化，一般给药的剂量范围为10-100mg/天。

下面的药理实验用来说明乌比美克对病毒性肝炎的生物作用。

一、乌比美克抗鸭乙型肝炎病毒的实验

                材料与方法

(一)动物模型：

采用健康成年的重庆麻鸭蛋孵化的1-2日龄雏鸭，经腹腔接种0.1ml DHBV DNA阳性病毒血清。接种1周后，分别颈外静脉抽血，用地高辛标记的D HBV DNA探针经斑点杂交检测选出感染阳性鸭作为实验动物，饲养至1月龄。

(二)实验分组及用药：

将DHBV DNA阳性的1月龄鸭76只随机分为5组：

1.病毒对照组：用淀粉胶囊，于每日清晨空腹灌服，剂量为0.8g/kg/日。

2.阳性药物对照组：用阿昔洛韦，每日腹腔注射1次，剂量为100mg/kg/日。

3.乌比美克小剂量组：剂量为0.5mg/kg/日。

4.乌比美克中剂量组：剂量为5mg/kg/日。

5.乌比美克大剂量组：剂量为25mg/kg/日。

乌比美克，为白色粉末，与淀粉混匀后制成相应规格胶囊，于每日清晨空腹灌服。

实验用药时间为1月。

(三)观察指标：

1.血清DHBV DNA改变情况：于用药前、用药2周、用药1月、停药1周分别颈外静脉抽血，分离血清于-20℃保存待检。采用斑点杂交法，用地高辛探针将用药前后的血清统一对比检测，以与探针同源性的质粒DNA倍比稀释后点样于硝酸纤维薄膜上杂交显示的斑点颜色深浅为标准，与待检血清斑点杂交斑点颜色深浅比较来半定量。

2.于停药后将实验动物每组分别剖杀半数，各取小块肝组织固定于10％甲醛溶液，作常规HE染色病理检查。其余肝脏冰筒运回实验室，-70℃保存，以供提取鸭肝的总DNA，作Southern Blot检测，分析药物对肝内病毒DNA复制的作用。

3.各组于用药前、用药2周、用药1月、停药1周分别抽血检测鸭血清中谷丙转氨酶及谷草转氨酶(ALT及AST)的变化情况。

                    结果

(一)、用药前、中、后血清DHBV DNA改变情况：

除病毒对照组外，阳性药物对照组、乌比美克小、中、大剂量组用药1月与用药前比较，均有DHBV DNA显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.0)，小剂量组用药2周也表现DHBV DNA有显著降低。停药1周后均有DHBV DNA回升现象，见表1。用药前感染病毒DNA滴度低者用药后较容易阴转，其中阳性药物对照组用药2周、1月DHBV DNA阴转率为30.77％、46.15％，较乌比美克各剂量组略高，但无显著性差异(P＞0.05)，见表2。无论DHBV DNA含量的降低还是DNA阴转效果的好坏，似与乌比美克的剂量大小无明显的关系

            表1用药前后血清DHBV-DNA滴度改变情况(X±S)

                       log DHBV-DNA(Pg/μl)±S组    别           例数

                      用  药  前    用药2周      用药1月       停药1周病毒对照组          15    2.27±1.00    2.13±1.02   2.87±1.02   2.47±1.15阳性药对照组        13    1.69±0.99    1.39±1.15   0.54±0.50^**2.46±1.08乌比美克小剂量组    18    2.45±1.07    1.57±1.30^* 1.17±1.07^**1.50±1.07^*乌比美克中剂量组    16    2.31±1.16    1.69±1.36   1.56±0.86^* 2.00±1.23乌比美克大剂量组    14    2.36±1.17    1.71±1.03   1.36±1.03^* 1.93±1.33

  注：″*″：         p＜0.05；

      ″* *″：       p＜0.01

各组每只鸭用药前后血清DHBV DNA滴度改变情况见附表1-5，其中“++++”：10,000pg；“+++”：1000pg；“++”：100pg；“+”：10pg；“-”＜1pg

表2用药2周、1月及停药1周血清DHBV DNA阴转率(％)组    别            用药2周         用药1月         停药1周病毒对照组             0(0/15)          0(0/15)         0(0/15)阳性药对照组       30.77(4/13)      46.15(6/13)      7.69(1/13)乌比美克小剂量组   27.78(5/18)      27.78(5/18)     16.67(3/18)乌比美克中剂量组   25.00(4/16)       6.25(1/16)     12.50(2/16)乌比美克大剂量组   14.29(2/14)      21.43(3/14)     21.43(3/14)(二)、肝脏HE染色病理检查：各组均有不同程度肝细胞空泡变性、肿胀，部分可见汇管区及小叶间隔炎症细胞浸润。这种非特异性肝组织病理表现用药组与对照组无明显差异，未见乌比美克用药组肝细胞坏死与增生现象。

(三)、肝脏组织DNA提取物Southern Blot检测：用阿昔洛韦、乌比美克治疗1月后，鸭肝组织中的DHBV DNA有普遍降低，特别是松弛环状DNA(RC)、超螺旋DNA(SC)、单链DNA(SS)均有降低、见图1。

图1说明：a、b、d、e分别为阿昔洛韦、乌比美克大、中、小剂量组鸭肝组织DNA提取物，C为病毒对照组鸭肝组织DNA提取物。以H ind III酶切的λ噬菌体DNA作为分子大小标准(Kb)。

(四)、用药前、后血清转氨酶改变情况：

见表3、4。各实验组的ALT及AST随时间的推移均有降低回至正常的现象(我们检测了10只正常未感染DHBV血清的成年麻鸭血清中的ALT及AST，其结果分别为(＜44.47酶活力单位，＜49.35酶活力单位)，虽然DHBV的感染仅能使血清转氨酶短暂升高，但同一时相相比可见用药2周、1月乌比美克各剂量组的ALT与病毒对照组比较有极明显差异(P＜0.01)，而阿昔洛韦用药2周、1月ALT与病毒对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。此外用药2周，各用药组的AST无显著性差异(P＞0.05)，而用药1月、停药1周后各用药组与病毒对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。

            表3用药前后血清ALT改变情况(酶活力单位X±S)组    别            用  药  前     用药2周         用药1月         停药1周病毒对照组          75.79±7.21    74.20±7.78     55.74±13.97    50.98±15.73阳性药对照组        72.42±11.09   69.34±5.21     49.59±10.65    49.79±17.81乌比美克小剂量组    73.58±8.42    63.31±8.52^**  39.77±16.26^** 40.24±12.48^*乌比美克中剂量组    70.69±13.24   50.98±10.14^** 38.42±21.11^** 39.48±28.79乌比美克大剂量组    76.47±14.56   57.58±7.09^**  42.45±8.53^**  42.60±12.97

     注：″*″            p＜0.05；

         ″* *″          p＜0.01表4  用药前后血清AST改变情况(酶活力单位X±S)组    别           用  药  前      用药2周       用药1月         停药1周病毒对照组         69.83±10.37    66.67±11.06  51.28±14.32    58.82±25.01阳性药对照组       71.64±17.06    61.74±8.67   31.68±3.39^*   48.34±19.61^*乌比美克小剂量组   74.15±11.46    65.79±17.29  35.70±18.15^*  42.16±17.06^*乌比美克中剂量组   70.02±14.57    69.50±11.70  36.58±27.90^*  45.56±28.15^*乌比美克大剂量组   73.70±8.79     70.97±11.60  43.91±10.46^*  43.55±11.74^*

注；″*″     p＜0.05；

    ″**″    p＜0.01

                        结论

DHBV与HBV同属嗜肝DNA病毒科(Hepadnavirus)，DHBV感染鸭作为研究人类乙型肝炎发病机理、病毒复制过程及筛选有效治疗药物的鸭乙肝动物模型的应用日益增多。1-3日龄雏鸭感染DHBV可维持长期病毒血症而无明显的自然转阴现象。因此，我们应用鸭乙肝动物模型进行乌比美克抗病毒作用的考核，为临床治疗肝炎病人提供了参考资料。

实验结果表明：用药1月乌比美克能使血清中DHBV DNA显著或极显著降低，虽停药后有DNA回升现象，但其DNA回升程度较阳性药对照组(阿昔洛韦)轻，阿昔洛韦停药1周DNA回升滴度超过了用药前DNA滴度。此外，乌比美克抗病毒效果与乌比美克剂量大小无明显关系，小剂量的乌比美克治疗1月后即有显著抑制病毒的作用。

肝脏病理检查及治疗前后血清转氨酶检查发现，乌比美克对肝脏组织学无明显影响，而治疗期间同一时相内能使ALT、AST有明显的降低，说明此药有一定的改善肝功能的效果。

Southern Blot检查提示乌比美克能抑制DHBV DNA的肝内复制，表现在用此药治疗1月后肝内组织DHBV DNA的RC、SC、SS均有降低。

二、乌比美克对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响

(一)材料

1.动物：ICR小鼠18-22克，雌雄各半。四川抗菌素工业研究所动物房生产。

2.药物：乌比美克(Ubenimex，下称BS)由四川抗菌素工业研究所提供，白色粉末，批号94836B。联苯双酯，中国医科院药物研究所实验药厂生产，批号881217。CCl₄系重庆南方化学试剂厂产品，分析纯，用前以植物油制成0.1％溶液备用。

(二)方法

将动物随机分组，BS设三个剂量组，即0.05mg/Kg/天、0.5mg/Kg/天、5mg/Kg/天，口服，连续7天；另设生理盐水对照组和阳性对照组(联苯双酯60mg/Kg/天，口服，连续7天)，上述各组于末次给药后24小时腹腔注射0.1％CCl₄10ml/kg，再于注射CCl₄24小时后断头法处死动物，收集血液，分离血清，用雅培NP全自动生化仪测定天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)⁽¹⁾。实验重复一次。

(三)结果

结果见下表：

BS对CCl₄致小鼠急性肝损伤AST、ALT影响(X±SD)分鼠                                    ALT(U/L)                       AST(U/L)组数      给药方案 (只)                            第一次           第二次       第一次          第二次1 10      NS对照               48.75±18.94    45.66±21.47   147.39±30.36    145.48±28.872 10   BS0.05mg/kg/day po×7   36.98±6.45     40.18±24.92   140.79±22.25    163.55±32.173 10   BS0.5mg/kg/day po×7    31.72±10.23^*  29 93±6.73^* 135.73±31.86    138.83±31.104 10   BS5.0mg/kg/day po×7    25.26±11.60^** 24.81±8.50^** 143.41±37.60    139.64±30.475 10     联苯双酯              29.69±5.58^**  13.54±2.64^** 160.80±14.09    158.81±12.21

   60mg/kg/day po×7

      *            与NS组比较，0.01＜p＜0.05

      * *          与NS组比较，p＜0.01

由于CCl₄致小鼠肝脏损伤后主要是ALT升高，因此由上表可看出BS给药组与对照组相比，能显著降低CCl₄中毒小鼠的血清ALT活性，且降低作用呈剂量依赖性。

下面的临床治疗实施例用来进一步说明乌比美克治疗慢性乙型肝炎的疗效，但其不意味着本发明仅限于此。

实施例1

一、病例选择：23例主要为1993年-1994年1月住院的慢性迁延性乙型肝炎，且HBeAg或/和HBV-DNA阳性，无抗病毒药物或激素应用史。与相应时间可比病例20例作对照。临床分型和诊断标准根据1990年5月全国病毒性肝炎学术会议修订方案。

二、一般资料：乌比美克治疗组男19例，女4例，年龄8-47岁，病程11月-7年。对照组男16例，女4例，年龄6-63岁，病程、病原学及临床表现基本相似。

三、检测方法；乙肝三系采用ELISA法，HBV-DNA采用PCR法。于治疗前及疗程第2、3个月的血清标本进行检测。

四、治疗方法：乌比美克组以乌比美克30毫克，每日一次，连服90天为一疗程。对照组为猪苓多糖加病毒唑9例，猪苓多糖加乙肝疫苗11例，疗程3个月。

                        结果

一、乙肝病毒高复制标志转阴率：治疗组HBeAg和HBV-DNA均阳性的12例中，两项均转阴者3例(3/12)，HBeAg一项阳性的11例转阴8例(8/11)，HBeAg总转阴率69％(16/23)。对照组20例中HBV-DNA5例阳性均未转阴。HBeAg阳性的15例中转阴5例，转阴率33.3％(5/15)。两组对照μ＝2.1634，P＜0.05，有显著性差异，乌比美克组显著高于对照组。

二、肝功能(ALT及SB)变化情况：治疗组治疗前肝功ALT51-386μ，疗程开始1-2月，除1例8岁母婴传播的患儿，22例均有不同程度升高，疗程3月时15例ALT降至正常，复常率为65.2％，治疗组治疗前SB4-17.1μmol/L，治疗后除1例上升至19.1μmol/L，后经处理降至正常外，其他均在正常范围。对照组治疗前ALT异常20例，治疗后恢复正常12例，复常率60％，与乌比美克相比μ＝0.035，P＞0.5，两组无显著性差异。对照组治疗前部分病例SB轻微升高，但经护肝治疗即降至正常。

                          讨论

采用乌比美克治疗慢性迁延性乙型肝炎23例，并与猪苓多糖治疗的慢性乙肝作对照，结果显示乌比美克抗病毒作用优于猪苓多糖，且服用方便。对慢性迁延性乙型肝炎无明显不良反应。

由以上试验数据和临床治疗实施例可看到，乌比美克对病毒性肝炎，尤其是慢性乙型肝炎有良好的疗效。

   附表1病毒对照组用药前后血清DHBV DNA滴度变化情况动物编号      用药前      用药2周      用药1月      停药1周25              ++          ++           +++          ++++35             +++           +            ++           +++80              ++           +            ++             +81              ++          ++          ++++             +82             +++         +++           +++           +++90               +           +           +++          ++++121              +         +++           +++           +++122           ++++        ++++          ++++          ++++135            +++           +            ++             +138              +          ++             +             +174              +          ++           +++           +++175            +++         +++          ++++           +++198           ++++        ++++          ++++           +++208             ++           +             +             +209             ++          ++           +++            ++

    附表2阳性药对照组用药前后血清DHBV DNA滴度变化情况动物编号       用药前      用药2周      用药1月      停药1周  13             +            +            -          ++++  15          ++++           ++            +            ++  54             +          +++            +             +  76             +          +++            +            ++  94             +           ++            -           +++  95            ++            +            -            ++ 115             +            -            -            ++ 134             +            -            +           +++ 138             +            -            -           +++ 158            ++            +            +          ++++ 201           +++           ++            +           +++ 199             +            -            -             - 214           +++          +++            +           +++

  附表3乌比美克小剂量组用药前后血清DHBV DNA改变情况动物编号      用药前       用药2周      用药1月      停药1周   5            +             -             -            -   9           ++           +++             +           ++  10          +++             +           +++            +  39            +             -             +            +  80         ++++           +++            ++           ++  88         ++++          ++++             +           ++ 116            +             -             -            - 117           ++             +             +            + 118         ++++             +            ++            - 125            ++             -             -           + 131           +++           +++             +         +++ 139            ++             +             +          ++ 170          ++++          ++++          ++++        ++++ 183           +++             +             +           + 197           +++            ++            ++           + 218            ++            ++             -          ++ 228             +             -             -           + 230            ++           +++             +          ++

   附表4乌比美克中剂量组用药前后血清DHBV DNA改变情况动物编号       用药前       用药2周      用药1月     停药1周   20           +++            +++          ++        ++++   38             +             ++           +          ++   83           +++              +           -           +   78          ++++              +           +          ++   79             +              +           +           -   88             +              -           +           +  101             +              +           +           -  113            ++              -           +           +  129           +++           ++++          ++         +++  132            ++            +++          ++           +  140           +++            +++         +++         +++  152             +              -          ++          ++  177          ++++             ++           +         +++  203          ++++             ++         +++         +++  205           +++            +++         +++        ++++  225             +              -           +          ++

     附表5乌比美克大剂量组用药前后血清DHBV DNA改变情况动物编号      用药前       用药2周      用药1月      停药1周   17          ++++           ++           ++            +   31          ++++           ++            +           ++   46             +            +           ++           ++   88            ++          +++            +            -   86          ++++          +++          +++         ++++  100            ++          +++           ++           ++  108             +            +            +           ++  150             +            +            +           ++  183           +++          +++          +++         ++++  189             +            -            -            -  191            ++           ++           ++           ++  105            ++            +            -         ++++  207          ++++           ++            +           ++  248             +            -            -            -