法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-09-10
专利权有效期届满 IPC(主分类):C12N9/02 授权公告日:20020327 期满终止日期:20140801 申请日:19940801
专利权的终止
2002-03-27
授权
授权
2001-02-14
著录项目变更 变更前: 变更后: 申请日:19940801
著录项目变更
1997-10-29
著录项目变更 变更前: 变更后: 申请日:19940801
著录项目变更
1996-11-20
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
1996-07-31
公开
公开
查看全部
本申请为1991年2月21日递交的美国专利申请No.07/660,994的接续申请。
本发明涉及杀死酵母和微生物的孢子形式的方法和组合物。特别地,本发明涉及使用一种抗菌活性增强剂和卤代过氧化物酶的结合物以增强体系的杀微生物性能的方法和组合物。
正如PCT申请公开WO92/14484中所揭示的,诸如髓过氧化物酶和嗜曙红细胞过氧化物酶这样的卤代过氧化物酶可被用来选择性地与靶微生物结合并在过氧化物和卤化物的存在时抑制靶微生物的生长,而不会消灭所需微生物或严重损害培养基中的其它成份,诸如靶微生物环境中的宿主细胞或正常菌群。已知当髓过氧化物酶和嗜曙红细胞过氧化物酶在自然体系中存有适当的卤化物辅因子(X-)或过氧化氢作为底物时具有杀死微生物的能力(Klebanoff,1968,J.Bacteriol.95:2131—2138)。然而最近才认识到卤代过氧化物酶的结合选择性以及该体系在治疗、研究和工业生产中的应用。因为新近发现的卤代过氧化物酶的选择结合性,当诸如致病微生物这样的靶微生物与卤代过氧化物酶的结合能力大于所需微生物如那些正常菌群时,靶微生物会选择性地与卤代过氧化物酶结合,而所需微生物与卤代过氧化物酶结合得很少或没有结合。当过氧化物和卤化物存在时,与靶结合的卤代过氧化物酶便催化卤化物氧化,并促使过氧化物歧化,在靶微生物表面产生单分子氧(1O2),从而导致选择性地杀死靶微生物,而仅对所需微生物或生理培养基产生最轻微的附带性的损害。因此,正如PCT申请公开WO92/14484所揭示的,髓过氧化物酶和嗜曙红细胞过氧化物酶可用作人类或动物体的治疗或预防性治疗中的消毒剂,其选择性地与致病微生物结合并杀死致病微生物而仅对宿主细胞和宿主的正常菌群产生最轻微的附带性损害。
该体系也可用于消毒或灭菌制剂中以在体外抑制靶微生物的生长,尤其是应用于要进行消毒处理诸如绷带,外科手术用器具,缝合器具,导管,牙科器具,隐形眼镜等等的生物医疗器械中,以抑制靶微生物的生长,而当该生物医疗器械随后用于体内时不会损害宿主细胞。虽然已发现PCT申请公开WO92/14484中揭示的卤代过氧化物酶灭菌体系在处理致病微生物时具有高度的有效性,但酵母和一些形成孢子的微生物仍对卤代过氧化物酶抗菌活性具有相对的免疫性。
微生物生活周期中的孢子期的特征是代谢休眠,并对外界环境因素具有抵御性,这些因素会伤害营养期的微生物。孢子萌发的最早期的特征是膨胀并从休眠状态向活跃代谢状态转变,随后是营养生长如出芽,并随后最终完成生殖。
细菌内生孢子和真菌孢子的萌发与增强的代谢和减弱的对热及化学物质的抗性相关。为了萌发,孢子必须感知所处环境足以维持营养和繁殖。据报道l—丙氨酸这种氨基酸能刺激细菌孢子的萌发(Hills,1950,J.Gen.Microbiol 4:38;Halvorson and Church,1957,Bacteriol Rev 21:112)。也有报道说,l—丙氨酸和l—脯氨酸能激发真菌孢子的萌发(Yanagita,1957,Arch Mikrobiol 26:329)。
简单的α—氨基酸,如甘氨酸和l—丙氨酸在代谢中占据中心位置。α—氨基酸的转氨基作用或脱氨基作用产生代谢和生长中所需的生糖的和生酮的碳水化合物和氮。例如,l—丙氨酸的转氨基作用或脱氨基作用产生丙酮酸盐,其为糖酵解代谢(恩伯顿—迈耶霍夫—帕纳斯Embden—Meyerhof—Parnas途径)的终产物,丙酮酸脱氢酶复合物使丙酮酸盐氧化产生乙酰—CoA,NAdH,H+和CO2。乙酰—辅酶A是三羧酸循环(Kreb’s循环)的起始底物,其反过来为线粒体电子传递链提供电子。乙酰—CoA也是脂肪酸合成和固醇合成的最终碳源。简单α—氨基酸可提供孢子萌发及随后代谢活动所需的氮、CO2、生糖和/或生酮的等效物。
Zgliczxnski等(1968,European J.Biochem 4:540—547)报道说,髓过氧化物酶通过过氧化氢催化氨基酸的依赖于氯化物的氧化,产生相应于脱羧基、脱氨基的氨基酸的氨、二氧化碳和醛。Strauss等人(1970,J.Reticuloendothel Soc.7:754—761)推论说,如此产生的醛可用作杀微生物剂。然而,Paul等人(1970,InfectImmun 2:414—418)报道说,向髓过氧化物酶—过氧化氢—氯化物测试体系中加入α—氨基酸甘氨酸和l—丙氨酸,实际上抑制大肠肝菌的死亡。另外,Klebanoff(1975,Semin Hemat 12:117—142)报道说,需100mM乙醛杀灭细菌,与这些公开数据相反,现在我们惊奇地发现,通过结合使用卤代过氧化物酶和某些用作抗菌活性增强剂的α—氨基酸来处理微生物,可显著增强卤代过氧化物酶对于酵母和孢子形式微生物的灭菌作用。
按照本发明,提供了杀死酵母或孢子微生物或者抑制其生长的方法和组合物,包括在过氧化物和氯化物或溴化物存在时以卤代过氧化物酶和至少一种抗菌活性增强剂与微生物接触。适宜的抗菌活性增强剂包括某些α—氨基酸,并优选下式化合物其中R1是氢,未被取代的或者羟基或氨基取代的具有1至6个碳原子的直链或支链烷基,或者是未被取代的或者羟基或氨基取代的具有7至12个碳原子的芳烷基,R2为氢或具有1至6个碳原子的直链或支链烷基。在一实施方案中,本发明的方法和组合物可被用于体外杀死酵母和孢子微生物,以对医疗产品或材料进行灭菌或消毒。在其它实施方案中,该方法和组合物可被用于人或动物体的抗真菌和抗酵母的治疗中,而不会消灭所需的微生物或严重损害宿主细胞。我们还发现,在某些α—氨基酸存在时卤代过氧化物酶的抗酵母和抗真菌孢子的活性可显著提高。当还有过氧化物和氯化物存在时,靶结合的卤代过氧化物酶催化卤化物氧化并在有孢子形成的微生物表面促使过氧化物歧化为单分子氧,从而导致靶微生物的死亡。虽然看来卤代过氧化物酶的活性会催化加入的部分α氨基酸的脱氨基、脱羧基作用产生醛,但是这类醛在如此低的浓度下不可能对灭菌作用具有很大贡献。看来是这些α氨基酸通过消耗产生次氯酸和单分子氧的一部分卤代过氧化物酶表现出对灭菌作用温和的浓度依赖性的竞争性抑制。然而,这些α—氨基酸对酵母出芽、孢子微生物萌发以及可能对营养期微生物的代谢加速的刺激作用似乎活化了如此处理的微生物对卤代过氧化物酶的作用,并由此大大增强了灭菌作用。
显著增强的卤代过氧化物酶的抗酵母和抗孢子活性使得本发明的方法和组合物在人或动物体的治疗或预防性灭菌处理中以及在体外用于对营养微生物、酵母、细菌及真菌孢子的消毒和灭菌中具有很高的应用价值。
用于本发明的方法和组合物中的卤代过氧化物酶包括嗜曙红细胞过氧化物酶(EPO)和髓过氧化物酶(MPO)。本发明具有代表性的抗菌活性增强剂包括α—氨基酸,选自甘氨酸和丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的l或d对映体及其烷基酯。
本发明广义上是指使用一种卤代过氧化物酶和一种抗菌活性增强剂杀死或抑制酵母和已形成孢子的微生物的方法和组合物,抗菌活性增强剂活化卤代过氧化物酶对酵母和微生物的孢子的杀微生物活性。在实施本发明时,微生物与一定量卤代过氧化物酶和一种抗菌活性增强剂如某些α—氨基酸接触以杀死或抑制酵母和微生物的孢子,卤代过氧化物酶和灭菌活性增强剂的用量为在过氧化物和溴化物或氯化物存在时能有效地抑制微生物的生长或杀死微生物。
在一特别优选的实施方案中,本发明的方法和组合物被用作灭菌剂,对包括细菌和真菌的广泛围的致病微生物呈现出增强的卤代过氧化物酶抗孢子和抗酵母活性。当用于与宿主组织接触的情况时,该灭菌体系基于二氧化卤代过氧化物酶的使用,其对致病微生物具有选择亲合性。因此,高效的杀微生物作用可直接针对靶微生物,而不会造成相关宿主组织的损害或正常菌群的破坏,即灭菌作用是选择性的并限于靶微生物。
经适当配制,卤代过氧化物酶—增强剂制剂可用来对材料和器具进行消毒甚至灭菌。高效卤代过氧化物酶—增强剂制剂可用作体外消毒或灭菌制品。通过限制过氧化氢可得性的期限,在材料或器具与宿主组织接触之前,可使卤代过氧化物酶—增强剂制剂具有足够的效力以确保其对材料或器具的消毒甚至灭菌作用。当过氧化物被用完时,便不存在由于使用该高效制剂对正常菌群和宿主组织产生的任何潜在毒性,并且由此经制剂处理的材料或器具可用于与宿主组织接触,而不必再经洗涤来解毒。
本发明典型的组合物含有(1)嗜曙红细胞过氧化物酶(EPO)和/或髓过氧化物酶(MPO),(2)过氧化氢(H2O2)或等效的过氧化物,或产生H2O2的氧化酶,(3)氧化酶的底物和(4)抗菌活性增强剂,如甘氨酸或l—丙氨酸。
在一优选实施方案中,本发明提供了体外抑制酵母和孢子微生物生长的方法和组合物,尤其是用于诸如绷带、外科用器具、缝合用具、导管、牙科用具、隐形眼镜等生物医疗器械需要消毒或灭菌时以及这些用具随后要与宿主组织进行接触的情形。本发明的方法和组合物还可用来治疗或预防由酵母或孢子形式微生物在体内引起的感染。
用于本发明的卤代过氧化物酶定义为卤化物:过氧化氢氧化还原酶(如EC No.1.11.1.7和EC No.1.11.1.10,国际生物化学联合会命名)其中,卤化物即氯化物或溴化物是电子供体或还原剂,过氧化物为电子受体或氧化剂。任一卤代过氧化物酶其催化来自过氧化氢的卤化物依赖性的单分子氧的产生并选择性结合靶微生物,均可用于本发明中。这里特别优选卤代过氧化物酶,正如所描述的包括嗜曙红细胞过氧化物酶(EPO),髓过氧化物酶(MPO)及其结合物。这里所详述的抗菌活性增强剂的存在大大提高了氧化酶—卤代过氧化物酶体系对酵母和孢子微生物的灭菌能力,因为它能活化卤代过氧化物酶体系对这些形式的微生物的灭菌作用。
本发明的抗菌活性增强剂是增强卤代过氧化物酶灭菌体系对酵母和孢子微生物的灭菌活性的物质,其使用浓度为不对体系的卤代过氧化物酶活性产生副作用或不对使用该方法和组合物的环境产生不良效果。这里优选本发明的活性增强剂包括下式的α氨基酸化合物:其中R1为氢,具有1至6个碳原子的直链或支链烷基,或者为未被取代的或者羟基或氨基取代的具有7至12个碳原子的直链或支链芳烷基,R2为氢或具有1至6个碳原子的直链或支链烷基,正如此处所用的,氨基酸可如上所示呈其酸的形式或可以如下式呈其两性离子的形式,其中R1和R2定义同上,氨基酸可以是l或d—对映体构型。典型的烷基R1包括,如甲基,羟甲基,异丙基,2—异丁基,1—异丁基,羟乙基和氨基丁基。典型的芳烷基R1包括,如甲苯基和羟基甲苯基。这里特别优选烷基R2包括甲基和乙基。本发明典型的抗菌活性增强剂包括α氨基酸,选自甘氨酸和丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酸赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的l或d—对映体及其烷基酯。这里最优选的抗菌活性增强剂为甘氨酸和l—丙氨酸。
孢子的壁的性质和厚度使其保护自身不受单分子氧和次氯酸的致死性作用。对于真菌孢子,α氨基酸诱使孢子萌发产生对氧化剂更敏感的营养体形式。此外,已发现本发明的灭菌活性增强剂还可增强氧化酶—卤代过氧化物酶杀死酵母营养体的能力,包括白色假丝酵母(Candida albicans)(见下面表1)。这一现象可能与酵母生长和出芽的α氨基酸依赖性加速以及这种代谢活性形式对卤代过氧化物酶杀菌作用具有增加的敏感性有关。一种可选择的可能性是α氨基酸或其代谢产物作为能产生H2O2的真菌氧化酶的底物。另一可选择的可能性是卤代过氧化物酶介导的α—氨基酸脱氨基-脱羧基作用的产物醛可诱导萌发和出芽或影响其它一些关键性过程。
因为本发明的卤代过氧化物酶组合物的灭菌活性涉及过氧化物和溴化物或氯化物形成次卤酸盐的反应,以及过氧化物和次卤酸盐形成单分子氧的反应,所以本发明的组合物的活性依赖于合适的过氧化物和卤化物在灭菌活性位点的存在。在一些情况下,如由于自然产生的菌群的活性,过氧化物(如过氧化氢)可存在于灭菌活性位点,并且有足够量的氯化物存在于生理环境中作为转化反应中的辅因子。在这些情况下,不必再使用另外的过氧化物或卤化物或在本发明的组合物中再包含另外的过氧化物或卤化物。在其它情况下,可能需要在进行微生物处理的地方再提供另外的过氧化氢和/或卤化物。因此,如果需要,本发明的组合物还可包含过氧化物或能在体内或体外产生过氧化物的试剂和卤化物。
用于本发明的方法和组合物的过氧化物包括过氧化氢,下式的烷基过氧化物:
R—OOH其中R是氢或具有1至3个碳原子的短链烷基,和无机过氧化物,如过氧化硼或过氧化脲。有机过氧化物的氧化剂活性通常随着R链的增长而减弱,如下所示:
R=H>>CH3>CH3CH2>CH3(CH2)2
用于本发明组合物的优选的过氧化物为过氧化氢。也可通过在组合物中包含能在体内或体外产生过氧化氢的试剂这一方式而在灭菌活性位点获得过氧化氢。用于此目的的特别有用的试剂包括如氧化酶,象胆固醇氧化酶,葡萄糖氧化酶和半乳糖氧化酶。
当过氧化氢直接包含于本发明组合物中用于体内时,优选用量设计为可获得最大灭菌活性的量。在产生高浓度H2O2期间通过避免与宿主细胞、组织和正常菌群的直接接触从而避免对宿主细胞、组织和正常菌群的损害。因此,当液体制剂中含有组合物时,本发明组合物每ml液体组合物中可含有约1nmol至约10μmol的过氧化氢,更为优选的是每ml液体组合物中含有约5nmol至约5μmol的过氧化氢,最为优选的是每ml液体组合物中含有约10nmol至约1μmol的过氧化氢。能在体内产生过氧化氢的试剂,如产生过氧化物的氧化酶,特别用于灭菌活性位点的过氧化氢用量的动态控制。这种试剂通过提供并保持稳定的、低浓度水平的H2O2使组合物的灭菌活性达到最大。因此,所要采用的这种试剂的量会高度依赖于试剂的性质和所期望的效果,但是根据灭菌活性位点可得到的卤化物的类型和浓度优选能产生稳定水平的量,即每ml液体每分钟约1pmol至约1μmol的过氧化氢。当制剂用来作消毒—灭菌溶液时,可调节氧化酶和其底物以能持续地为所需灭菌期提供相对高度稳定浓度的H2O2。消毒—灭菌过程以氧化酶底物的耗尽为终点、或与氧化酶降解的速率有关。
用于抗真菌目的时,特别优选使用如得自红粉诺卡氏菌(No-cardia erythropolis)的胆固醇氧化酶作为生成H2O2的氧化酶。与原核细菌不同,真菌合成甾醇。事实上,两性霉素B的抗真菌活性至少部分依赖于与真菌膜类固醇的结合,如麦角甾醇。麦角甾醇是多数真菌的主要甾醇成份,但其它甾醇也存在(Weete,1973,Phytochemistry 12:1843)。来自红粉诺卡氏菌的胆固醇氧化酶选择性氧化Δ5-3β—ols和5α—3β—ols产生酮(Smith and Brooks,1974,J.Chromatography 101:373);如,
胆固醇+O2→胆固醇氧化酶→胆甾烯酮+H2O2
麦角甾醇+O2→胆固醇氧化酶→麦角甾烯酮+H2O2
该诺卡氏属氧化酶是相对热稳定的,并在50℃保持催化活性。其在pH4至9具有活性,在pH7具有最大活性。其米氏常数(Km)为1.4×10-5mol/l(Richmond,1973,Clin Chem.19:1350)。
当卤代过氧化物酶与H2O2一起存在或与产生H2O2的氧化酶偶联时,具有杀真菌活性。然而,用胆固醇氧化酶作为氧化酶,氧化酶—卤代过氧化物酶的杀真菌能力高于仅产生H2O2的情况。这种依赖于胆固醇氧化酶的杀真菌作用的增强部分上可能与真菌胆固醇的氧化酶耗尽而导致的完整真菌膜的破坏有关。真菌可能还会合成一种内源性的产生H2O2的甾醇氧化酶。
用于本发明的方法和化合物的适宜的卤化物可以是溴化物或氯化物。用于特定用途的卤化物的使用、选择和用量依赖于各种因素,如用于灭菌组合物中的卤代过氧化物酶,所期望的治疗效果,过氧化物的获得及其它因素。当卤代过氧化物酶为髓过氧化物酶时,卤化物可以是溴化物或氯化物。因为氯化物以不阻碍其作为卤化物辅因子的足够量存在于多数生理环境中,所以通常不需外源的氯化物。当需要内源氯化物时,采用的氯化物的量优选范围为每ml溶液约10μmol的氯化物至约150μmol的氯化物,形成近似的生理条件。当卤代过氧化物酶为嗜曙红细胞过氧化物酶时,氯化物作为辅因子相对而言效果较差,因此,优选的卤化物为溴化物。当包含于液体组合物中时,本发明组合物在每ml液体组合物中可包含约1nmol溴化物至约20μmol溴化物,更为优选的是每ml液体组合物中含约10nmol溴化物至约10μmol溴化物,最为优选的是每ml液体组合物含约100nmol的溴化物至约1μmol溴化物。
在形成一种有效的杀微生物环境时,卤化物与过氧化物的比例是一个重要的考虑因素。因此,除了确保微生物侵袭位点的卤化物和过氧化物如上所述的有效水平之外,优选实施本发明方法时采用提供最佳杀微生物活性的卤化物:过氧化物的比例。例如,当卤代过氧化物酶为MPO和卤化物为Cl-时,优选Cl-与过氧化物的比例范围保持为在具有杀微生物活性的环境中约1至约40,000,更为优选的是约50至40,000,最为优选的是约200至40,000。当卤化物为Br-时,优选Br-与过氧化物的比例范围为在具有杀微生物活性的环境中约0.1至约4,000,更为优选的为约0.5至约2,000,最为优选的为约1至约1,000。
本发明的方法和组合物是用来抑制广谱的孢子微生物,优选对正常菌群具有最小程度的损害,这里所用的“孢子微生物”是指包括细菌或真菌的孢子体。形成孢子的微生物是公知的并且包括诸如芽孢杆菌属(Bacillus sps.)和梭状芽孢杆菌属(Clostridium sps.)这样的细菌以及诸如曲霉属(Aspergillus sps.)镰孢属(Fusariumsps.),发癣菌属(Trichophyton sps.)这样的真菌等。
这里所用的术语“正常菌群”是指以共生水平存在于健康宿主体内或表面的细菌。正常菌群包括,例如存在于人口腔、肠道或阴道的乳酸科细菌,如存在于口腔中的链球菌(Streptococcus)(viridans),存在于母乳哺育的婴儿的肠道中、外生殖器中、前尿道和阴道中的乳酸杆菌属(如Tissier’s杆菌和doderlein’s杆菌)。构成宿主正常菌群的微生物是众所周知的(如参见前述Principlesand Practice of Infectious diseases,New York,pp.34—36和161)。已发现本发明的卤代过氧化物酶选择性地与许多致病细菌和真菌结合,不与正常菌群结合。用于体内时,优选使用卤代过氧化物酶处理宿主,用量为不会从宿主中消灭正常菌群。用于体外消毒—灭菌时,可采用足够高浓度的卤代过氧化物酶,以确保完全杀死所有的营养体和酵母。这种情况下,通过在与宿主组织接触之前消耗H2O2或产生H2O2的体系,而避免对宿主组织和正常菌群的损害。
本发明的组合物通常含有一定量的卤代过氧化物酶和抗菌活性增强剂,其足以在过氧化物和卤化物存在时杀死酵母或孢子微生物或抑制其生长。组合物可方便地以液体载体形式提供。只要载体不会严重干扰卤代过氧化物的选择性结合能力或酶活性,通常可为此目的使用任何液体载体。可选择地,组合物可以溶于液体时具有活性的固体形式提供。
本发明的组合物还可含有过氧化物或能产生过氧化物的试剂,如氧化酶,正如前面详述的。氧化酶—过氧化物酶体系自身可构成二元制剂。二元制剂的一部分包括含有氧化酶、卤代过氧化物酶和抗菌活性增强剂如甘氨酸或l—丙氨酸的溶液。二元制剂的第二部分包括氧化酶的底物,如胆固醇氧化酶情况时的胆固醇或者分子氧O2。例如,底物可以固体片的形式提供。对物品如隐形眼镜进行消毒时,胆固醇片和要灭菌的物品一起置于灭菌室中。加入胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶和甘氨酸或l—丙氨酸溶液以开始灭菌。该组合物还可包含乙醇以便于胆固醇溶解和被氧化酶利用。只要有足够的胆固醇存在推进反应,该体系将形成持续的灭菌作用。
体内应用时,该抗菌组合物可以任意有效的药物上可接受的形式给药于温血动物,包括人和动物体,例如以表面、灌洗、口服或栓剂形式作为一种表面、颊或鼻腔、喷雾剂或以可有效地对微生物感染位点释放活性卤代过氧化物酶的任何其它形式。给药途径优选使抗菌组合物与感染微生物直接接触。
表面应用时,药物上可接受的载体可呈液体、膏、泡沫、洗液或凝胶形式,并且可附加含有有机溶剂,乳化剂,胶凝剂,湿润剂,稳定剂,表面活性剂,浸湿剂,防腐剂,时间释放剂和少量的湿润剂,螯合剂、染料,香料和其它常用于表皮给药的药物组合物中的成份。
口腔或表皮给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、栓剂、粉末和颗粒。呈固体剂型时,组合物可与至少一种隋性稀释剂混合,如蔗糖,乳糖或淀粉,并可附加含有润滑剂,缓冲剂,肠包衣和其它本技术领域熟知的成份。
在本发明另一实施方案中,本发明的组合物可特别设计用于体外,如对医疗器械、隐形眼镜等进行灭菌或消毒,尤其是该器械或隐形眼镜要用在与病人或配带者接触的情况下。对于这种形式的应用,组合物可以方便地以液体或泡沫形式提供,并可以与乳化剂、表面活性剂、缓冲剂、浸湿剂、防腐剂和其它常用于该类型组合物中的成份一起使用。本发明的组合物可浸渗入吸收材料中,如缝合线、绷带和纱布,或组合物可涂布在固相材料表面,如纤维,带和导管以将组合物施送于预防微生物感染的位点。这种类型的其它传送体系对本领域技术人员是显而易见的。
可改变本发明组合物中卤代过氧化物酶和抗菌活性增强剂的实际用量,以获得在治疗位点能有效杀死营养体及酵母和孢子微生物的卤代过氧化物酶和抗菌活性增强剂的用量。因此,所选择的量依赖于自然性质、治疗位点、所期望的反应、所期望的杀微生物作用的时间期限和其它因素。通常,当卤代过氧化物酶为髓过氧化物酶时,本发明的液体组合物每ml液体组合物含至少0.01皮摩尔(pmol)的髓过氧化物酶,更为优选的是每ml液体组合物含约0.1pmol至约500pmol的髓过氧化物酶,最为优选的是每ml液体组合物含约0.5pmol至约50pmol的髓过氧化物酶。可选择地,在某些应用中可期望在组合物中包括嗜曙红细胞过氧化物酶和髓过氧化物酶。本发明的液体组合物通常含有至少0.005μmol/ml的抗菌活性增强剂,即α—氨基酸,如甘氨酸和丙氨酸,更为优选地含0.05μmol/ml至50μmol/ml这样的抗菌活性增强剂。
若需要的话也可包含其它组分,如产生过氧化物的氧化酶,氧化酶的底物和卤化物,正如上面所详述的。另外,组分可配制成单一制剂,或需要特殊使用时可分成二元制剂用于以后混合。对于单一制剂,在施用位点可获得的一种所需体系组分,如卤化物、氧化酶、氧化酶的辅基,氧化酶的还原底物或单分子氧优先不考虑入制剂中,以预防超前反应及体系组分的耗尽。
作为一说明性实例,适用作隐形眼镜溶液的组合物含有1至20pmol/ml的嗜曙红细胞过氧化物酶和/或髓过氧化物酶,0.1至1μmol/ml的甘氨酸,0.01至10个单位的葡萄糖氧化酶,50至500mEq/L的氯化物和0.1至1mEq/L溴化物。上述组合物在厌氧条件下和1至10μmol/ml的葡萄糖结合,完整的制剂保存于厌氧条件下直至用作液体灭菌或消毒溶液时为止。暴露于空气即分子氧中就会激活制剂的消毒—灭菌活性。
结合下述典型实施例可更好地理解上述内容,实施例目的在于说明而不是限定发明。
实施例
实施例1
l—丙氨酸对氧化酶—卤代过氧化物酶杀死细菌、酵母和真菌孢子的影响效果
根据下述方法确定l—丙氨酸对氧化酶—卤代过氧化物酶杀死细菌、酵母和真菌孢子的影响效果。从含0.1单位(即4μg)来自红粉诺卡氏菌的胆固醇氧化酶(根据Richmond.W.,“Preparationand Properties of a Cholesterol Oxidase From Nocardia sp.andIts Application to the Enzymatic Assay of Total Cholesterol inSerum”,Clin.Chem.19(12):1350—1356(1973)的方法制备),20pmol(2.8μg)的猪MPO(ExOxEmis,Inc.,San Antonio,Tex-as,U.S.A.,Lot#1899201)或20pmol(1.5μg)猪EPO(ExOxEm-is,Inc.,San Antonio,Texas,U.S.A.,Lot#1929201),100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-的50mM的乙酸盐缓冲液制备温育培养基。用1×107细胞的金黄色葡萄球菌(Staph.aureus),白色假丝酵母(Cand.albicans)和烟曲霉(Asperg.fumigatus)接种于培养基上制得温育混合物。用50mM MOPS缓冲液调节温育混合物的pH为7。向该保温混合物中加入8.5%乙醇中的胆固醇至终浓度为7mM(7μmol/ml)。保温混合物的终体积为1ml。混合物于22℃保温4小时,然后将微生物铺平板(金黄色葡萄球菌铺平板于酪蛋白胰蛋白酶解物大豆琼脂;白色假丝酵母和烟曲霉铺平板于沙氏葡糖琼脂)。约24小时后(烟曲霉约72—96小时后),计数菌落形成单元(CFU),作为微生物活力的标准。结果见表1。
表1l—丙氨酸对胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶抗金黄色葡萄球菌、白色假丝酵母和烟曲霉孢子的杀微生物作用的影响效果
胆固醇 卤代过
微生物 氧化酶 氧化物酶 CFU
金黄色葡萄球菌 无 无 19,400,000
金黄色葡萄球菌 0.1单位 无 29,000,000
金黄色葡萄球菌 0.1单位 无 29,200,000
金黄色葡萄球菌 0.1单位 20pmol MPO 0
金黄色葡萄球菌 0.1单位 20pmol MPO 0
金黄色葡萄球菌 0.1单位 20pmol EPO 0
金黄色葡萄球菌 0.1单位 20pmol EPO 0
白色假丝酵母 无 无 1,460,000
白色假丝酵母 0.1单位 无 1,380,000
白色假丝酵母 0.1单位 无 1,580,000
白色假丝酵母 0.1单位 20pmol MPO 800,000
白色假丝酵母 0.1单位 20pmol MPO 0
白色假丝酵母 0.1单位 20pmol EPO 680,000
白色假丝酵母 0.1单位 20pmol EPO 0
烟曲霉 无 无 1,260,000
烟曲霉 0.1单位 无 1,020,000
烟曲霉 0.1单位 无 880,000
烟曲霉 0.1单位 20pmol MPO 550,000
烟曲霉 0.1单位 20pmol MPO 0
烟曲霉 0.1单位 20pmol EPO 840,000
烟曲霉 0.1单位 20pmol EPO 0 表示50mM乙酸盐缓冲液含1mM l—丙氨酸
正如表1所示,胆固醇氧化酶加上MPO或EPO可提供一有效的杀微生物体系。该结合物在1mMl—丙氨酸存在或不存在时杀死107金黄色葡萄球菌。然而,在胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶体系中含有L—丙氨酸对彻底杀灭白色假丝酵母的酵母和烟曲霉的孢子来说是必要的。
实施例2
潜在的氨基酸抗菌活性增强剂对卤代过氧化物酶抗烟曲霉孢子的杀微生物作用的影响效果
各种潜在的氨基酸用作卤代过氧化物酶杀微生物作用的增强剂的效果由实施例1所述方法来确定,不同的是,每次实验含有下表2—8中所示的一定量的葡萄糖氧化酶(代替实施例1中的胆固醇氧化酶),在pH6下在50mM乙酸钠缓冲液中的5.6mM葡萄糖的温育培养基中含100mEq/L的氯化物和0.1mEq/L的溴化物。下表2—8中所示的潜在的氨基酸活化剂被加入到混合物中至终浓度为0,5,0.5或0.05μmol/ml,保温混合物用约1×107个烟曲霉孢子接种。混合物在室温下保温90分钟,然后根据实施例1所述铺平板。平板在35℃下过夜生长,再生长2天。计数菌落形成单元,作为对微生物活力的测定。
如上所述测试脂族氨基酸甘氨酸、l—丙氨酸、l—缬氨酸、l—亮氨酸和l—异亮氨酸。结果示于下表2。
表2 氨基酸种类和浓度:对卤代过氧化物酶杀死烟曲霉孢子的影响效果 卤代过氧 葡萄糖 (氨基酸) CFU(脂肪族氨基酸) 化物酶 氧化酶 μmol/ml(mM) 甘氨酸 l—丙氨酸 l—缬氨酸 l—亮氨酸 l—异亮氨酸
0 0 0 920,000 800,000 260,000 920,000 260,000
0 0 5 560,000 520,000 380,000 740,000 340,000
0 0 0.5 700,000 660,000 460,000 960,000 400,000
0 0 0.05 480,000 520,000 180,000 460,000 460,000
0 0.6单位 0 760,000 1,140,000 420,000 740,000 420,000
0 0.6单位 5 440,000 980,000 440,000 1,000,000 340,000
0 0.6单位 0.5 300,000 780,000 300,000 920,000 400,000
0 0.6单位 0.05 580,000 760,000 340,000 700,000 520,00020pmol MPO 0.6单位 0 500,000 700,000 300,000 1,640,000 300,00020pmol MPO 0.6单位 5 0 0 34,000 72,000 22,00020pmol MPO 0.6单位 0.5 0 0 2,000 42,000 020pmol MPO 0.6单位 0.05 260,000 4,000 16,000 62,000 10,00020pmol EPO 0.6单位 0 780,000 840,000 200,000 1,060,000 200,00020pmol EPO 0.6单位 5 0 0 0 52,000 020pmol EPO 0.6单位 0.5 0 0 0 0 020pmol EPO 0.6单位 0.05 182,000 10,000 28,000 0 30,000
正如表2所示,所测试的每一个脂族氨基酸都对嗜曙红细胞过氧化物酶和髓过氧化物酶作用于烟曲霉孢子的卤代过氧化物酶抗菌活性呈现出显著的增强效果。而甘氨酸和l—丙氨酸的增强效果最大。
用上述方法测试二羧基氨基酸和酰胺即l—天冬氨酸,l—天冬酰胺,l—谷氨酸和l—谷氨酰胺以及亚氨基酸l—脯氨酸和l—羟脯氨酸。结果示于表3。
表3 氨基酸种类和浓度:对卤代过氧化物酶杀死烟曲霉孢子的影响效果卤代过氧 葡萄糖 (氨基酸) CFU(二羧基氨基酸和酰胺) CFU(亚氨基酸) 化物酶 氧化酶 μmol/ml(mM) l—天冬氨酸 l—天冬酰胺 l—谷氨酸 l-谷氨酰胺 l—脯氨酸 l—羟脯氨酸
0 0 0 520,000 520,000 920,000 920,000 260,000 860,000
0 0 5 540,000 540,000 260,000 420,000 420,000 640,000
0 0 0.5 460,000 180,000 320,000 660,000 300,000 800,000
0 0 0.05 200,000 240,000 580,000 300,000 480,000 740,000
0 0.6单位 0 340,000 340,000 740,000 740,000 420,000 740,000
0 0.6单位 5 420,000 340,000 280,000 400,000 240,000 540,000
0 0.6单位 0.5 360,000 460,000 340,000 360,000 360,000 460,000
0 0.6单位 0.05 380,000 160,000 640,000 560,000 200,000 720,00020pmol MP0 0.6单位 0 700,000 700,000 1,640,000 1,640,000 300,000 940,00020pmol MPO 0.6单位 5 640,000 660,000 840,000 1,080,000 540,000 1,000,00020pmol MPO 0.6单位 0.5 960,000 340,000 820,000 1,000,000 380,000 900,00020pmol MPO 0.6单位 0.05 800,000 680,000 820,000 750,000 280,000 680,00020pmol EPO 0.6单位 0 920,000 920,000 1,060,000 1,060,000 200,000 860,00020pmol EPO 0.6单位 5 920,000 1,340,000 1,100,000 820,000 280,000 840,00020pmol EPO 0.6单位 0.5 1,460,000 440,000 540,000 660,000 460,000 1,260,00020pmol EPO 0.6单位 0.05 620,000 1,260,000 900,000 400,000 380,000 680,000
正如表3所示,所测试的二羧基氨基酸或亚氨基酸在任一测试浓度都没有显示出对卤代过氧化物酶抗菌活性的显著增强效果。
根据上述方法测试羟基氨基酸l—丝氨酸和l—苏氨酸及碱性氨基酸l—赖氨酸,l—组氨酸和l—精氨酸。结果示于下表4:
表4 氨基酸种类和浓度:对卤代过氧化物酶杀死烟曲霉孢子的影响效果卤代过氧 葡萄糖 (氨基酸) CFU(羟基氨基酸) CFU(碱性氨基酸) 化物酶 氧化酶 μmol/ml(mM) l—丝氨酸 l—苏氨酸 l—赖氨酸 l—组氨酸 l—精氨酸
0 0 0 800,000 760,000 520,000 760,000 800,000
0 0 5 820,000 520,000 520,000 440,000 780,000
0 0 0.5 540,000 800,000 460,000 840,000 740,000
0 0 0.05 580,000 660,000 460,000 840,000 620,000
0 0.6单位 0 1,140,000 400,000 340,000 400,000 1,140,000
0 0.6单位 5 480,000 800,000 240,000 520,000 580,000
0 0.6单位 0.5 620,000 360,000 480,000 740,000 960,000
0 0.6单位 0.05 640,000 560,000 520,000 560,000 1,020,00020pmol MPO 0.6单位 0 700,000 500,000 700,000 500,000 700,00020pmol MPO 0.6单位 5 700,000 400,000 380,000 720,000 960,00020pmol MPO 0.6单位 0.5 660,000 0 0 640,000 740,00020pmol MPO 0.6单位 0.05 560,000 12,000 0 520,000 840,00020pmol EPO 0.6单位 0 840,000 780,000 920,000 780,000 840,00020pmol EPO 0.6单位 5 0 1,000,000 560,000 740,000 960,00020pmol EPO 0.6单位 0.5 34,000 0 620,000 600,000 700,00020pmol EPO 0.6单位 0.05 860,000 40,000 920,000 102,000 900,000
正如表4所示,羟基氨基酸l—丝氨酸和l—苏氨酸均显著增强嗜曙红细胞过氧化物酶杀死烟曲霉孢子的作用,而l—苏氨酸和碱性氨基酸l—赖氨酸在增强髓过氧化物酶抗菌活性中有效果。碱性氨基酸l—组氨酸和l—精氨酸未显示出明显的抗菌效果。组氨酸易与单分子氧反应,因此,其可能产生对卤代过氧化物酶作用的有效的竟争性抑制,掩盖组氨酸刺激孢子萌发的能力。
如上方法测试含硫氨基酸l—半胱氨酸和l—蛋氨酸,以及芳族氨基酸l—苯丙氨酸,l—酪氨酸和l—色氨酸。结果示于下表5:
表5 氨基酸种类和浓度:对卤代过氧化物酶杀死烟曲霉孢子的影响效果卤代过氧 葡萄糖 (氨基酸) CFU(含硫氨基酸) CFU(芳香族氨基酸) 化物酶 氧化酶 μmol/ml(mM) l—半胱氨酸 l—蛋氨酸 l-苯丙氨酸 l—酪氨酸 l—色氮酸
0 0 0 380,000 380,000 260,000 760,000 380,000
0 0 5 540,000 560,000 360,000 580,000 800,000
0 0 0.5 500,000 540,000 340,000 800,000 640,000
0 0 0.05 380,000 320,000 380,000 560,000 700,000
0 0.6单位 0 460,000 460,000 420,000 400,000 460,000
0 0.6单位 5 580,000 660,000 400,000 840,000 920,000
0 0.6单位 0.5 420,000 480,000 460,000 700,000 580,000
0 0.6单位 0.05 360,000 460,000 440,000 560,000 280,00020pmol MPO 0.6单位 0 580,000 580,000 300,000 500,000 580,00020pmol MPO 0.6单位 5 580,000 400,000 8,000 640,000 700,00020pmolMPO 0.6单位 0.5 540,000 480,000 4,000 460,000 580,00020pmol MPO 0.6单位 0.05 720,000 560,000 2,000 20,000 1,040,00020pmol EPO 0.6单位 0 480,000 480,000 200,000 780,000 480,00020pmol EPO 0.6单位 5 680,000 580,000 0 640,000 860,00020pmol EPO 0.6单位 0.5 800,000 560,000 0 920,000 740,00020pmol EPO 0.6单位 0.05 240,000 600,000 0 0 580,000
正如表5所示,含硫氨基酸对增强嗜曙红细胞过氧化物酶或髓过氧化物酶的抗菌活性没有效果。芳香族氨基酸l—苯丙氨酸和l—酪氨酸均可显著增强嗜曙红细胞过氧化物酶和髓过氧化物酶杀死烟曲霉的效果,而l—色氨酸未表现出显著效果。这些含硫和芳香族氨基酸也相对地可与单分子氧反应,并可竞争性抑制卤代过氧化物酶作用,其掩盖氨基酸刺激孢子萌发的能力。这就是为什么l—苯丙氨酸和l—酪氨酸在低浓度下测试时最有效的可能原因。
根据上述方法,测试丙氨酸的对映体、异构体及丙氨酸的衍生物。结果示于下表6。
表6 氨基酸种类和浓度:对卤代过氧化物酶杀死烟曲霉孢子的影响效果卤代过氧 葡萄糖 (氨基酸) CFU(丙氨酸异构体和衍生物) 化物酶 氧化酶 μmol/ml(mM) l—丙氨酸 d—丙氨酸 β—丙氨酸 l—丙氨酸甲基酯 l—丙氮酸—
l—丙氨酸
0 0 0 800,000 740,000 740,000 740,000 740,000
0 0 5 520,000 720,000 580,000 500,000 660,000
0 0 0.5 660,000 760,000 920,000 540,000 640,000
0 0 0.05 520,000 760,000 740,000 540,000 620,000
0 0.6单位 0 1,140,000 760,000 760,000 760,000 760,000
0 0.6单位 5 980,000 660,000 900,000 860,000 780,000
0 0.6单位 0.5 780,000 700,000 620,000 740,000 680,000
0 0.6单位 0.05 760,000 600,000 860,000 1,200,000 360,00020pmol MPO 0.6单位 0 700,000 820,000 820,000 820,000 820,00020pmol MPO 0.6单位 5 0 14,000 760,000 0 660,00020pmol MPO 0.6单位 0.5 0 0 900,000 0 500,00020pmol MPO 0.6单位 0.05 4,000 10,000 1,116,000 440,000 480,00020pmol EPO 0.6单位 0 840,000 1,020,000 1,020,000 1,020,000 1,020,00020pmol EPO 0.6单位 5 0 0 940,000 0 660,00020pmol EPO 0.6单位 0.5 0 0 880,000 0 1,360,00020pmol EPO 0.6单位 0.05 10,000 10,000 720,000 580,000 680,000
正如表6所示,丙氨酸的l和d对映体均可显著增强髓过氧化物酶和嗜曙红细胞过氧化物酶杀死烟曲霉的作用,而β—丙氨酸没表现出显著的增强效果。类似地,l—丙氨酸的甲基酯可显著增强灭菌活性。l—丙氨酸—l—丙氨酸二肽没表现出显著增强的活性。
如上述方法测试苏氨酸对映体的效果。结果示于下表7:
表7
氨基酸种类和浓度:对卤代过氧化物酶杀死烟曲霉
孢子的影响效果
CFU(羟基氨基酸卤代过氧 葡萄糖 (氨基酸) 的对映体)化物酶 氧化酶 μmol/ml(mM) l—苏氨酸 d—苏氨酸
0 0 0 760,000 800,000
0 0 5 520,000 820,000
0 0 0.5 800,000 760,000
0 0 0.05 660,000 680,000
0 0.6单位 0 400,000 1,140,000
0 0.6单位 5 800,000 460,000
0 0.6单位 0.5 360,000 720,000
0 0.6单位 0.05 560,000 720,00020pmol MPO 0.6单位 0 500,000 700,00020pmol MPO 0.6单位 5 400,000 420,00020pmol MPO 0.6单位 0.5 0 020pmol MPO 0.6单位 0.05 12,000 280,00020pmol EPO 0.6单位 0 780,000 840,00020pmol EPO 0.6单位 5 1,000,000 020pmol EPO 0.6单位 0.5 0 020pmol EPO 0.6单位 0.05 40,000 520,000
如表7所示,苏氨酸的l和d对映体均可显著增强髓过氧化物酶和嗜曙红细胞过氧化物酶杀死烟曲霉的活性。
如上述方法测试增强氨基酸的α—酮酸形式的效果,使用l—丙氨酸和丙酮酸及甘氨酸和二羟乙酸。结果示于下表8:
表8
氨基酸种类和浓度:对卤代过氧化物酶杀死烟曲霉孢子的影响效果 卤代过氧 葡萄糖 (氨基酸) CFU(氨基酸与α—酮酸的对比) 化物酶 氧化酶 μmol/ml(mM) l—丙氨酸 丙酮酸 甘氮酸 二羟乙酸
0 0 0 800,000 860,000 860,000 860,000
0 0 5 520,000 880,000 720,000 600,000
0 0 0.5 660,000 700,000 480,000 700,000
0 0 0.05 520,000 660,000 640,000 560,000
0 0.6单位 0 1,140,000 740,000 740,000 740,000
0 0.6单位 5 980,000 760,000 520,000 560,000
0 0.6单位 0.5 780,000 600,000 760,000 600,000
0 0.6单位 0.05 760,000 480,000 800,000 660,00020pmol MPO 0.6单位 0 700,000 940,000 940,000 940,00020pmol MPO 0.6单位 5 0 820,000 0 1,060,00020pmol MPO 0.6单位 0.5 0 880,000 0 860,00020pmol MPO 0.6单位 0.05 4,000 580,000 90,000 580,00020pmol EPO 0.6单位 0 840,000 860,000 860,000 860,00020pmol EPO 0.6单位 5 0 640,000 0 740,00020pmol EPO 0.6单位 0.5 0 560,000 0 720,00020pmol EPO 0.6单位 0.05 10,000 780,000 460,000 740,000
如表8所示,丙酮酸和二羟乙酸均未表现出l—丙氨酸和甘氨酸的活性增强效果。
实施例3
抗菌活性增强剂对其它抗真菌体系的影响效果
为测定l—丙氨酸对常用抗真菌化合物制霉菌素和两性霉素B的灭菌效果的影响,按实施例2的步骤进行实验,用制霉菌素或两性霉素B代替实施例2中的卤代过氧化物酶—葡萄糖氧化酶,使用0(对照)或10μmol/ml的l—丙氨酸,以串珠镰孢(Fusariummoniliforme)作为微生物。结果示于下表9:
表9
l—丙氨酸对制霉菌素和两性毒素B的抗真菌活性的影响效果抗真菌剂与终浓度 l—丙氨酸 CFU(串珠镰孢
ATCC 38159)
无 无 940,000制霉菌素,400μg/ml 无 120,000制霉菌素,40μg/ml 无 340,000制霉菌素,4μg/ml 无 500,000
无 10 1,020,000制霉菌素,400μg/ml 10 28,000制霉菌素,40μg/ml 10 124,000制霉菌素,4μg/ml 10 220,000
无 无 880,000两性霉素B,250μg/ml 无 320,000两性霉素B,25μg/ml 无 500,000两性霉素B,2.5μg/ml 无 880,000
无 10 840,000两性霉素B,250μg/ml 10 340,000两性霉素B,25μg/ml 10 460,000两性霉素B,25μg/ml 10 800,000
从表9可见,l—丙氨酸的加入可使制霉菌素依赖型的杀死串珠镰孢的效果加倍,且对两性霉素B依赖型的杀死串珠镰孢的情况没有效果。
使用灭菌化合物过氧化氢(H2O2)和次氯酸钠(NaClO)以及烟曲霉和串珠镰孢的孢子来重复前面的步骤。结果列于下表10:
表10
1—丙氨酸对过氧化氢和次氯酸钠抗真菌活性的影响效果
CFU CFU抗真菌剂与终浓度 1—丙氨酸 (烟曲霉 (串珠镰孢
μmol/测试 ATCC 10894) ATCC 38159)
无 无 360,000 460,000 H2O2,3mg/ml 无 580,000 0 H2O2,0.3mg/ml 无 400,000 140,000 H2O2,0.03mg/ml 无 440,000 400,000 H2O2,0.003mg/ml 无 640,000 500,000
无 10 700,000 580,000 H2O2,3mg/ml 10 720,000 0 H2O2,0.3mg/ml 10 280,000 340,000 H2O2,0.03mg/ml 10 660,000 300,000 H2O2,0.003mg/ml 10 500,000 310,000
无 无 300,000 284,000 NaClO,1mg/ml 无 10,000 50,000 NaClO,0.1mg/ml 无 26,000 298,000 NaClO 0.01mg/ml 无 560,000 290,000 NaClO,0.001mg/ml 无 640,000 294,000
无 10 700,000 380,000 NaClO,1mg/ml 10 26,000 292,000 NaClO,0.1mg/ml 10 54,000 404,000 NaClO,0.01mg/ml 10 580,000 404,000 NaClO,0.001mg/ml 10 280,000 304,000
和两性霉素B的情况一样,与l—丙氨酸结合使用时,过氧化氢或次氯酸盐的效果并未显著增强。事实上,l—丙氨酸显示出抑制过氧化物特别是次氯酸盐杀死真菌的活性。这种情况下l—丙氨酸可能充当一种竞争性抑制剂。
实施例4
l—丙氨酸对卤代过氧化物酶杀死其它微生物的影响效果
根据实施例2的步骤,每次使用0(对照)或10μmol/ml的l—丙氨酸和2,10或50pmol的髓过氧化物酶或嗜曙红细胞过氧化物酶作用于这些微生物,测定l—丙氨酸对卤代过氧化物酶作用于串珠镰孢、深红色发癣菌(Tricophyton rubrum)和新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)灭菌活性的影响效果。结果示于下表11(串珠镰孢,ATCC#38159),表12(深红色发癣菌,ATCC#28188,18753和18758)和表13(新型隐球酵母,ATCC#14115):
表11
卤代过氧化物酶杀死串珠镰孢
l—丙氨酸 串珠镰孢卤代过氧化物酶 葡萄糖氧化酶 μmol/测试 ATCC#38159
无 无 10 1,720,000
无 0.6单位 无 1,380,000
无 0.6单位 10 1,760,000 50pmol MPO 无 10 1,640,000 50pmol MPO 0.6单位 无 0 10pmol MPO 0.6单位 无 0 50pmol MPO 0.6单位 10 0 10pmol MPO 0.6单位 10 8,000 50pmol EPO 无 10 8,000 50pmol EPO 0.6单位 无 0 10pmol EPO 0.6单位 无 0 2pmol EPO 0.6单位 无 O 50pmol EPO 0.6单位 10 0 10pmol EPO 0.6单位 10 0 2pmol EPO 0.6单位 10 0
表12
卤代过氧化物酶杀死发癣菌卤代过氧 1—丙氨酸 深红色发癣菌 深红色发癣菌 深红色发癣菌化物酶 葡萄糖氧化酶 μmol/测试 ATCC#28188 ATCC#18753 ATCC#18758 无 无 10 1,700,000 200,000 1,440,000 无 0.6单位 10 1,580,000 276,000 128,00050pmol MPO 无 10 2,680,000 192,000 720,00050pmol MPO 0.6单位 无 1,240,000 132,000 414,00050pmol MPO 0.6单位 10 84,000 18,000 010pmol MPO 0.6单位 10 184,000 62,000 0 2pmol MPO 0.6单位 10 1,380,000 310,000 4,00050pmol EPO 无 10 3,600,000 332,000 1,800,00053pmol EPO 0.6单位 无 1,180,000 22,000 244,00050pmol EPO 0.6单位 10 0 0 010pmol EPO 0.6单位 10 0 0 0 2pmol EPO 0.6单位 10 0 0 0
表13
卤代过氧化物酶杀死新型隐球酵母
l—丙氨酸 CFU(新型隐球酵母)卤代过氧化物酶葡 萄糖氧化酶 μmol/测试 ATCC#14115)
无 无 10 960,000
无 0.6单位 无 680,000
无 0.6单位 10 480,00050pmol MPO 无 10 480,00050pmol MPO 0.6单位 无 480,00050pmol MPO 0.6单位 10 440,00010pmol MPO 0.6单位 10 860,0002pmol MPO 0.6单位 10 220,00050pmol EPO 无 10 660,00050pmol EPO 0.6单位 无 460,00050pmol EPO 0.6单位 10 010pmol EPO 0.6单位 10 0 2pmol EPO 0.6单位 10 640,000
如表11所示,存在或不存在l—丙氨酸时,髓过氧化物酶和嗜曙红细胞过氧化物酶均能高效地杀死串珠镰孢。事实上,已发现EPO在没有葡萄糖氧化酶时是有效的。如表12所示,在l—丙氨酸存在时用嗜曙红细胞过氧化物酶可彻底杀死发癣菌,而用髓过氧化物酶杀菌可获得显著的增强效果。
如表13所示,l—丙氨酸也可显著增强嗜曙红细胞过氧化物酶杀死新型隐球酵母的效果,而对髓过氧化物酶的活性有一些增强效果。
实施例5
胆固醇氧化酶浓度对氧化酶—卤代过氧化物酶抗白色假丝酵母的灭菌作用的影响效果
根据实施例1的方法步骤测定胆固醇氧化酶浓度对氧化酶—卤代过氧化物酶抗白色假丝酵母的灭菌作用的影响效果,不同的是,每次试验含有所示出的来自红粉诺卡氏菌(0.1单位=4μg)不同量的胆固醇氧化酶,50mM乙酸盐缓冲液中的10pmol(1.4μg)的猪MPO(ExOxEmis,Inc.,San Antonio,Texas,U.S.A.,Lot#1899201)或10pmol(0.7μg)猪EPO(ExOxEmis,Inc.,San Anto-nio,Texas,U.S.A.,Lot#1929201),缓冲液中含100mEq/LCl-,1mEq/L Br-和1mM l—丙氨酸。以50mM MOPS作为缓冲液,pH为6.7。最终悬浮液含8.5%乙醇中的7mM(7μmol/ml)胆固醇。终体积为1ml。37℃保温2小时后,微生物在沙氏葡糖琼脂上铺平板。计数菌落形成单元(CFU),结果示于表14。
表14胆固醇氧化酶的浓度对氧化酶—卤代过氧化物酶的抗白色假丝酵母的杀微生物作用的影响效果
胆固醇 卤代过氧
微生物 氧化酶 化物酶 CFU
白色假丝酵母 无 无 400,000
白色假丝酵母 0.1 单位 无 480,000
白色假丝酵母 0.1 单位 10pmol MPO 420,000
白色假丝酵母 0.1 单位 10pmol MPO 0
白色假丝酵母 0.05 单位 10pmol MPO 0
白色假丝酵母 0.025单位 10pmol MPO 0
白色假丝酵母 0.013单位 10pmol MPO 76,000
白色假丝酵母 无 10pmol MPO 560,000
白色假丝酵母 0.1 单位 10pmol EPO 400,000
白色假丝酵母 0.1 单位 10pmol EPO 0
白色假丝酵母 0.05 单位 10pmol EPO 0
白色假丝酵母 0.025 单位 10pmol EPO 200
白色假丝酵母 0.013 单位 10pmol EPO 180,000
白色假丝酵母 无 10pmol EPO 360,000表示50mM乙酸盐缓冲液不含l—丙氨酸
如表14所示,使用0.025单位的胆固醇氧化酶加上10pmolMPO和1mM l—丙氨酸能完全杀死白色假丝酵母。当l—丙氨酸不存在时,观察到不能用0.1单位的胆固醇氧化酶和10pmol MPO杀死酵母。当用卤代过氧化物酶替代EPO时,可得到类似的结果。
实施例6
胆固醇氧化酶浓度对氧化酶—卤代过氧化物酶抗细菌的杀微生物作用的影响效果
使用大肠杆菌代替实施例5中的白色假丝酵母,根据实施例5的步骤进行试验。每次试验含有所示量的来自红粉诺卡氏菌(0.1单位=4μg)的胆固醇氧化酶,10pmol(1.4μg)的猪MPO(ExOx-Emis,Inc.,San Antonio,Texas,U.S.A.,Lot#1899201)或10pmol(0.7μg)猪EPO(ExOxEmis,Inc.,San Antonio,Texas,U.S.A.,Lot#1929201)的50mM乙酸盐缓冲液,缓冲液中含100mEq/L Cl-,1mEq/L Br-和1mMl—丙氨酸。以50mM MOPS作缓冲液,pH为6.7。终悬浮液含7mM(7μmol/ml)胆固醇的8.5%乙醇溶液。终体积为1ml。37℃保温2小时后,微生物在酪蛋白胰蛋白酶解物大豆琼脂上铺平板。计数菌落形成单元(CFU),结果示于下表15。
表15胆固醇氧化酶的浓度对氧化酶—卤代过氧化物酶抗大肠杆菌杀微生物作用的影响效果
胆固醇 卤代过氧
微生物 氧化酶 化物酶 CFU
大肠杆菌 无 无 13,500,000
大肠杆菌 0.1 单位 无 2,300,000
大肠杆菌 0.1 单位 10pmol MPO 0
大肠杆菌 0.1 单位 10pmol MPO 0
大肠杆菌 0.05 单位 10pmol MPO 0
大肠杆菌 0.025单位 10pmol MPO 0
大肠杆菌 0.013单位 10pmol MPO
大肠杆菌 无 10pmol MPO 14,000,000
大肠杆菌 0.1 单位 10pmol EPO 0
大肠杆菌 0.1 单位 10pmol EPO 0
大肠杆菌 0.05 单位 10pmol EPO 0
大肠杆菌 0.025单位 10pmol EPO 0
大肠杆菌 0.013单位 10pmol EPO 0
大肠杆菌 无 10pmol EPO 8,200,000表示50mM乙酸盐缓冲液中不含l—丙氨酸
正如表15所示,在1mM l—丙氨酸不存在或存在时所有测试的胆固醇氧化酶浓度(0.0125至0.1单位)均可观察到MPO和EPO将大肠杆菌完全杀死。对金黄色葡萄球菌观察到类似结果(数据未示出)。
实施例7
使用胆碱氧化酶进行氧化酶—卤代过氧化物酶杀死细菌、酵母和真菌孢子
采用实施例1的步骤,所不同的是采用0.2单位的胆碱氧化酶作为产生H2O2的氧化酶。如所示,反应含有0.2单位(即20μg)的来自产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)的胆碱氧化酶,20pmol(2.8μg)猪MPO(ExOxEmis,Inc.,San Antonio,Texas,U.S.A.,Lot#1899201)或20pmol(1.5μg)猪EPO(ExOxEmis,Inc.,San Anto-nio,Texas,U.S.A.,Lot#1929201)的50mM乙酸盐缓冲液,缓冲液中含100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-。以50mM MOPS作为缓冲液,pH为7。胆碱终浓度为150mM(150μmol/ml)。终体积为1ml。22℃保温4小时后,对微生物铺平板(金黄色葡萄球菌铺于酪蛋白胰蛋白酶解物大豆琼脂;白色假丝酵母和烟曲霉铺平板于沙氏葡糖琼脂)。计数菌落形成单元(CFU),结果示于表16。
表16l—丙氨酸对胆碱氧化酶—卤代过氧化物酶杀死金黄色葡萄球菌、白色假丝酵母和烟曲霉孢子的影响效果
胆碱氧 卤代过氧
微生物 化酶 化物酶 CFU
金黄色葡萄球菌 无 无 19,400,000
金黄色葡萄球菌 0.2单位 无 13,800,000
金黄色葡萄球菌 0.2单位 无 15,400,000
金黄色葡萄球菌 0.2单位 20pmol MPO 0
金黄色葡萄球菌 0.2单位 20pmol MPO 0
金黄色葡萄球菌 0.2单位 20pmol EPO 0
金黄色葡萄球菌 0.2单位 20pmol EPO 0
白色假丝酵母 无 无 1,460,000
白色假丝酵母 0.2单位 无 1,200,000
白色假丝酵母 0.2单位 无 1,180,000
白色假丝酵母 0.2单位 20pmol MPO 1,120,000
白色假丝酵母 0.2单位 20pmol MPO 0
白色假丝酵母 0.2单位 20pmol EPO 640,000
白色假丝酵母 0.2单位 20pmol EPO 0
烟曲霉 无 无 1,260,000
烟曲霉 0.2单位 无 1,260,000
烟曲霉 0.2单位 无 1,300,000
烟曲霉 0.2单位 20pmol MPO 800,000
烟曲霉 0.2单位 20pmol MPO 0
烟曲霉 0.2单位 20pmol EPO 740,000
烟曲霉 0.2单位 20pmol EPO 0表示50mM乙酸盐缓冲液含1mMl-丙氨酸
实施例8
使用乳酸氧化酶进行氧化酶—卤代过氧化物酶杀死细菌、酵母和真菌孢子
除了采用0.2单位的乳酸氧化酶作为产生H2O2的氧化酶外,按实施例7的方法步骤进行试验。如所示,反应含有0.2单位(即5μg)的来自片球菌属(Pediococcus sp.)的乳酸氧化酶,20pmol(2.8μg)猪MPO(ExOxEmis,Inc.,San Antonio,Texas,U.S.A.,Lot#1899201)或20pmol(1.5μg)猪EPO(ExOxEmis,Inc.,SanAntonio,Texas,U.S.A.,Lot#1929201)的50mM乙酸盐缓冲液,缓冲液含100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-。以50mM MOPS作为缓冲液,pH为7。乳酸终浓度为150mM(150μmol/ml)。终体积为1ml。保温4小时(22℃)后,对微生物铺平板。金黄色葡萄球菌铺于酪蛋白胰蛋白酶解物大豆琼脂,白色假丝酵母和烟曲霉铺于沙氏葡糖琼脂。计数菌落形成单元(CFU),结果示于表17。
表17l—丙氨酸对乳酸氧化酶—卤代过氧化物酶杀死金黄色葡萄球菌、白色假丝酵母和烟曲霉孢子的影响效果
乳酸氧 卤代过氧
微生物 化酶 化物酶 CFU
金黄色葡萄球菌 无 无 19,400,000
金黄色葡萄球菌 0.2单位 无 23,400,000
金黄色葡萄球菌 0.2单位 无 24,400,000
金黄色葡萄球菌 0.2单位 20pmol MPO 0
金黄色葡萄球菌 0.2单位 20pmol MPO 0
金黄色葡萄球菌 0.2单位 20pmol EPO 0
金黄色葡萄球菌 0.2单位 20pmol EPO 0
白色假丝酵母 无 无 1,460,000
白色假丝酵母 0.2单位 无 1,480,000
白色假丝酵母 0.2单位 无 1,020,000
白色假丝酵母 0.2单位 20pmol MPO 1,380,000
白色假丝酵母 0.2单位 20pmol MPO 1,500,000
白色假丝酵母 0.2单位 20pmol EPO 1,400,000
白色假丝酵母 0.2单位 20pmol EPO 1,180,000
烟曲霉 无 无 1,260,000
烟曲霉 0.2单位 无 860,000
烟曲霉 0.2单位 无 760,000
烟曲霉 0.2单位 20pmol MPO 740,000
烟曲霉 0.2单位 20pmol MPO 400,000
烟曲霉 0.2单位 20pmol EPO 760,000
烟曲霉 0.2单位 20pmol EPO 18,000表示50mM乙酸盐缓冲液中含1mM l—丙氨酸
实施例9
使用乙醇氧化酶进行氧化酶—卤代
过氧化物酶杀死细菌、酵母和真菌孢子
除了将0.2单位的乙醇氧化酶用作产生H2O2的氧化酶外,根据实施例7的方法步骤进行试验。根据所示,反应含有0.2单位(即21μg)的来自博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)的乙醇氧化酶,20pmol(2.8μg)猪MPO(ExOxEmis,Inc.,San Antonio,Texas,U.S.A.,Lot#1899201)或20pmol(1.5μg)猪EPO(ExOxEmis,Inc.,San Antonio,Texas,U.S.A.,Lot#1929201)的50mM乙酸盐缓冲液,缓冲液含100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-。以50mMMOPS作为缓冲液,pH为7。乙醇的终浓度为150mM(150μmol/ml)。终体积为1ml。22℃保温4小时后,将微生物铺平板。金黄色葡萄球菌铺于酪蛋白胰蛋白酶解物大豆琼脂,白色假丝酵母和烟曲霉铺于沙氏葡糖琼脂。计数菌落形成单元(CFU),结果示于表18。
表18l—丙氨酸对乙醇氧化酶—卤代过氧化物酶杀死金黄色葡萄球菌、白色假丝酵母和烟曲霉孢子的影响效果
乙醇氧 卤代过氧
微生物 化酶 化物酶 CFU
金黄色葡萄球菌 无 无 19,400,000
金黄色葡萄球菌 0.2单位 无 21,200,000
金黄色葡萄球菌 0.2单位 无 19,400,000
金黄色葡萄球菌 0.2单位 20pmol MPO 840,000
金黄色葡萄球菌 0.2单位 20pmol MPO 760,000
金黄色葡萄球菌 0.2单位 20pmol EPO 0
金黄色葡萄球菌 0.2单位 20pmol EPO 0
白色假丝酵母 无 无 1,460,000
白色假丝酵母 0.2单位 无 1,100,000
白色假丝酵母 0.2单位 无 1,460,000
白色假丝酵母 0.2单位 20pmol MPO 1,180,000
白色假丝酵母 0.2单位 20pmol MPO 1,280,000
白色假丝酵母 0.2单位 20pmol EPO 1,220,000
白色假丝酵母 0.2单位 20pmol EPO 1,160,000
烟曲霉 无 无 1,260,000
烟曲霉 0.2单位 无 620,000
烟曲霉 0.2单位 无 700,000
烟曲霉 0.2单位 20pmol MPO 1,560,000
烟曲霉 0.2单位 20pmol MPO 320,000
烟曲霉 0.2单位 20pmol EPO 1,040,000
烟曲霉 0.2单位 20pmol EPO 16,000表示50mM乙酸盐缓冲液中含1mM l—丙氨酸
在l—丙氨酸存在或不存在时,胆固醇氧化酶(表1),胆碱氧化酶(表16)和乳酸氧化酶(表17)与MPO或EPO结合均可将金黄色葡萄球菌完全杀死。乙醇氧化酶和EPO结合可将微生物完全杀死,但和MPO结合时,无论有无l—丙氨酸只部分杀死微生物。
以胆固醇氧化酶(表1)可完全杀死白色假丝酵母,以胆碱氧化酶(表16)加MPO或EPO仅在l—丙氨酸存在时才可完全杀死。l—丙氨酸不存在时,杀微生物作用限于约50%的杀死率。在l—丙氨酸存在或不存在时,乳酸氧化酶(表17)和乙醇氧化酶(表18)在促使MPO或EPO杀灭白色假丝酵母中均无效果。
在l—丙氨酸存在时,胆固醇氧化酶(表1)和胆碱氧化酶(表16)帮助MPO或EPO完全杀死烟曲霉孢子。但是,在l—丙氨酸不存在时仅部分杀死。虽然不完全,但在l—丙氨酸存在时,乳酸氧化酶(表17)和乙醇氧化酶(表18)与EPO可产生大于90%的孢子杀死率,与MPO可产生大于50%的孢子杀死率。在l-丙氨酸不存在时,乳酸氧化酶和乙醇氧化酶均不帮助MPO或EPO杀死烟曲霉孢子。
实施例10
潜在激活物对胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶杀死细菌和曲霉孢子的影响效果
微生物文献中描述了一些可充当孢子萌发和形成营养体的激活剂的物质。已有报道说分生孢子的萌发需要葡萄糖、磷酸盐和氨基酸。l—脯氨酸或l—丙氨酸符合这种对氨基酸的要求。其它氨基酸和维生物的效果要差些(Yanigita,1957,Arch Mikrobiol 26:329)。
已报道一些其它有机化合物能刺激萌发。这些化合物包括苯乙醇(Lingappa等,1970,Arch Mikrobiol 72:97),香豆素(Weber和Hess,1974,The Fungal Spore,P.178,Wiley—Interscience)和糠醛衍生物(Sussman等,1959,Mycologia 51:237)。
l—丙氨酸和l—脯氨酸对胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶杀死蜡状芽孢杆菌(Baccillus Cereus)内生孢子的影响效果含0.1单位(即4μg)来自红粉诺卡氏菌的胆固醇氧化酶,20pmol(2.8μg)猪MPO(ExOxEmis,Inc.,San Antonio,Texas,U.S.A.,Lot#1899201)或20pmol(1.5μg)猪EPO(ExOxEmis,Inc.,San Anto-nio,Texas,U.S.A.,Lot#1929201)和所示量的l—丙氨酸或l-脯氨酸的50mM乙酸盐缓冲液,缓冲液含100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-。加入50mM MOPS缓冲液,调pH为7。胆固醇的终浓度为在8.5%乙醇中5mM(5μmol/ml)。终体积为1ml。所示保温(22℃下)时间后,将存活的微生物在酪蛋白胰蛋白酶解物大豆琼脂上铺平板。计数菌落形成单元(CFU),结果示于表19。
表19l—丙氨酸和l—脯氨酸对胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶抗蜡状芽孢杆菌孢子的杀微生物作用的影响效果存活的蜡状芽孢杆菌处理: CFU(暴露后的时间,以小时计)卤代过氧 活化物化物酶 0.5小时 1小时 1.5小时 2小时 3小时无 无 900,000 460,000 720,000 720,000 520,000无 l—丙氨酸,10μmol 860,000 660,000 560,000 520,000 400,000无 l—脯氨酸,10μmol 820,000 760,000 620,000 320,000 540,000MPO,20pmol 无 0 0 0 0 0MPO,20pmol l—丙氨酸,10μmol 0 0 0 0 0MPO,20pmol l—脯氨酸,10μmol 0 0 0 0 0EPO,20pmol 无 2,000 2,000 0 0 0EPO,20pmol l—丙氨酸,10μmol 2,000 0 0 0 0EPO,20pmol l—脯氨酸,10μmol 0 2,000 0 0 0
保温30分钟后,以l—丙氨酸或l—脯氨酸作活化剂时,带MPO(20pmol)的胆固醇氧化酶(0.1单位)可将蜡状芽孢杆菌完全杀死。然而,不加任何增强物质也可全部杀死微生物。虽然需要一更长的保温期,使用带EPO的胆固醇氧化酶也能获得类似的结果。在不存在卤代过氧化物酶时,加入l-丙氨酸或l-脯氨酸不会显著提高胆固醇氧化酶的灭菌活性。这些细菌内生孢子对于氧化酶—卤代过氧化物酶灭菌的直接敏感性很强,以致于在早期30分钟所观察到的全部杀死情况中l—丙氨酸或l—脯氨酸的任何效果均被遮掩掉了。
根据前述方法步骤测定l—丙氨酸,l—脯氨酸、香豆素和苯乙醇对胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶杀死烟曲霉孢子的影响效果,所不同的是在反应中含有0.1单位(即4μg)来自红粉诺卡氏菌的胆固醇氧化酶,20pmol(2.8μg)的猪MPO(ExOxEmis,Inc.,San An-tonio,Texas,U.S.A.,Lot#1899201)或20pmol(1.5μg)猪EPO(ExOxEmis,Inc.,San Antonio,Texas,U.S.A.,Lot#1929201)和所示量的要测试物质的50mM乙酸盐缓冲液,缓冲液含100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-。加入50mM MOPS缓冲液调节pH为7。胆固醇的终浓度为在8.5%乙醇中5mM(5μmol/ml)。终体积为1ml。经所示的保温(37℃)时间后,将烟曲霉在沙氏葡糖琼脂上铺平板。计数菌落形成单元(CFU),结果示于表20。PEA为苯乙醇的缩略语。在所测试的4个潜在的活化物质时,只有l—丙氨酸增强带EPO或MPO的胆固醇氧化酶的杀菌能力。卤代过氧化物酶不存在时,这些活化剂都不能增强胆固醇氧化酶的杀菌能力。
表20l—丙氨酸、l—脯氨酸、香豆素和苯乙醇对胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶抗烟曲霉孢子的杀微生物作用的影响效果存活的烟曲霉处理: CFU(暴露后的时间,以小时计)卤代过氧 活化物化物酶 1小时 1.5小时 2小时 3小时 4小时无 无 710,000 760,000 530,000 340,000 240,000无 l—丙氨酸,10μmol 780,000 720,000 500,000 340,000 340,000无 l—脯氨酸,10μmol 900,000 540,000 560,000 400,000 200,000无 香豆素, 1μmol 320,000 700,000 480,000 240,000 500,000无 PEA,5μmol 380,000 600,000 360,000 440,000 480,000MPO,20pmol 无 520,000 940,000 500,000 410,000 550,000MPO,20pmol l—丙氨酸,10μmol 0 0 0 0 0MPO,20pmol l—脯氨酸,10μmol 860,000 880,000 760,000 700,000 260,000MPO,20pmol 香豆素, 1μmol 740,000 620,000 500,000 620,000 660,000MPO,20pmol PEA,5μmol 500,000 600,000 420,000 420,000 520,000EPO,20pmol 无 920,000 690,000 840,000 710,000 760,000EPO,20pmol l—丙氨酸,10μmol 0 0 0 0 0EPO,20pmol l—脯氨酸,10μmol 1,100,000 840,000 1,000,000 500,000 520,000EPO,20pmol 香豆素, 1μmol 760,000 780,000 420,000 340,000 300,000EPO,20pmol PEA,5μmol 780,000 600,000 480,000 460,000 320,000
在制剂中加入l—丙氨酸能大大增加氧化酶—卤代过氧化物酶抗孢子和营养体的杀真菌作用。l—丙氨酸显示出可提供萌发和生长所需的胺氮,CO2,乙酰—CoA和还原的等效物,并因此激活真菌对卤代过氧化物酶的作用。如前所述的以卤代过氧化物酶—葡萄糖氧化酶杀死微生物的情况(表3),l—脯氨酸没有作为增强物的效果。
实施例11
由(1)胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶和(2)固体形式的胆固醇组成的二元灭菌组合物
胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶体系由一种二元制剂构成,含有(1)含胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶加上抗菌活性增强剂l—丙氨酸的溶液和(2)固体片型的胆固醇。胆固醇片的制备是通过将胆固醇溶于醚,将该胆固醇溶液喷于表面上,并使醚挥发。将得到的胆固醇片切成合适大小的约10mg的长方形。
胆固醇片(约10mg/片)被置于含烟曲霉孢子的试管中。含或者不含MPO或EPO的胆固醇氧化酶加入该试管以引发杀真菌作用。用和不用l—丙氨酸,用和不用乙醇进行体系测试。加入乙醇以测定其促使胆固醇溶解的能力。增大的胆固醇溶解性意味着可获得增多的作为氧化酶底物的胆固醇。一旦引发反应,使体系保温于室温(22℃),时间间隔从30分钟至4小时。反应含0.1单位(即4μg)的来自红粉诺卡氏菌的胆固醇氧化酶,10pmol(1.4μg)猪MPO(Ex-OxEmis,Inc.,San Antonio,Texas,U.S.A.,Lot#1899201)或10pmol(0.7μg)猪EPO(ExOxEmis,Inc.,San Antonio,Texas,U.S.A.,Lot#1929201)的50mM乙酸盐缓冲液,缓冲液含100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-。加入50mM MOPS缓冲液调节pH为7。底物胆固醇呈固体片型式(约10mg)。如所示,反应含10μmol/mll—丙氨酸和10%乙醇。终体积为1ml。经所示保温(22℃)时间后,将烟曲霉在沙氏葡糖琼脂上铺平板。结果用所计数的菌落形成单元(CFU’s)表示。Nd表示未进行实验。结果示于表21。
表21
l—丙氨酸对胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶抗烟曲霉孢子的杀微生物作用的影响效果,使用固体胆固醇作为底物,乙醇存在和不存 在处理: 存活的烟曲霉卤代过氧 CFU(暴露后的时间,以小时计) 化物酶 1—丙氨酸 乙醇 0.5小时 1小时 2小时 4小时
无 无 10% 960,000 1,900,000 960,000 800,000
无 10μmol 10% 1,180,000 1,220,000 820,000 158,000MPO,10pmol 无 10% 920,000 1,540,000 1,120,000 1,020,000MPO,10pmol 10μmol 10% 82,000 0 0 0EPO,10pmol 无 10% 1,120,000 3,000,000 3,040,000 940,000EPO,10pmol 10μmol 10% 0 0 0 0
无 无 无 ND 2,300,000 ND 980,000
无 10μmol 无 ND 1,980,000 ND 1,900,000MPO,10pmol 无 无 ND 2,380,000 ND 1,860,000MPO,10pmol 10μmol 无 ND 1,640,000 ND 10,000EPO,10pmol 无 无 ND 2,620,000 ND 1,340,000EPO,10pmol 10μmol 无 ND 1,340,000 ND 0
如表21所示,在乙醇和l—丙氨酸存在时,胆固醇氧化酶—MPO制剂在30分钟时可杀死10倍的孢子,在1,2和4小时可将孢子全部杀死。在有效的MPO依赖型灭菌作用中需要l—丙氨酸。在乙醇和l—丙氨酸存在而卤代过氧化物酶不存在时,胆固醇氧化酶效果和缓,但仅在保温4小时之后显示出来。最有效的制剂是有乙醇和l—丙氨酸的胆固醇氧化酶—EPO。在所有测试间隔期均可全部杀死孢子。
乙醇的参与大大增加了所测试的所有制剂的有效性。存在10%乙醇时自发作用较快且更强。乙醇的这种效果可来自于固体胆固醇增加的溶解性,导致增大的胆固醇氧化酶活性。结果还显示出10%的乙醇对胆固醇氧化酶—卤代过氧化物酶的作用没有不利影响。制剂中含有足量的乙醇或其它无毒溶剂还可在没有胆固醇时帮助体系保持无菌状态并改善反应混合物的贮存期限。
根据前述内容,对本发明方法和组合物的各种修改和变化对本领域技术人员而言是显而易见的。除了现有技术的范围外,任一这样的修改和变化均认为属于附加权利要求的范围。
权利要求书按照条约第19条的修改
1.一种杀死酵母或孢子微生物或抑制其生长的方法,它包括,在一种过氧化物和氯化物或溴化物存在时将微生物与一种卤代过氧化物酶和至少一种下式的抗菌活性增强剂接触:其中,R1为氢,未被取代的或者羟基或氨基取代的具有1至6个碳原子的直链或支链烷基,R2为氢或具有1至6个碳原子的直链或支链烷基。
2.根据权利要求1的方法,其中卤代过氧化物酶选自髓过氧化物酶,嗜曙红细胞过氧化物酶及其结合物。
3.根据权利要求1的方法,其中抗菌活性增强剂是一种α—氨基酸,选自甘氨酸,丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,丝氨酸,苏氨酸,赖氨酸以及这组氨基酸中任一氨基酸的烷基酯。
4.根据权利要求2的方法,其中卤代过氧化物酶为髓过氧化物酶。
5.根据权利要求2的方法,其中卤代过氧化物酶是嗜曙红细胞过氧化物酶。
6.根据权利要求1的方法,其中微生物与含有至少0.01pmol/ml的卤代过氧化物酶和至少0.005μmol/ml的抗菌活性增强剂的液体溶液接触。
7.根据权利要求6的方法,其中液体溶液含0.1pmol/ml至500pmol/ml的卤代过氧化物酶和0.05μmol/ml至50μmol/ml的抗菌活性增强剂。
8.根据权利要求6的方法,其中每ml溶液含有0.5pmol至50pmol的卤代过氧化物酶。
9.根据权利要求6的方法,其中液体溶液还含有一种过氧化物或一种产生过氧化物的试剂。
10.一种杀死酵母或孢子微生物或者抑制其生长的组合物,包含一种卤代过氧化物酶和至少一种下式的抗菌活性增强剂:其中,R1为氢,未被取代的或者羟基或氨基取代的具有1至6个碳原子的直链或支链烷基,R2为氢或具有1至6个碳原子的直链或支链烷基。
11.根据权利要求10的组合物,其中卤代过氧化物酶为髓过氧化物酶,嗜曙红细胞过氧化物酶及其结合物。
12.根据权利要求10的组合物,其中抗菌活性增强剂为一种α—氨基酸,选自甘氨酸,丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,丝氨酸,苏氨酸,赖氨酸以及这组氨基酸中任一氨基酸的烷基酯。
13.根据权利要求11的组合物,其中卤代过氧化物酶为髓过氧化物酶。
14.根据权利要求13的组合物,其在液体载体中含有至少0.01pmol/ml的髓过氧化物酶。
15.根据权利要求14的组合物,其含有0.1pmol/ml至500pmol/ml的髓过氧化物酶。
16.根据权利要求14的组合物,其含有0.5pmol/ml至50pmol/ml的髓过氧化物酶。
17.根据权利要求12的组合物,其在液体载体中含至少0.005μmol/ml的抗菌活性增强剂。
18.根据权利要求17的组合物,其含有0.05μmol/ml至50μmol/ml的抗菌活性增强剂。
19.根据权利要求11的组合物,其中卤代过氧化物酶为嗜曙红细胞过氧化物酶。
20.根据权利要求19的组合物,其在液体载体中含至少0.01pmol的嗜曙红细胞过氧化物酶。
21.根据权利要求19的组合物,其在液体载体中含0.1pmol至500pmol/ml的嗜曙红细胞过氧化物酶。
22.根据权利要求20的组合物,其含有0.5pmol/ml至50pmol/ml的嗜曙红细胞过氧化物酶。
23.根据权利要求20的组合物,其还含有10nmol/ml至10μmol/ml的溴化物。
24.根据权利要求10的组合物,其还含有过氧化氢或一种在氧化酶的底物存在时产生一种过氧化物的氧化酶。
25.根据权利要求24的组合物,其含有产生过氧化物的氧化酶,当存在一种氧化酶的底物时,氧化酶每分钟能产生每ml100pmol至50μmol的过氧化物。
26.一种消毒—灭菌溶液,其含有权利要求10的组合物。
27.一种根据权利要求26的消毒—灭菌溶液,其在液体载体中含有0.1pmol/ml至500pmot/ml的髓过氧化物酶,嗜曙红细胞过氧化物酶或其结合物,0.005μmol/ml至50μmol/ml的一种α—氨基酸,选自甘氨酸,丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,丝氨酸,苏氨酸,赖氨酸以及这组氨基酸中任一种氨基酸的烷基酯。
28.一种眼药溶液,其含有权利要求10的组合物。
29.一种权利要求8的眼药溶液,其在一种眼科上可接受的液体载体中含0.1pmol/ml至500pmol/ml的髓过氧化物酶,嗜曙红细胞过氧化物酶或其结合物,0.005μmol/ml至50μmol/ml的一种α—氨基酸,选自甘氨酸,丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,丝氨酸,苏氨酸,赖氨酸以及这组氨基酸中任一种氨基酸的烷基酯。
机译: 杀灭酵母和孢子微生物的杀真菌方法和组合物
机译: 杀灭酵母和孢子微生物的杀真菌方法和组合物
机译: 杀灭酵母和孢子微生物的杀真菌方法和组合物