公开/公告号CN1137566A
专利类型发明专利
公开/公告日1996-12-11
原文格式PDF
申请/专利权人 中国预防医学科学院病毒学研究所;
申请/专利号CN95106219.0
申请日1995-06-02
分类号C12N15/70;
代理机构北京申翔知识产权服务公司专利代理部;
代理人邓定机
地址 100052 北京市宣武区迎新街100号
入库时间 2023-12-17 12:48:12
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2005-08-03
专利权的终止未缴年费专利权终止
专利权的终止未缴年费专利权终止
2000-11-22
授权
授权
1996-12-11
公开
公开
1996-04-24
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
本发明涉及遗传工程中基因转录调控的增强子领域。
基因转录调节基本上由两类序列元件组成:一是启动子元件,二是调节子元件。启动子元件对精确、有效的转录起始是必需的,而调节子元件则起增强或减弱启动子转录效率的作用。调节子元件在特定基因转录起始的远端,一般位于mRNA转录起始上游,至少100bp以上。研究得比较详尽的是增强子序列。典型的增强子为70~150bp,可与特异性的蛋白相互作用,增强转录效率。增强子常由一个或多个连续或不连续的DNA序列元件所组成。
自1981年Banerji等(1、2)发现SV40基因组存在增强子序列以来,相继发现这一基因转录调节序列广泛存在于真核细胞及其病毒基因组中。目前认为,增强子是真核基因转录调控的一个重要而必需的元件。
1987年Harley等(3)分析了大肠杆菌,包括其质粒转座子和λ噬菌体的263个启动子序列,仍然认为-35(TTGACA)和-10(TATAAT)是高度保守的。有92%的启动子,其两个保守区的距离为17±1bp。这类原核启动子可为含有″正常″Sigma 70因子的RNA聚合酶所识别,又称为″Pribnow″型启动子。另外一类原核启动子称为Ntr型启动子,它不具有-10和-35保守区而有-12和-24保守区,它可为含有Sigma 60因子的RNA聚合酶所识别,这类启动子包括大肠杆菌glnAP2,肺炎杆菌的固氮基因等。1986年Nishi等(4)认为大肠杆菌trp和PL启动子的上游A+T丰富区可以增强其转录活性。1986年Buch等(5)发现固氮基因启动子的上游区有增强子样序列。1987年Garciarrabio等(6)发现在大肠杆菌glnA基因上游区有增强子样序列。1985年Huber和Kahmann等(7、8)发现Mu噬菌体的G节段,沙门氏伤寒杆菌的H节段,P1、P7噬菌体的C节段等的位点特异性反转重组系统中存在增强子序列。1990年Latta等(9)证明trp启动子上游AT丰富区可使基因表达水平增加2倍。这说明不论是″Pribnow″型还是″Ntr″型启动子要发挥其完全的功能,还应包括启动子的上游调节区。
1984年本发明者们在研究人α、β干扰素基因在大肠杆菌的表达节时意外发现SV40 Hind III B片段在相距启动子1000pb处可以明显地增强干扰素cDNA的表达。随后,本发明者们相继发现HPV-6BURR,HPV-16URR,痘苗病毒Hind IIIK片段和RSVG片段均有类似的增强子效应,这类动物来源的原核增强子样序列(V-EE)的特点是:1.启动子上游0.3~0.9Kb处可使报告基因的表达水平提高3-10倍;2.其增强效应无明显的方向性;3.增强子样序列本身也同时具有启动子功能,但具有启动子功能的序列不一定具有增强子样效应;4.有些原核增强子样序列既能对大肠杆菌启动子起作用,也能对痘苗启动子起作用。
本发明者们组建了大肠杆菌增强检测载体,新组建的检测载体包括下列特点:a.有一较弱的大肠杆菌启动子序列;b.在启动子下游有一个易于检测的报告基因(CAT.lac,IFN);c.启动子序列上游300bp以上有一多酶切点以便于检测多种序列是否具有增强子样活性。直接从大肠杆菌染色体DNA中克隆重了一个具有增强子样功能的约894bp片段,定名为M片段,并测定了它的全序列,采用Prosis和DNAsis软件与Gene BANK和EMBL DNA和蛋白库进行序列同源性比较,发现M增强子样序列是大肠杆菌(JM103)编码甲硫氨酸(Methionine amio peptid)和30s Ribosomal proteinS2(PPSB)部分基因及其上游调控区。缺失研究显示,M增强子样片段的功能位点分布于正向克隆3′端上游450-800bp范围内。
通过体内、外转录试验,Northern杂交,进一步证明M片段在大肠杆菌细胞中对被调控基因确有在转录水平上的增强作用,同时还证明在大肠杆菌中存在可结合于M序列的几种DNA结合蛋白。
本发明者们还进一步证明PRPL启动子及其上游调控区(300bp)(X片段)置于trp启动子上游(300bp)处,对trp启动子也有明显的增强子样效应,在cIts857存在的条件下,X片段的增强效应不受温度变化(30-42℃)的影响。DNA序列同源性分析比较结果还表明,这类具有原核增强子样功能的动物病毒基因片段:SV40 Hind III B片段、HPV6B和HPV16的URR区、RSVG区、痘苗病毒Hind III K片段等以及从大肠杆菌分离的M片段均有多个如下保守序列:TGTNxACA。这一保守序列也常见于固氮基因的转录调节区中。在与本发明者们同时及以后在国际上才相继报导在反转系统中,glnA基因,肺炎杆菌的nifH基因,以及大肠杆菌trp基因等均证实有增强子序列。
在上述研究的基础上,本发明者们采用大肠杆菌增强子样序列,构建了二类表达载体,pBV321/322和pBV324,前者带X片段,后者带M片段,证明对IFN-β,IFN-α2a,IFN-α2b,IFN-α1b/86C,IFN-α1b/86D,IFN-γ,TNF-α等基因的表达均有明显的增强作用。
本发明的目的在于确定大肠杆菌系统也存在增强子样序列,并分离出新的大肠杆菌增强子,由此人工构建一类采用大肠杆菌增强子样序列的高效载体,从而大大提高重组多肽药物的产量。
为了实现本发明的目的,本发明采用以下技术方案:本发明者构建了大肠杆菌增强子检测载体,利用等分子生物学技术从大肠杆菌染色体DNA中克隆了一个具有增强子样功能的894bp片段(称M片段),同时又证明了PL启动子的约300bp的上游调控区(称X片段)以及痘苗病毒Hind IIIK片段、RSV G区、HPV6B和HPV16的URR区等都有明显的增强子样效应。同时本发明者利用M片段和X片段构建了两类表达载体,pBV321/322和pBV324,前者带有X片段,后者带M片段。
本发明与现有技术相比,有以下有益效果:首先,本发明证明了多种具有大肠杆菌增强子样序列的片段,这些片段用于构建大肠杆菌表达载体,可提高重组多肽药物的产量。其次,利用M片段和X片段构建了两类表达载体。利用这两类表达载体生产重组多肽药物,可提高产量3-9倍。
下面结合附图来解释本发明,其中:
图1为SV40 Hind III B片段的序列;
图2为痘苗病毒天坛株基因组Hind III K/Bgl II 2.2kb片段的序列;
图3为RSVc DNABamHI G片段序列;
图4为HPV-6B型的540bp序列;
图5为HPV-16型7013-7453bp序列;
图6为大肠杆菌M增强子样序列;
图7为λPRPL启动子上游调控序列;
图8为pBV320的质粒图;
图9为pBV321的质粒图;
图10为pBV324的质粒图;
以下结合实施例来解释本发明的技术方案并对本发明作进一步说明。下列实施例仅用于解释本发明,不对本发明范围构成限制。
实施1.以CAT为报告基因的检测裁体的组建
大肠杆菌质粒pkk232-8,购自Phamacia公司,它带有一个无启动子的氯霉素乙酰基转移酶(ChloramphenicolAcetyltransferase,简称CAT)基因。在CAT基因3′端下游有两处转录终止信号,以防止强启动子干扰质粒的转录和复制。在CAT基因的5′端有一多酶接头,其上游也有一处转录终止信号,以避免来源于上游pBR322的启动子的作用。在多酶接头和CAT基因的ATG之间,有3个不同读码框架的翻译终止信号,以避免来自上游的可能的基因表达。以这一质粒为起始材料,分别构建具有多酶切点-痘苗病毒启动子-CAT的增强子序列检测载体,其中多酶切点与启动子序列之间的距离>300bp。带有痘苗病毒7.5K启动子的增强子样序列检测载体称pTE7.5;带有痘苗病毒11K启动子的增强子样序列检测载体称pTE11;带有痘苗病毒N启动子的称pKN2。
实施例2.以lac为报告基因的检测载体的组建
以β-半乳糖苷酶基因(lac)为报告基因,构建的增强子样序列检测载体称pAL和pLW。其基因排列是5′多酶切点-300bp-p7.5启动子-β-半乳糖苷酶基因,pAC与pLW的差异在于多酶切点的不同。
实施例3.以人干扰素为报告基因的检测载体的组建
先采用pKC-30质粒,在HpaI位点处插入人αI型干扰素cDNA,在PL启动子控制下进行表达,在距PL启动子上游1000bp处有Hind III位点,以检测增强子样序列。组建的检测载体称pKC-30/IFN-α1。
实施例4.SV40基因组的大肠杆菌增强子样序列的确定
将约1kb的SV40 Hind III B片段插入PKC30/IFN-all载体的Hind III位点,可使报告基因的表达量增加6倍。SV40 Hind III B片段的全序列见附图I
实施例5.痘苗病毒Hind III K片段的大肠杆菌增强子样序列的确定
采用Lac检测载体证明痘苗病毒天坛株Hind III K片段中的2.2kb的Bgl II片段,对报告基因的表达有明显的增强作用。宿主菌为JM103时,无Hind III K的BglII片段插入时,Lac的表达量为285±37单位,正向插入时为1387±268单位,反向插入时为437±48单位。当宿主菌为MC1061时,各为169±38单位、558±116单位和261±45单位。痘苗病毒天坛株Hind III K片段的DNA全序列见附图2
实施例6.呼吸道合胞病毒(RSV)cDNA的BamH I G片段(0.7kb)的大肠杆菌增强子样序列的确定
采用Lac检测载体证明RSV cDNV的BamH I G片段对报告基因的表达有明显的增强作用,当宿主菌为JM103时,无插入片段时为2.9±0.9单位,正向插入时为21.2±2.0单位,反向插入时为21.9±1.2单位。呼吸道合胞病毒(RSV)cDNA BamH I G片段全序列见附图3
实施例7.人乳头瘤病毒6B型基因组URR区段的大肠杆菌增强子样序列的确定
用BamH I从pBR322质粒上切下HPV6b全基因组,再用Hae III消化成19个片段,鸟枪法克隆到上述增强子样序列检测载体Sma I位点上,转化子在含氯霉素500μg的平皿上进行筛选。(无插入片段的pTE7.5在此氯酶素浓度的平皿上不能生长)。把生长的菌落提取质粒后,经酶切和分子杂交检定这些阳性克隆均含有Hae III 2.3kb片段(pTEL1),这相当于HPV-6B URR区。氯霉素抗性强度测定表示转化子可以在600μg/ml的浓度下生长,即比无插入片段质粒的抗性增加了5倍左右。将此片段转入lac检测载体,当宿主菌为JM103时,对照无插入组Lac活性为10.4±2.8,正向插入为39.3±2.2,反向插入为21.6±2.2单位/ml。
为研究发挥增强子作用的精确部位,本发明者们进行Hae III2.3kb片段的删除分析试验。用酶切的方法从带EI基因和HPV 6B的启动子处进行逐步删除试验。最后得到540bp的片段,并且进行了DNA测序,结果表明:靠近E6基因ATG上游的540bp序列就具有完全的增强子样功能,β-半乳糖苷酶活性测定表明,当宿主菌为JM103时,对照无插入组的Lac活性为10.4±2.8,正向插入为108.9±16.1,反向插入为30.6±2.1单位/ml;宿主菌为MC1061时,对照组为8.5±0.3;正向插入为46.0±4.4;反向插入为21.0±8.8单位/ml。
同样把540bp的URR片段克隆到pKN2的多克隆位点进行氯霉素抗性的测定,结果观察到对CAT基因的表达,也有增强作用。540bp-HPV 6B URR区的DNA序列见附图4
实施例8.人乳头瘤病毒16型基因组URR区段的大肠杆菌增强子样序列的确定
本发明者们选择pAL检测载体启动子上游多酶接头中Bgl II位点作为克隆位点。将HPV16基因组1.4Kb Sau 3A I酶切片段插入此位点,得到两种方向的重组质粒(pAL01和pAL02)。本发明者们将两种重组质粒转化大肠杆菌JM103菌株。挑单菌落活化培养进行β-半乳糖苷酶活性测定,结果表明,对照无插入组的Lac活性为5.4±1.0;正向插入为14.1±1.1;反向插入为22.4±1.2单位/mL。
进一步研究HPV16基因组中上游调节区1.4Kb(14U)片段中较精确的大肠杆菌增强子样活性区域。本发明者们更大程度地缩小了14U片段。发现上游调节区的增强活性序列主要集中在14U的EcoR I酶解小片段中,存在于已报道的HPV-16全基因组7013-7453bp部位,总长为440bp。本发明者们将其称之为44U。为了进一步证明这段序列的增强子样活性,本发明者们将pAl01质粒用EcoR I酶解,经琼脂糖凝胶电泳分离大片段,再用连接酶连接,得到质粒pAL011。用Hind III和Sph I酶解pAL02质粒,经琼脂糖凝胶电泳分离大片段,再用核酸酶SI削平粘性末端,然后用连接酶连接,得到质粒pAL022。这两种质粒克隆的片段为同一片段不同方向的插入。将两种质粒同时转化JM103细菌,检测其中β-半乳糖苷酶活性。结果表明,对照组Lac活性为1.8±0.3;正向插入为11.8±1.8;反向插入为7.2±1.0单位/mL。该增强子序列见附图5
实施例9.大肠杆菌增强子样序列的确定
采用pKN2质粒作为增强子样序列的检测载体,质粒中CAT基因有能在大肠杆菌工作的痘苗病毒N启动子,根据CAT基因的表达水平通过检测其宿主菌对不同浓度的氯霉素的抗性来估价。pKN2的氯霉素抗性为100-200μg/ml。大肠杆菌JM103染色体DNA用限制酶Hind III和Hae III消化,用豆芽核酸酶处理。所获得的各大小片段克隆在pKN2的Sma I位点中,转化菌在原菌在原质粒pKN2不能生长的高浓度氯霉素(400μg)琼脂平皿进行压力筛选,结果选择出一株插入片段大小为0.9kb左右的阳性克隆菌pM1.6,经杂交试验,证明这一片段来源于大肠杆菌JM103染色体DNA。测定pM1.6的氯霉素抗性为600-800μg/ml,可使氯霉素抗性提高4-5倍。本发明者们称这一克隆片段为JM103-M(简称M片段)。
JM103-M片段不仅可使其邻近的CAT基因表达有明显的增强效应,而且,对β-半乳糖苷酶也具有类似作用。选择pG7(-)为克隆载体。用Hind III和EcoR I消化pM1.6,取出JM103-M片段,与先用Hind III消化后经过碱性磷酸酶处理的pG7(-)DNA连接,再将连接好的DNA用豆芽核酸酶处理去除不匹配的单链末端,与T4 DNA连接酶连接。在20ug/ml的X-gal平皿上挑选特别蓝的转化菌落提取质粒进行酶切鉴定,结果得到了JM103-M片段插入方向不同的二个重组质粒pGM(-)、pGM(+),本发明者们对pGM(-)、pGM(+)、pG7(-)在JM103宿主菌中的β-半乳糖苷酶活性进行比较,结果发现,JM103-M片段以两种方向插入pG7(-),均对β-半乳糖苷酶基因的表达有明显的增强效应,其中,M片段的插入方向与pM1.6中相同者[pGM(+)]为最高,方向相反者[pGM(-)]次之,经统计学处理有、无JM103-M两者差异均十分显著(P<0.01)。M片段的全序列见附图6。
实施例10.利用同样的方法确定了PRPL启动子上游调控区(X片段)为大肠杆菌增强子样序列PRPL启动子上游调控区(X片段)的全序列见附图7。
实施例11.上述增强子样序列的功能总结如表1。
表1增强子样序列的功能
β-半乳糖甘酶活性增加倍数序列 来源 宿主
无插入 正向插入 反向插入V-K 痘苗 JM103 1 4.9 1.5
病毒 MC1061 1 3.3 1.5SV40-HB 猴病毒40 JM103 1 3.6 1.6RSV-G 呼吸道
合胞病毒 JM103 1 7.3 7.5HPV6B 人乳头瘤 JM103 1 10.9 3.1-URR 病毒6b型 MC1061 1 5.1 2.3HPV16 人乳头瘤-URR 病毒16型 JM103 1 8.0 4.5JM103-M 大肠杆菌 JM103 1 5.5 3.1
MC1061 1 5.4 2.8
C600 1 5.0 2.4
HB101 1 1.5 1.3
实施例12大肠杆菌增强子样序列具有启动子活性
应用启动子检测载体pKK232-8质粒,本发明者们发现SV40 DNA Hind III B片段也有较强的启动子功能,可使它下游的CAT基因表达耐氯霉素高达700ug/ml,同时也证明Hind III K片段也有很强的启动子功能,能使它下游的CAT基因表达,可耐氯霉素高达900ug/ml。
实施例13.此外,本发明者把JM103-M片段克隆到启动子检测载体pKK232-8中,重组质粒产生了氯霉素抗性,可耐氯霉素高达700ug/ml,这说明JM103-M片段具有启动子功能。
实施例14.采用同样方法也证明HPV-6B、HPV16和RSV-G的增强子样序列也有大肠杆菌启动子功能。
实施例15.采用同样方法本发明者们证明了上述增强子样序列本身同时具有启动子功能,但具有大肠杆菌启动子功能的序列,并不一定有增强子样效应,结果见表2。
表2 原核增强子样序列的启动子活性增强字或启动子 增强子活性 启动子活性VV-K + +SV40-HB + +PSV-G + +HPV6b-URR + +HPV16-URR + +M + +VV-7.5 - +VV-HI - +VV-HN - +
实施例16.大肠杆菌增强子样序列的增强效应与串联启动子无关
将JM-103插入pG(+)载体的7.5Kb启动子与CAT基因之间,使排列为:5′p7.5--JM103-M-CAT 3′,其中p7.5与M之间距离为>300bp,结果CAT基因的表达很低,反之,5′--JM103-M-p7.5--CAT3′,则基因表达明显增强,这说明M的增强子作用并非由于二种启动子的远距离串联。
另外,将PRPL及其具有增强子效应的上游调控区X置于trp启动子的上游,使其排列为5′-X--PRPL+trp-IFN-β基因-3′,其中X-PRPL与trp拉近之间的距离为300bp,由于PRPL在clts857的溶原性细菌中是有温度效应的,30℃时cI基因低效表达,PRPL启动子效率极低,42℃时,cI基因表达受阻,PRPL有效工作,但是,结果表明,X-PRPL序列无温度效应,即在37℃时X-PRPL-trp启动子表达β-干扰素有很强的增强效应,而单纯PRPL启动子表达β-干扰素,在37℃时的表达量很低。这说明X-PRPL对trp启动子的增强作用并非由于启动子的串联作用而是一种增强子样的效应。
实施17.增强子样序列与启动子类型的关系
将上述动物病毒的大肠杆菌增强子样序列插入痘苗病毒启动子,以及PL,trp启动子上游检测它们的转录增强作用,结果表明这些大肠杆菌增强子样序列不仅对痘苗病毒启动子有增强子样效应,对PL,trp启动子也同样有增强子样效应。
实施例18.大肠杆菌增强子样序列BEL无严格启动子特异性
在大肠杆菌中至少有二类启动子,一类是需要RNA聚合酶的σ54亚单位,另一类是需要σ70亚单位。为探讨大肠杆菌″增强子″是否有严格的启动子特异性。本发明者们人工合成了52bp gln Ap2基因启动子(σ54)的上游调控区(增强了BEL),结果证明,52bp的BEL对trp(σ70)和VV(σ?)均有增强子效应。
人工合成大肠杆菌谷氨酰胺合成酶基因上游51bp的增强子样序列(Bacterial enhancer-like seqnence)(BEL)。该增强子为全序列中活性作用最强、最重要的一段,5′端合成碱基为42个,包括两个保护碱基及设置Hind III位点;3′端合成碱基为40个,包括两个保护碱基及设置EcoR I位点;中间重叠15个碱基,余下的以部分Klenow酶延伸补平。
合成的增强子BEL经纯化、变性、退火、补平后以EcoR I-Hind III端插入载体PATNF153的EcoR I-ClaI位点,该重组质粒的特点是BEL置于trp启动子的上游,肿瘤坏死因子(TNF)基因为检测指标,经酶切分析及核苷酸序列测定,证实重组质粒组建成功。通过对重组质粒PATNF153B的TNF作活性检测,发现其活性达58.5MU/L,比母株(PATNF153)高5倍;然后本发明者们又组建了重组质粒PAL-B,它的特点是BEL置于痘苗病毒7.5K蛋白基因启动子上游,β-半乳糖苷酶基因为检测基因。对β-半乳糖苷酶活性的测定表明,PAL-B的活性比PAL高4倍。另外,结果还表明51bp的BEL对trp(sigma70)启动子和痘苗病毒7.5K基因启动子(sigma?)均有增强子样效应。
实施例19.增强子样序列有一定宿主特异性
比较M增强子和HPV16-14U增强子样序列在JM103、MC1061、C600,HB101、JM83和7118宿主菌中对Lac基因表达的增强作用,结果发现HB101的作用最差,JM83最强,说明有一定宿主特异性。
实施例20.M序列对痘苗病毒启动子的转录增强效应
将M序列置于痘苗病毒启动子的上游,不论正向,还是反向均能使lac Z基因的表达增强2.6-6倍。为了进一步证明M序列对lac Z基因的表达增强作用是发生在转录水平上,本发明者们用放射性同位素标记的部分lac Z基因的DNA片段作为探针,以Dot杂交和Northern杂交方法对携有M片段的克隆菌的lac ZmRNA含量测定和比较,DOT杂交放射自显影片的扫描结果显示,携有M片段的克隆菌中mRNA含量比无M片段的高约7倍,与β-半乳糖苷酶活性检测结果相似,而Northern杂交的放射自显影结果显示,携有M片段的克隆菌lacZmRNA形成的杂交带也比不携有M片段的强度明显增加。
这说明M序列对lac Z基因表达的增强作用,的确发生在转录水平上,M序列具有大肠杆菌增强子要序列的性质。
实施例21.大肠杆菌M序列对trp启动子的转录增强效应
将M序列以正反两个方向插入到大肠杆菌trp启动子的上游,同时选用人α-肿瘤坏死因子(hTNF-α)作为报告基因,构建了带有M序列的TNF表达质粒(pATNFM(+)和pATNFM(-)),通过定量分析M序列对trp启动子转录水平的影响来研究M序列的原核增强子功能。
结果表明,带有M序列的表达质粒表达的TNF的活性比不带M序列者明显升高,其中M序列正向插入和反向插入的表达质粒表达的TNF水平分别约为不带M序列者的4倍和2倍,表明M序列对于大肠杆菌本身的强启动子trp启动子也具有表达增强的作用。以[α-32P]标记的TNFcDNA为探针进行Northern杂交,比较它们的转录水平可以发现:pATNFM(+)及pATNFM(-)的TNF mRNA的转录水平明显高于pATNF153,提示M序列对于trp启动子具有转录增强作用。
实施例22.M增强子样序列的一级结构
序列分析表明M片段为大肠杆菌(JM103)编码甲硫氨酸(Methionine amio peptid)和30s Ribosomal proteinS2(PPSB)部分基因及基因上游调控区。M片段的全序列见附图6。
实施例23.M序列的功能性部位的研究
为了确定M序列的功能部位,本发明者们进行了缺失突变体的研究。从M序列正向克隆3′端一系列突变体中选出12个克隆,从M序列反向克隆3′端一系列突变体中选出5个克隆,将缺失片段克隆到pAC检测载体,测定不同缺失突变体的β-半乳糖苷酶活性,结果说明正向缺失突变体3′端缺失450bp对增强活性没有影响,至500bp处活性下降,缺失至640bp处,增强活性消失。反向突变3′端缺失100bp对增强活性无影响,缺失至250bp增强活性降低,缺失至430bp时,增强活性消失。说明正向和反向突变体研究结果基本吻合。
对M序列、反向缺失突变体的研究显示,增强作用位点存在于正向克隆5′端上游的450bp序列中。
实施例24.用凝胶电泳延迟实验研究M序列的结合蛋白
为了初步了解本发明者们提取的蛋白各组分与M序列是否存在结合作用,本发明者们进行了凝胶电泳延迟实验和竞争性凝胶电泳延迟实验,结果显示,硫酸铵分级的各组份对DNA探针有降解作用,而在0.65M NH4Cl洗脱的部分与DNA探针结合后能产生三种不同的Protein-DNA探针迁移带,经竞争性凝胶电泳延迟实验证明,三个结合物中,有一个结合作用最强,一个次之,一个最弱。在5ug竞争性抑制剂存在下,有二个结合带变弱,而其中有一条带在10ug竞争抑制剂存在时完全消失。RNA多聚酶全酶纯化物能与M片段结合形成一条迁移率不同的带,宿主整合因子(IHF)能与M片段形成很弱的结合带。
实施例25.用体外转录实验研究M序列的结合蛋白
运用凝胶电泳延迟试验和竞争性凝胶电泳延迟试验证明提取的大肠杆菌JM103菌体蛋白中存在与M序列结合的蛋白,本发明者们利用M序列正向克隆的pASM(+)和无M序列的pAC质粒作为模板,在提取的结合蛋白和RNA多聚酶存在下,进行了体外转录实验。体外转录实验结果显示,分别以pASM(+)和pAC为模板的两个转录系统都在3kbRNAMARK附近的地方出现一条带,而以pASM(+)为模板的转录条带颜色较深,pAC系统条带颜色较浅。体外转录实验结果表明,提取的M序列结合蛋白和RNA多聚酶不仅能与M序列结合,还能相互作用发挥转录增强作用。
实施例26.带有大肠杆菌增强子样序列X的pBV320系列载体质粒(pBV320,pBV321和pBV322)的组建及特点
pBV320系统大肠杆菌高效表达质粒,其特点是在trp启动子上游300bp处有800bp长的X序列,即λ噬菌体PRPL及其上游调控区,trp启动子下游有Xbal、BamH I、Sal I、PstI等多酶切点,质粒大小为4012bp。 pBV320和pBV321区别在于多酶切点不同,pBV321和pBV322的多酶切点相同,不同点在于后者trp启动子上游290bp处的EcoR I位点缺失。pBV320和pBV321的质粒图见附图8、9。
实施例27.带有大肠杆菌增强子样序列M的pBV324系列载体质粒(pBV324,pBV325)的特点
pBV324大肠杆菌高效表达载体的特点是在PL启动子上游处有908bp长的大肠杆菌增强子样序列M片段,在PL启动子下游有EcoR I,Smal I和BamH I和Pst I等多酶切点。
pBV325大肠杆菌高效表达载体的特点是在trp启动子上游290bp处有908bp长的大肠杆菌增强子样序列M片段,在trp启动子下游有Xbal,Smal I和Pst I等常用多酶切点。pBV324的质粒图见附图10。
实施例28.利用大肠杆菌增强子样序列载体高效表达人β干扰素
人β干扰素cDNA5′端为xba I位点,3′端为Bgl II位点,全长504bp,载体为pBV320,组建时,先将pBV320用Xba I和BamH I切开,然后,经T4DNA连接酶,将二者连接,转化大肠杆菌JM103,经酶切,原位杂交,Sourthen鉴定无误,得到pBV320-β高效表达菌种。pBV320-β表达干扰素的水平比pBV220-β高7.3倍。
实施例29.利用大肠杆菌增强子样序列载体高效表达人γ干扰素
载体采用带有大肠杆菌增强子序列的pBV322,用Xba I将pBV322酶切,γ干扰素cDNA取自pBV220γ,γ干扰素cDNA两端为EcoR I位点,载体,片段经KLenow补平,然后T4DNA连接酶连接,转化JM103,经酶切,分子杂交鉴定正确,得到pBV320γ高效表达菌株.pBV320γ的表达水平pBV220γ高7.3倍。
实施例30.利用带有原核增强子样序列X和M的新型载体在大肠杆菌是高效表达人肿瘤坏死因子-a以限制酶Xbal和Pst I从质粒pTNF8上取下带起始密码子并去除了信号肽编码区的TNFcDNA,将其插入pBV320的相应位点,使TNFcDNA的5′端直接置于启动子trp下游,经杂交、酶切分析鉴定,得到重组质粒pBV320/TNF-α。所获结果见表3。
表3不同TNF质粒载体在大肠杆菌中表达水平的比较质粒 启动子 原核增强子序列X TNF活性(MU/I)*pBV320/TNF trp 有 135.20+16.92pBV220/TNF PRPL 无 63.42+24.15pBV320 trp 有 0.00pBV320 PRPL 无 0.00
*TNF活性系5次实验的平均数,宿主菌为JM103。
另外用限制性内切酶EcoR I和Pst I从pBV320/TNF质粒中切下约1.0kb含trp启动子和TNF基因的片段,插入到pAT153质粒的相应酶切位点,得到TNF表达载体pATNF153。用内切酶Hind III从PGM(+)质粒中切下约0.9kb的M片段,插入到pATNF153的Hind III酶切点(使M片段位于trp启动子上游)得到正反两个插入方向的TNF表达载体pATNFM(+),pATNFM(-)。表达水平见4表。
表4不同TNF质粒载体在大肠杆菌中表达水平的比较质粒 起动子 增强子 TNF活性(u/L)pATNFM trp 有(M+) 1.8±0.11×10pATNFM trp 有(M-) 0.91±0.13×10pATNF trp 无- 0.45±0.16×10pBV220/TNF PRPL 无- 0.63±0.14×10n=5 宿主菌JM103,M+正向插入M片段,M- 反向插入M片段 p<0.05
实施例31.利用在大肠杆菌增强子样序列载体高效表达人α1b型干扰素。
人α1b型干扰素cDNA两端为EcoR I位点,长度为565bp,5′端EcoR I切点后为ATG,接着为编码166位氨基酸的核苷酸序列。组建时,先将pBV322用Xba I和EcoR I切开,Klenow酶补平;同时,两端为EcoR I的干扰素片段用EcoR I切开,也用Klenow酶补平,二者连接,组建成pBVXa1b,经酶切鉴定无误,转化大肠杆菌JM103。
pBVXalb与pBV867表达水平的比较:在同样条件下比较了新型原核增强子表达载体pBVXalb与原生产菌种pBV867在摇瓶表达干扰素的水平。结果见表5。
表5 人α1b型干扰素表达水平(MU/L)pBV867 pBVXalb0.41 30.40.53 26.20.48 52.40.48 52.40.68 42.60.68 45.00.58 45.10.68 30.40.55 40.6
质粒pBVXalb在实验室条件下传100代,结果表达干扰素的水平未见明显改变。传代数 干扰素效价(MU/L) 1 133 60 123 70 123 80 129 90 123 100 129
实施例32.利用大肠杆菌增强子样序列载体高效表达人α2b型干扰素
将含有IFN-α2b全基因的EcoR I-Pst I片段插入新型大肠杆菌高效表达载体pBV321的Xba I-Pst I位点,得到IFN-α2b的高效表达载体pBV889。宿主菌为JM103。插入片段经限制酶切鉴定和核酸分子杂交证明大小及方向无误后,以pBV889转化大肠杆菌JM103株,并在37℃进行表达。带有原核增强载体的平均表达水平为18000mu/L,而不带有增强子载体的平均表达水平为200mu/L。传100代后,干扰素表达水平不变。
实施例33.利用大肠杆菌增强子样序列载体高效表达人IFN-α2a的高效表达
本发明者们用EcoR I和Pst I从pBV888质粒上切下865bp的人α2a型干扰素基因;同时,用Xbal和Pst I切开pBV320,用DNA连接酶使两者连接,然后再用Klenow酶补平,再连接,酶切鉴定,转化大肠杆菌JM103,构建成pBV918。本发明者们将pBV918菌种在含100ug/ml氨苄青霉素1.3%琼脂平板上连续传代60代,每传10代取菌种活化后提取质粒,用内切酶解鉴定,并在WISH细胞上测定生物学活性,结果见表6。60代后内切酶鉴定证明质粒没有丢失,并仍能保持高效表达人干扰素α2a;平均表达量为2Kmu/l。
表6 pBV918不同代数菌种干扰素表达水平代数 干扰素活性(Mega unit per liter)1代 212410代 209420代 218330代 221440代 284150代 230860代 2651
经单克隆抗体纯化后的人rIFN-α2a,用Tris/HCl,pH7.5平衡,在4℃放置半年,每月检查其活性,半年内滴度稳定。所获结果见表7。
表7人rIFN-α2a对温度的稳定性4℃下放置时间(月) 干扰素滴度(MIU/ml)
0 2730
1 2620
2 2140
3 2370
4 2010
5 2520
6 2290
实施例34.本发明者们利用大肠杆菌M和X″增强子″序列改建了两种高效表达载体,成功地提高了6种基因的表达量。所获结果见表8。
表8大肠杆菌增强子样序列高效表达多种活性多肽载体 外源基因 启动子 增强子 抗性 活性化pBV220 IFN-α2a PRPL - Amp 1.0pBV320 IFN-α2a trp X Amp 4.6pBV320 IFN-α2b trp - Tet 1.0pBV320 IFN-α2b trp X Tet 17.3pBV220 IFN-α1b/86D PRPL - Amp 1.0pBV321 IFN-α1b/86D trp X Amp 3.0pBV320 IFN-α1b/86c trp - Tet 1.0pBV321 IFN-α1b/86c trp X Tet 4.6pBV220 IFN-γ PRPL - Amp 1.0pBV321 IFN-γ trp X Amp 7.3pBV320 TNF-α trp - Tet 1.0pBV324 TNF-α trp M+ Tet 4.0pBV324 TNF-α trp M- Tet 2.0
参考文献(1)Banerji,J,et al.,Cell,27(1981),299.(2)Benoist,C.et al.,Nature,290(1981),304.(3)Harley,C.B.et al.,NAR,15(1987),2343.(4)Nishi,T.et al.,Gene,44(1986),29
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(7)Huber,H.E.et al.,PNAS,82(1985),3776
(8)Kahmann,R.et al.,Cell,41(1985),771.
(9)Katta,M.et al.,DNA and Cell Biol.,1990,9:129.
机译: 抗体分子,抗体分子变体,抗体,化合物,DNA序列,克隆或表达载体,表达载体。大肠杆菌,宿主细胞,抗体分子的生产方法,治疗或诊断组合物,抗体分子的用途,载体pdnabeng-g1,载体ptto(cdp870)和多肽
机译: 纯化的多肽,纯化的多克隆或单克隆抗体,表达载体,纯化的多核苷酸序列,多核苷酸序列的用途,重组病毒载体,重组麻疹病毒,药物组合物,其用途,宿主细胞,生产用于生产α-淀粉样蛋白的重组病毒的方法重组病毒,细胞系,西尼罗河病毒中和试验以及用于治疗和/或预防动物中与wnv或登革热病毒相关的感染或疾病的方法
机译: 于植物中提高特异性的转基因表达的方法,嵌合核酸构建体,嵌合核糖核苷酸序列,表达构建体,表达载体,非人类有机体或转化细胞,转化种子和药物制剂的用途