法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-12-03
专利权有效期届满 IPC(主分类):A61K38/48 授权公告日:20050713 期满终止日期:20141027 申请日:19941027
专利权的终止
2005-07-13
授权
授权
1997-01-08
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
1996-12-18
公开
公开
发明领域:
本发明涉及一种稳定从血浆中得到或通过基团重排技术制备的蛋白质C或活性蛋白质C的方法。更为具体的是,本发明涉及一种在其被贮存或已经过分离和纯化、冷冻干燥、加热等处理时,稳定蛋白质C或活性蛋白质C的方法,本发明也涉及一种由此法稳定的制剂。
技术背景:
蛋白质C(在下文中也称为“PC”)是一种维生素K相关蛋白质,即一种含有γ-羧基谷氨酸的蛋白质,其可在存在于脉管内皮细胞表面上的thrombomodulin存在下,通过凝血酶被活化成活性蛋白质C(在下文中也称为“APC”)。
活性蛋白质C是一种丝氨酸蛋白质酶,有很强的抗凝聚活性,其是通过使血液凝聚的辅因子失活来完成的,这些辅因子如Va因子(FVa)和VIIIa因子(FVIIIa)。已知活性蛋白质C从血管壁释放一种血纤维蛋白溶酶原的活化物以加速血纤维蛋白溶解过程,而且,已知蛋白质C的一个缺点是引起严重的凝血作用。因此,活性蛋白质C是调节血血液凝聚和溶解作用的最重要因素。因此,希望开发利用蛋白质C或活性蛋白质C作为一种新的抗凝血剂或血纤维蛋白溶酶原试剂。
到目前为止,已知血浆中或通过人工组织培养得到的蛋白质C的量是很低的。因此,为了更安全和更广泛地把蛋白质C或活性蛋白质C作为一种抗凝血剂或血纤维蛋白溶酶原试剂,分离和纯化蛋白质C或活性蛋白质C是很重要的。另外,工业上大规模制备蛋白质C或活性蛋白质C,以溶液或冷冻的方式长期贮存时,冷冻干燥或使感染性病毒失活如加热等过程是必不可少的。然而,贮存放置、冷冻或冷冻干燥、或加热处理高纯蛋白质C或活性蛋白质C都很大程度地降低它的活性。也没有见到关于经高度提纯蛋白质C或活性蛋白质C稳定性的报导。在这些情况下,工业规模上稳定和有效地提供高纯度蛋白质C或活性蛋白质C是不可能的。
在这种情况下,本发明人认真地研究了蛋白质C或活性蛋白质C的稳定性,结果表明蛋白质C或活性蛋白质C的活性通过下述方法能够保持住,即使是贮存放置相当长时间或经过了分离和纯化、冷冻干燥、加热等过程。该方法是向蛋白质C或活性蛋白质C中添加至少一种氨基酸到一种含钠离子的磷酸或柠檬酸的缓冲剂中,而后添加清蛋白和非离子型表面活性剂中的一种或两者结合,这样就完成了本发明。
发明内容:
本发明涉及一种稳定蛋白质C或活性蛋白质C的方法,其包括添加至少一种氨基酸到含有蛋白质C或活性蛋白质C及钠离子的缓冲液中,而后加清蛋白和非离子型表面活性剂中的一种或两者结合于前溶液中。更为具体的是,本发明涉及稳定蛋白质C或活性蛋白质C的方法,其中包括将蛋白质C或活性蛋白质C溶于如含钠离子的磷酸或柠檬酸缓冲溶液中,而后加至少一种构成蛋白质的氨基酸于上述溶液中,这些氨基酸例如可以是甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等等,还要加入具有稳定蛋白质活性作用的多肽如清蛋白、球蛋白等,在优选的实施方案中,也可加入任选的非离子型表面活性剂,一般为Tween80。本发明也涉及到由此法稳定的制剂。
实施本发明的最佳方案:
本文中使用的蛋白质C或活性蛋白质C包括各种有较大的APC活性的化合物及其衍生物,它们可以由已知的办法制备。例如,从人体血浆中直接分离出蛋白质C或利用基因重组技术制备得到蛋白质C,然后使蛋白质C活化;直接从人体血浆中分离出APC;或用基因重组技术制备APC等等。可以用已知的办法把蛋白质C活化为活性蛋白质C,例如,可以用从人或牛的血液中分离出的凝血酶活化,或用同类的蛋白酶活化等等。
从血液中制备APC可采用例如下列方法:通过亲合色谱法,用抗蛋白质C抗体从人的血浆中纯化得到蛋白质C,再用人体凝血酶活化,并且用阳离子色谱法纯化得到的活性蛋白质C(Blood,63,P.115-121(1984));或按照Kisiel描述的方法,激活从人体血浆中纯化得到的蛋白质C以产生APC(J.Clin.Invest.,64,p.761-769(1979)),其中采用柠檬酸钠吸附和洗脱,用硫酸铵分馏,二乙基氨基乙醇-交联葡萄糖(DEAE-Sephadex)的柱色谱法,葡聚糖硫酸琼脂糖色谱法和聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法纯化蛋白质C,或按照Taylor等人所述的方法(J.Clin,Invest.,79,P.918-925(1987))激活一种商业上可得的含蛋白质C的血液凝聚剂而得到活性蛋白质C。
用基因重组技术得到APC产物可以如下列日本专利所描述的方法制备:日本专利首次公布号(Kokai)NO.61-205487;(Kokai)NO.1-2338;(kokai)No 1-85084等等。本文所用的起始原料蛋白质C或活性蛋白质C的制备过程,并不仅限于上文所提到的过程。
因此,制备的起始原料蛋白质C或活性蛋白质C的纯化和分离过程,是将生物化学上常用的各种分离和纯化过程结合起来使用的,包括如用硫酸铵的盐析法,用离子交换树脂的离子交换色谱法、凝胶过滤、电泳等等。
当用这些方法不断提高蛋白质C或活性蛋白质C的纯度时,它必定变得不稳定。当产物经过了贮存放置、冷冻、冷冻干燥、加热等过程处理时,即使没有很高的纯度,它的活性也会降低。本发明的主要目的是研究如何稳定这些由于纯度不断提高而变得不稳定的蛋白质C或活性蛋白质C。由本发明得到的蛋白质C或活性蛋白质C可以是液体或者粉末状。
本发明的稳定蛋白质C或活性蛋白质C的方法中,将含作为稳定剂的浓度最好为50mM-200mM的钠离子的盐,至少一种氨基酸和一种有稳定作用的多肽加到含有100-2500U/ml的蛋白质C或活性蛋白质C的缓冲溶液中。盐和氨基酸可单独使用或两种及多种结合使用。优选的缓冲剂如柠檬酸钠、磷酸钠和硫酸钠等。加入的氨基酸的最后浓度为0.005M-0.1M,最好为0.01M-0.05M。有稳定作用的多肽如清蛋白或球蛋白的适当浓度取决于一般常识或节约观点,优选浓度为0.5%(w/v)-10%(w/v)。单位“%(w/v)”此处表示一定量的溶质溶解在1升溶液中,例如,当10g溶质溶在1升溶液里,浓度为1%(w/v)。在本发明的优选方案里,加入任选的一种非离子型表面活性剂如Tween 80以提高稳定效果,其浓度为0.0005%(w/v)-0.1%(w/v)。
本发明的一个典型实施方案是含有蛋白质C或活性蛋白质C的缓冲水溶液,其含有:100-2500U/ml的蛋白质C和/或活性蛋白质C,50-200mM的钠离子,5-100mM的氨基酸,还含有0.5-10%(w/v)的清蛋白及0.0005-0.1%(w/v)的非离子型表面活性剂两者之一或两者的组合。
当加入到蛋白质C或活性蛋白质C的稳定剂是粉末时,使用的量是当粉末溶解时其浓度在上述提到的浓度范围内。
因此,本发明的另一典型方案是含有蛋白质C或活性蛋白质C的组合物,其包括1×105-2.5×106U的蛋白质C和/或活性蛋白质C,50-200mg的钠离子,5-100mM的一种氨基酸,还含5-100g的清蛋白及0.005-1g的非离子型表面活性剂两者之一或两者的组合。
加入这些成分的方法不是特定的,其包括各种方法。例如:直接将本发明的粉末物质加入到含有蛋白质C或活性蛋白质C的缓冲剂中;或先将上述的粉末材料溶于水中或一适当缓冲剂中,然后加溶液于含蛋白质C或活性蛋白质C的缓冲溶液中;或将含蛋白质C或活性蛋白质C的粉末与上述粉末物质混合。也可以在分离和纯化蛋白质的过程中或药物制备过程中添加。
当加有本发明稳定剂的含蛋白质C或活化蛋白质C的溶液在贮存或经例如分离和纯化处理,或在溶液状态下制备药物制剂过程中,优选在0-30℃条件下进行,最好在0-10℃之间。当所提的溶液以冷冻状态贮存时,优选在低于冰点温度下贮存,最好低于-20℃,或当冷冻干燥状态下贮存时,最好在室温或更低进行。将本发明的稳定剂加到含蛋白质C或活性蛋白质C的溶液中时,即使它以溶液态或冷冻或冷冻干燥贮存放置,或对它进行例如分离和纯化处理。或制备药物制剂过程中,蛋白质C或活性蛋白质C的活性都能被稳定保持。
APC的活性按照下列过程测定。
APC活性的单位被定义为使正常人体血浆中的促凝血酶原激酶激活时间(APTT,秒)延长两倍时所需的APC的量。因此,APC活性测定是将一稀释样品加到正常人体血浆中,测定血浆的APTT值(以秒为单位),当某一稀释液所测得的APTT值是对照标准(缓冲剂)值的两倍时,这一稀释液被认为是样品的APC的活性。
步骤:
用含1%人体血清清蛋白的二乙基巴比土酸将样品稀释到例如400、500、800、1000倍。取对照标准物(缓冲剂)及稀释的样品各100μl,将100μl的正常人体血浆(如Citrol I:BaxterDiagnostics Inc.)和100μl的APTT试剂(如Actin:BaxterDiagnostics Inc.)在37℃条件下,以15秒间隔加入,搅拌混合物,两分钟后,加入0.025M CaCl2 100μl,测凝聚时间。
活性的计算:
由对照标准样和样品在每一个稀释值(x)的APTT值(Y),可得103/x和y的线性回归方程及相关系数如下:
T=A(103/x)+B
x1值可由下列方程推出:
x1=103{(Y1-B)/A}
当Y1值是对照标准样的APTT(秒)值的两倍时,X1被认为是样品APC的活性(U/ml)。
蛋白质C活性测定用的是由Boehlinger Mannheim生产的“Staclot proteinc”。
本发明由下列实例给予更详细的解释说明,但不应理解为仅限于此。
实例1
各种抗衡离子对APC稳定性影响:
将2.5%的人体血清蛋白(本文以后也简称为“HSA”)加到活性为500U/ml的活性蛋白质C中。然后用含有0.7%NaCl和0.067M甘氨酸的由柠檬酸钠、磷酸钠和硫酸钠各20mM组成的溶液渗析该溶液。渗析后,每个溶液在37℃放置24小时,之后测活性。结果列在表1中。柠檬酸钠、磷酸钠、硫酸钠这些被测定的抗衡离子显示了相似的令人满意的稳定性。
表1
各种抗衡离子对APC稳定性的影响
抗衡离子 活性保持比率(%)
(37℃,24小时)
柠檬酸钠20mM 97.4
磷酸钠20mM 94.8
硫酸钠20mM 92.2
实例2
氨基酸对APC活性的影响:
将2.5%的HSA加入到活性为500U/ml的活性蛋白质C的溶液中。然后将溶液渗析,所用渗析液为含0.7%氯化钠及甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸及谷氨酸各0.05M的柠檬酸钠的缓冲剂。渗析后,每个溶液在37℃放置24小时,测定活性。结果列在表2。上述六种氨基酸均显示很高的稳定性,也没有破坏APC的稳定性。
表2
各种氨基酸对APC稳定性的影响
氨基酸 活性保持比率(%)
(0.5%) (37℃,24小时)
无氨基酸 86.1
甘氨酸 97.7
丙氨酸 97.7
赖氨酸 107
精氨酸 102
天冬氨酸 108
谷氨酸 106
实例3
加入HSA的影响:
制备两种溶液,均含有人体活性蛋白质C(1700U/ml)、20mM柠檬酸、0.7%的氯化钠和0.067M甘氨酸,其中一种含2.5%HSA,另一种不含HSA。然后溶液在37℃和4℃条件下放置。用本文所述方法测定放置不同时间的活性,得到保持活性百分比。结果列在表3中。
表3
在不同条件下保持活性百分比(%)
在37℃时:
放置时间(小时)
0 1 3 6 8 24HSA(+) 100 - 99.2 - 101 97.4HSA(-) 100 888 92.0 86.2 90.9 79.3
在4℃时:
放置时间(小时)
0 1 3 5 7 14HSA(+) 100 - 105 - - 98.1HSA(-) 100 112 99.1 104 98.9 85.2
从表3所示结果可知,当APC放置时,不含HSA的溶液不能阻止APC活性的降低。从这些结果得出,2.5%的HSA能十分有效地稳定APC。
实例4
HSA对APC稳定性的影响:
表4的数据表明APC的活性取决于HSA的浓度。将0.5%到10%的HSA加到含活性蛋白质C(500U/ml)的溶液中。该溶液被放入贮存容器中,在37℃条件下放置。24小时后,取样并测量活性。在不含HSA的溶液中,活性以20%的比率降低,而在加入浓度为0.5到10.0%的HSA时,活性不降低且APC保持稳定。
表4
HSA对APC活性的稳定性的影响
HSA(%) 活性保持比率(%)
(37℃,24小时)
0.0 79.0
0.5 96.0
2.5 97.4
5.0 98.0
10.0 102
实例5
Tween80对APC稳定性的影响:
将0.0005%到0.1%的非离子型表面活性剂Tween 80(商品名)加入到含人体活性蛋白质C(500U/ml)、20mM柠檬酸,0.7%氯化钠和0.067M甘氨酸的溶液中。将该溶液放于贮存容器中,在37℃条件下放置。24小时后取样,测量活性。结果列在表5中。在Tween 80的情况中,活性以20%的比率降低,稳定性被破坏,而在加入浓度为0.0005%到0.1%Tween 80的情况下,未发现活性变化,溶液保持高的稳定性。
表5
Tween 80(%) 活性保持比率(%)
(37℃,24小时)
无 79
0.0005 101
0.025 104
0.1 103
实例6
氯化钠对经冷冻干燥的固体柠檬酸盐质量的影响:
制备含有APC 500U/ml HSA 2.5%、甘氨酸0.067M和柠檬酸钠20mM的经冷冻干燥的APC产物,使其含有氯化钠的浓度从1mM到500mM变化。每一冷冻干燥产物在60℃下放置一个月,各固体的外观质量列在表6中。
表6
含有选定浓度氯化钠的经冷冻干燥处理制剂的质量
氯化钠 固体质量
(mM) 放置前 在60℃放置一个月
1 白色固体,皱缩 非常易皱缩
10 白色固体,稍微皱缩 与放置前相同
50 白色多孔块状 与放置前相同
100 白色多孔块状 与放置前相同
500 透明皱缩块状 与放置前相同
表6的结果表明,在添加氯化钠的浓度很高或很低时,固体的APC制剂很难配制为药物制剂。含有的氯化钠浓度为50mM到200mM,被认为是有利于冷冻干燥制剂的稳定。
实例7
在经冷冻干燥制剂中的APC活性:
制备含有本发明稳定剂(0.7%氯化钠,0.067M甘氯酸和2.5%HSA)的柠檬酸的缓冲溶液,使其含有APC的活性为100-2500U/管形瓶,且无菌情况下分别放入管形瓶中,而后冷冻干燥并密封。每一管形瓶放置在10℃、15℃和60℃条件下,测定活性的降低。结果列在表7中。数据表明本发明的稳定APC的办法在冷冻干燥状态下是有效的。
表7
活性保持比率(%)
APC 时间 10℃ 15℃ 60
(U/管形瓶)
100 30个月 100 101 -
500 30个月 97 99 -
11天 99
1000 30个月 99 97 -
2500 30个月 98 95 -
11天 105
实例8
重复的冷冻-熔化过程对APC稳定性的影响:
将本发明的稳定剂(0.7%氯化钠,0.067M的甘氨酸和2.5%HSA)加入到含活性为500U/ml的活性蛋白质C的柠檬酸的缓冲溶液中。得到的溶液重复(5次,10次,15次和20次)冷冻(-80℃)和熔化,之后测量活性。结果列在表8中。即使是重复冷冻-熔化20次,APC的活性也没有明显变化,且保持稳定。
表8
重复次数 活性保持比率(%)
5 102
10 95.1
15 106
20 99.2
机译: 一种制备稳定的酶或蛋白质的方法以及用于外用的组合物,其包含由此制备的稳定的酶或蛋白质
机译: 稳定酶或蛋白质的方法,以及由此稳定化的包含酶的外部应用组合物
机译: 产生一个或多个蛋白质的方法,加标签的蛋白质的文库,产生一组蛋白质的方法,排列。筛选一种或多种化合物对一种或多种蛋白质的生物活性的方法用于蛋白质-蛋白质和特定核酸的相互作用的核酸,一种排列的使用,用于产生一组抗体的方法,以及对蛋白质或蛋白质的功能依赖性的分类,以及使用标有标签的蛋白质。