含PDGF和维生素D的刺激成骨细胞生长的组合物

摘要

公开刺激成骨细胞生长的方法和组合物。以足以刺激细胞生长的量向成骨细胞施用含有血小板衍生的生长因子和维生素D的组合物。该方法可用于促进成骨细胞体外生长或促进骨缺陷的体内愈合。

说明书

骨的再造是维持组织质量和骨架构造的动态过程。此过程是骨吸收和骨形成间的平衡，认为有两种细胞是主要参与者。它们是破骨细胞和成骨细胞。成骨细胞合成并沉积新骨，填充由破骨细胞造成的空洞。成骨细胞和破骨细胞的活动受许多因素调节，有系统的和局部的，包括生长因子。

认为与骨的体内平衡有关的生长因子之一是血小板衍生的生长因子(PDGF)。具有生物活性的PDGF被发现是一种组分A和B链的同型二聚体或异型二聚体。离体实验研究已显示PDGF对成骨细胞有促有丝分裂作用(Abdennagy et al.cell Biol.Internat、Rep 16(3)：235—247，1992)。将生长因子加到正常的成骨样细胞(Tuskamo-ta et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.，175(3)：745—747，1991)和原代成骨细胞培养物中(Centrella et al.Endocrinol.125(1)：13—19，1989)，证实了促有丝分裂活性和趋化活性与PDGF有关。最近的研究表明，成骨细胞产生PDGF的AA异构体(Zhang etal.，Am.J.Physiol.261：C348—354，1991)。PDGF影响成骨细胞生长的确切方式还没了解清楚，然而，生长因子在正常的骨架再造和骨折修复的调节中起关键作用这一点似乎是一致的。

例如，PDGF的治疗学应用包括损伤的治疗，象骨折，需要成骨细胞增殖来治愈损伤。已表明，间质细胞增生的刺激和骨内膜的合成是骨折修复过程的几个方面(Joyce et al，36th Annual Meeting，or-thopaedic Research Society，February 5—8，1990.New orleans，LA)。

维生素D一直传统地被认为是预防佝偻病的关键因素，佝偻病是一种骨钙化机能不全的疾病。此重要性与维生素D促进胃肠摄取钙的作用和血清钙水平对骨体内平衡的重要性有关。最近的证据提示，成骨细胞有维生素D代谢产物1α，25—二羟胆钙化醇的受体，表明成骨细胞是该激素的主要靶细胞(Suda et al.J.Cell.Biochem.，49：53—58，1992)。维生素D被认为在成骨细胞激活破骨细胞调节的骨吸收作用中起重要作用(Watrou et al.，Sern.in Arthritis andRheum.，19(1)：45—65，1989)。维生素D已用于成骨细胞体外培养中(Kurihara et al.，Endocrinol.118(3)：940—947，1986)，并与碱性磷酸酶的增多有关。碱性磷酸酶是细胞分化成成骨细胞表现型的一种标记。然而，在人的骨细胞，碱性磷酸酶刺激与细胞增殖的降低有关(Huffer，Lab.Investig.59(4)：418—442，1988)。在颅盖骨培养中，加入维生素D能增加钙释放入培养液中并与骨吸收活动相关(Bell，J.Clinical Investig.76：1—6，1985)。成骨细胞的标志，骨钙蛋白的表达需维生素D诱导(Yoon等，Biochem.27：8521—8526，1988).维生素D在骨体内平衡中的作用和其如何发挥其对成骨细胞和破骨细胞的作用仍需阐明。

因为成骨细胞在骨愈合和再生成过程中的重要作用，因此加强这些细胞增殖的能力仍是一个有价值的目标。本发明提供了这种能力和其它有利条件，这将从以下详细的描述和附图中显而易见。

本发明涉及应用含有血小板衍生的生长因子和维生素D的组合物刺激成骨细胞生长的方法。在一实施方案中，组合物基本上不含PDGF A链。相关的实施方案中，组合物含有重组体PDGF—BB。另一个实施方案中，细胞在体外生长。

本发明的另一方面，提供通过给病人有效量的含PDGF和VD的组合物。在病人身上刺激骨生长的方法。在某些优选的实施方案中，维生素D是9，10—断胆甾(secocholesta)—5，7，10[19]—三烯—3—醇或1α，25—二羟胆钙化醇。

本发明的另一方面提供刺激成骨细胞生长的方法，在含有PDGF和维生素D的有效量组合物存在下培养细胞，其中所述组合物基本不含PDGF的A链。

发明的这些和其它方面在参考了下列详细的描述和附图后，就会很清楚了。

图1说明维生素增强PDGF刺激猪原代成骨细胞摄取3H—胸腺嘧啶脱氧核苷的作用。

图2说明PDGF和维生素D必须同时存在，才能观察到有丝分裂的双倍提高。

图3说明PDGF和维生素的协同效应随维生素D的浓度而变。

图4说明当使用基本的FGF和维生素D时，不出现协同效应。

图5说明维生素D影响PDGF诱导的Swiss 3T3成纤维细胞的有丝分裂。

图6说明对小鼠成骨细胞系MC3T3，有维生素D存在时PDGF诱导的诱导倍数(foldinduction)较无维生素D时要大。

图7说明PDGF和维生素D分开加到颅盖骨培养液中时有刺激骨吸收作用，但一起加入，显示了骨吸收的减少。

本发明部分是以发明者对PDGF和维生素D对成骨细胞的生长有协同效应的发现为基础的。另外，发明者发现PDGF有抑制维生素D诱导的骨吸收的作用，如上所述，总的来说，成骨细胞在骨形成和骨总体体内平衡中起核心作用。本发明的方法对离体培养细胞和在体情况下(例如，骨折修复过程中)刺激成骨细胞生长是很有用的，因此能促进愈合。

本发明的上下文中，PDGF包括PDGF的单一的或组合的AA、BB和AB异构体及其生物活性类似物。另外，PDGF的BB异构体被理解为包括其病毒同系物(V—sis基因产物)。PDGF可从天然获得或来源于重组体。生产重组体PDGF和PDGF类似物的方法在美国专利4,769,433；4,801,542；和4,766,073和EP 282,317中做了描述，这些文献整个并入本文作为参考。PDGF也可在细菌内生成(见Tackney等，WO 90/04035)。从天然资源提纯PDGF的方法已被Raines和Ross(J.Biol.Chem.257：5154—5160，1982)，Hart等(Biochemistry 29：166—172，1990)，和美国专利4,479,896中描述。

如在上述公布的专利中所讨论的，已发现用真核细胞的分泌途径表达重组PDGF，可直接得到生物活性物质。适当的基因产物能从真核细胞表达和分泌，使得能进行适当的加工和组装，导致分子具有天然的和生物活性的构象。在本发明中，只要利用适当的基因转录启动子和分泌信号序列，一般任何真核细胞都能表达和分泌有生物活性的PDGF供应用。或者，PDGF多肽链可在体外从原核细胞表达，分离和组装，产生具有生物活性的分子。

为PDGF在酵母菌中表达，编码PDGF多肽链(例如PDGFA链或PDGF B链)的DNA序列与合适的启动子、分泌信号序列连接。可应用于酵母的启动子包括酵母α—因子(MFαl)启动子和酵母磷酸丙糖异构酶启动子(美国专利4,559,311)。启动子也可从另外的酵母基因得到，例如，乙醇脱氢酶1(ADH1)或乙醇脱氢酶2(ADH2)。适于其它真核系的合适的启动子也可用，而且对于本领域熟练技术人员来说是明显的。PDGF基因产物的分泌可通过使用酵母交配信息素α—因子的前期分泌信号序列(Kurjan和Herskowitx，cell 30：933，1982；Julis等，Cell 36：309，1984；和Brake等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：4642，1984)或酵母BAR1基因前导序列和第三区域序列(见美国专利5,037,743)来完成，也可利用其它分泌信号。为保证有效的转录终止和mRNA的多腺苷化，可加入酵母终止子序列，象丙糖磷酸异构酶终止子(Alber和Kawasaki，J.Molec.Appl.Genet.1：419，1982)。DNA片段的连接方法已有充分的描述(Sambrook等，Molecular cloning：A Laboratory Man ual，2ndEdition，cold spring Harbor Laboratory Press，1989)并且在本领域普通技术水平范围内。表达单位构建物制备后，被插入到一合适的表达载体中。

优选使用可稳定地保持在宿主细胞内的表达载体，以便每个培养单位产生更多的生物活性。在这点上，合适的酵母表达载体是质粒pCPOT(ATCC 39685)和pMPOT2(ATCC 67788)，其包括编码糖酵解酶丙糖磷酸异构酶的粟酒裂殖酵母基因(POT1基因)。由于其能在宿主细胞内补充基因缺失，因而包含POT1保证质粒稳定地维持在TPI基因缺失的宿主细胞内，如美国专利4,931,373中所述的，此专利并入此作为参考。

制备好含有POT1可选择性标记物和表达单位的DNA构建物后，表达单位含有如FPI1启动子、BAR1先导序列和第三区域序列、编码PDGF的适当DNA序列和TPI1终止子，将此构建物转化到TPI1基因缺失的酵母菌宿主细胞内。转化酵母的过程是已知的并在文献中已述及。

POT1基因被用作可选择性标记物时，转化的酵母细胞可通过在常规的含葡萄糖的复合培养基中的生长来选择。可用常规的培养基，如YEPD(每升溶液中含20g葡萄糖，20g Bucto蛋白胨，10g酵母提取物)。选择后，含有合适的表达构建物的转化子在常规的复合培养基中生长至稳定期，经离心或过滤将细胞移出，浓缩培养液。因为PDGF是高价阳离子的疏水蛋白(Kaines和Ross，同上；Antoniades，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：7314，1981；Deuel等J.Biol.Chem.256：8896，1981)，因而重组PDGF具有类似的特性，在其提纯过程中可用离子交换色谱法。例如，在酵母菌发酵液中的重组PDGF—BB可用阳离子交换色谱法将其同细胞分离并且分级。从柱上解吸的PDGF被酸化并用反相色谱法进一步分批分级分离。酸化含PDGF的流出物并通过强阳离子交换柱，用阶梯梯度的NaCl洗脱。收集流出液，PDGF—BB用(NH₄)₂SO₄沉淀出。产生的物质用凝胶过滤脱盐，根据电荷而被分开。酸化流出物且施于强阳离子交换柱，在PH8—10情况下用线性梯度的NH₄HCO₃洗脱。收集流出物，加入(NH₄)₂SO₄沉淀出PDGF—BB。产生的沉淀物溶于乙酸中，用凝胶过滤分级，流出物脱盐、冻干。

除了酵母细胞，本领域熟练技术人员通过应用合适的表达/调节信号，可在真核细胞完成生物活性蛋白的表达。选择能指导PDGF序列在具体的真核细胞系中有效地和/或调节地表达的转录启动子。能指导基因产物进入细胞的分泌途径的信号列序，根据其在宿主细胞内的功能而选用。其它有用的调节信号的选择，象转录终止信号，多腺苷化信号和转录增强子序列，对此领域内熟练技术人员来说是显而易见。

重组PDGF已显现具有与天然PDGF基本相同的生物活性。PDGF的基本生物活性，特别是在反应性细胞中的(包括成纤维细胞、成骨细胞和平滑肌细胞)诱导趋化性和有丝分裂，是这种蛋白质的许多生理作用—包括其在组织修复中的作用的基础。

在本发明的优选实施方案中，PDGF基本是无A链的。因为PDGF的均二聚异构体(AA和BB)是同系但不相同的，并且单体分子量分别为12.5—14.3KD(A链)和13—14KD(B链)，纯度可由聚丙烯酰胺凝胶上单一主带的量来证实。

应用于本发明的特定实施方案中的PDGF组合物优选是纯净的，也就是，通常没有可影响其治疗作用的杂质和污染物。特别优选的是那些无毒性、抗原性、炎性、致热或其它有害物质的，纯度高于90％，优选高于99％的制剂。

用于本发明的维生素D涉及到化合物的生物活性形式和能在体内转化为生物活性形式的前体。因而维生素D被理解为特别包括：维生素D₂、维生素D₃和它们的代谢产物。维生素D2(9，10—断麦角甾—5，7，10[19]，22—四烯—3—醇是维生素D的合成形式(Inhoffen，Angew.Chem.72：875，1960)，其生物活性代谢产物是25—羟麦角钙化醇(Suda等，Biochem.Biophys.Res.Comm，35：182，1969)。这些化合物的其它代谢物形式和相似物也可用，包括1—α羟基维生素D₃，25—羟基维生素D₃、24，25—二羟基维生素D₃、1，25—二羟基维生素D₃、25—羟基维生素D₂、1，25—二羟基维生素D₂，24，25—二羟基维生素D₂和本领域中所知的其它化合物。优选的化合物是维生素D₃(9，10—断胆甾—5，7，10[19]—三烯—3—醇)，最优选此化合物的生物活性形式，1α，25—二羟基胆钙化醇，两种都有商业成品可供利用。

在一个实施方案中，此发明在于在体外刺激成骨细胞生长。成骨细胞常源于一种原代培养物，即培养物直接取自含有异种细胞群的组织。来自骨组织的原代培养物可含破骨细胞、成纤维细胞，成骨细胞祖细胞和内皮细胞。原代培养物可用几种已为大家熟知的方法建立。例如：在胶原酶存在下孵育研磨后的胎儿颅盖骨可用于建立原代培养物。将被胶原酶消化而分散的细胞收集起来进行培养(Aubin等，J.of cell Biol.，92：452—461，1982)。替代的方法是用新分离的骨碎片，骨碎片用胶原酶处理，清洗后培养，使细胞从骨碎片上迁移下来，并使用选择性地使胶原酶处理后成骨细胞生长的低Ca²⁺培养基(Robey等，Calif.Tiss.37：453—460，1985)。在一原代培养物中，成骨细胞的鉴定主要是依表型。成骨细胞的表型标志包括碱性磷酸酶的表达(Manduca等，J.Bone Min.Res.8：281，1993)，1型胶原合成酶(Kurihara等，Endocrinol.118(3)：940—947，1986)，骨钙蛋白的产生(Yoon等，同上)和对甲状旁腺激素的应答性(Aubin等，同上)。成骨细胞通常在37℃、5％CO₂环境中培养在生长培养基中，培养基中包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、无机物和通常由胎牛血清供给的生长因子。种种合适的培养基在本领域中已熟悉。

本发明也可用于刺激已建立起的成骨细胞系生长，这利细胞系的实例包括：Saos—2，一种人原发的骨源性肉瘤(ATCC No.HTB85)；U—2os，一种人原发的骨源性肉瘤；(ATCC No.HTB 964)HOS(TE85)一种人原发的骨源性肉瘤(ATCC No.CRL 1543)；MG—63，人的一种骨肉瘤(ATCC No.CRL 1427)和UMR 106，大鼠的一种骨肉瘤(ATCC No.CRL 1661)。

本发明的另一个实施方案中，含PDGF和维生素D的组合物被用于治疗中以增强成骨细胞介导的骨形成。本发明的方法可用来促进骨缺陷和缺损的修复，象那些闭合的、开放的，不连合的骨折；促进整复外科中的骨的愈合；刺激骨向内生长至不粘合的再造关节和齿状植入物中；牙周疾病和缺陷的治疗；在分散骨生成期间增加骨形成；其它可用刺激成骨细胞活性的方法来治疗的骨骼疾病的治疗，象骨质疏松和关节炎。

本发明的组合物可局部或全身给药。局部给药可注射到损伤或缺陷部位，或者用固体载体植入或附着在损伤部位，或直接将粘性液体进行表面涂抹。

生物活性的PDGF和维生素D向损伤部位的运送可通过应用一种控制释放的组合物来加强，象美国未决专利申请No.07/871，246中所描述的(相应于Wipo公布的WO 93/20859)，此申请整个并入此作为参考。简言之，制备含有PDGF的生物可降解的聚酯膜，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚二噁烷酮或聚乳酸/聚乙醇酸共聚物膜，并制成钉、板、螺钉等等，以附着或置于骨内。这种组合物提供PDGF在靶位点持久地释放。优选50：50 PLA：PGA膜。这些膜可进一步含有载体，象白蛋白、聚氧乙烯脱水山梨糖醇去污剂或谷氨酸。当包含白蛋白时，PDGF与白蛋白的比例一般维持在0.125和0.5μg/mg。原则上讲，任何加强聚合物降解、在膜上造成孔洞或减少生长因子对膜的吸收的物质，都可用为载体。白蛋白是尤其优选的载体。作为载体很有用的聚氧乙烯脱水山梨糖醇去污剂包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油醇酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯。

这类膜作为假肢装置和外科植入物的包衣是特别有用的。例如，此膜可包在外科螺钉、杆、针、板等等的外表面。这类可植入的装置在矫形外科是常规使用的。此膜也可用来包裹骨性充填物，如经磷灰石块，去矿物质的骨基质填料，胶原基质等等。一般来说，如文中所述及的膜或装置应用在骨的骨折部位。使用方法一般是用标准的外科操作植入骨内或附着于表面。

除了上述所提的共聚物、生长因子和载体，生物可降解膜可包括其它活性或隋性成份。特别有意义的是那些促进组织生长或浸润的因子。促进骨生长的因子，如骨形态发生蛋白(U.S.Patent No.4，761，471；PCT Publication WO 90/11366)骨发生蛋白(Sampath等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7109—7113，1987)和NaF(Fencer等，J.Biomed.Mat.Res.23：571一589，1989)尤其优选。

装载膜时，PDGF和载体作为粉末或溶液施于膜上。例如，冻干的PDGF和白蛋白可被均匀地分散到膜的一个表面，再将膜折起来。还可选择的是，蛋白质可以水溶液形式(如在磷酸缓冲盐水或0.1M乙酸溶液中)施加，再让其干燥。

含PDGF的生物可降解物质可根据本领域中所知步骤制成种种内植物，即为植入或附着在骨折部位或其它损伤部位而制成的针、板，填料、螺钉等等。

生物可降解物通常配成每克共聚物含0.0375—1.25μg的PDGF。

局部投送PDGF和/或维生素D的替代方法包括：ALIFT渗透微量泵的应用(ALza，Corp.Palo Alto，CA)；如Wang等人(WO90/11366)揭示的缓释基质；Bao等人(WO92/03125)揭示的带电右旋糖酐珠；如Ksander等人(Ann.surg.211(3)：288—294，1990)揭示的胶原为基础的投送系统；Beck等人揭示的甲基纤维素凝胶系统(J.Bone Min.Res.6(11)：1257—1265，1991)和Edelman等人(Biomaterials，12：619—626，1991)藻酸盐作基础的系统。其它为本领域所熟知的维持骨中持续投药的方法包括可浸润的多孔的包被金属假肢，坚固的并有治疗组合物结合于其中的塑料杆。

本发明中全身给药的组合物投送，可通过将PDGF和维生素D其中一个或都偶合到靶分子上的方法来加强。“靶分子”是结合到所感兴趣的组织上的分子。例如，骨靶分子包括四环素；钙黄绿素；磷酸二糖；多聚天门冬氨酸；多聚谷氨酸；氨基磷蔗糖；已知与骨的无机化阶段有关的肽，如滑粘连蛋白、骨涎蛋白和骨桥蛋白；骨特异性抗体；具有骨无机粘合区的蛋白等等。例如见Bentz等人(EP0512844)和Murakami等人(EP 0341961)所披露的。

本发明中所用的组合物可为药物学上可接受盐的形式，特别是酸加成盐，包括有机酸盐和无机酸盐。这些盐的例子包括有机酸、象甲酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、乙二酸、丁二酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸、苯甲酸、水杨酸等。碱性氨基酸残基的酸加成盐，按本领域技术人员熟知的步骤，用合适的酸或无机物处理肽而制备，或者用真空冷冻干燥法由合适的酸直接得到所需的盐。这些盐进一步制成注射用药、表面用药和水溶液制剂，以便局部或系统投送本发明的组合物。生产注射用药、表面用药的原料和方法见Remington′s Pharmaceutical Sciences，17ed.，1985，其整个并入本文作为参考。

本发明中，一种组合物的“有效量”是指出现统计学上显著效果的用量。离体情况下刺激成骨细胞生长时，一般要求引起生长增加最少50％，用测定结合3H—胸腺嘧啶脱氧核苷的方法来进行测算，与生长在有PDGF存在无维生素D存在情况下的细胞进行比较。在治疗应用中，有效量是指在骨折修复、骨质疏松情况下骨质丢失的逆转、骨折不连合和分散骨发生时刺激并增强骨生成，增加和/或加速骨向假肢装置内生长和牙损害的修复中治愈率在临床上有显著提高所需要的含PDGF和维生素D的组合物的量。在某种程度上，这样的剂量将取决于要治疗的具体状况和其它一些因素，这些对于本领域技术人员来说是明显的。例如，在骨质疏松时，骨形成增加呈现为治疗组与对照组的骨质量相比在统计学上有显著性差异。比如，此可看为骨质量增加10—20％或更多。临床上愈合的显著性提高的测量方法包括，如打击力度和张度、打击强度和扭转、4—点弯曲试验和其它为本领域技术人员所熟知的生物力学实验。治疗方案总的指导来自在相应疾病的动物模型上所进行的实验。

用维生素D经全身给药法治疗70kg重的病人优选剂量范围约1ng—1mg，约10ng—500ng更可取，约20ng—1μg最好。局部给药且与PDGF联合应用的维生素D优选剂量范围约1ng—1mg，约5ng—500ng更满意，10ng—100ng最佳。

全身给药治疗70kg的病人，PGDF的优选剂量范围为约1pg—10mg，100pg—1mg更可取，10ng—100μg最佳。与维生素D联合应用的PDGF，局部给药的剂量范围为约1ng—10mg，1μg—1mg更满意，10μg—500μg最佳。一般来说，持久释放的组合物要配成能供给所述剂量范围的较高界限的剂量。用释放速度调节剂量。液体配方通常含PDGF1—1000μg/ml，10—500μg/ml更好。

离体情况下，优选的PDGF浓度范围为约1ng/ml—100ng/ml，5ng/ml—40ng/ml更好，6ng/ml—20ng/ml最好。

已发现PDGF与维生素D按比例6∶0.1至6∶1000(PDGF：VD)结合，二者协同作用发挥较好，优选6∶1至6∶500，更优选6∶10至6∶100更合适，约6∶40最好。

上文所述的组合物根据要治疗的对象的情况，用药时间可从一天至6个月或更长。一般地，给药从一天5次至一月一次，从一天一次至一月一次更好，直到愈合基本完成。实际的治疗方案取决于象病人的年龄和一般状况、要治疗对象的情况、投药的方案这些因素。台疗方案的决定是属专业领域内常规技术水平范围。

本发明通过下列非限定例子来说明。实施例I

建立猪原代成骨细胞培养物。取未成年猪(约30 1bs)股骨的小梁骨部分，骨切成小片，约2×2mm，在室温下用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗多次，洗去所有的血。骨片置于用Dulbecco′s培养液(DMEM)(Fred Hutchinson Cancer Research Center，Seattle，WA)稀释的1mg/ml的溶血梭状芽胞杆菌II型胶原酶(Sigma Chemical Co.，st.Louis，MO)溶液中，溶液用前要过滤除菌。骨片在含胶原酶的培养液中，在37℃孵育2小时，并时常摇动。孵育后倒掉培养液，骨片置于PBS中冲洗，直至冲洗下的液体中不再出现细胞。

骨片低密度地置于含10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logan，UT)、1mM丙酮酸钠和0.29mg/mlL—谷氨酰胺的Eagles—MEM培养基中(GLBCO—BRL，Gaithersburg，MD)，在37℃、5％CO2环境中孵育，每4—5天换一次培养液，7—10天可见成骨细胞从骨片上移下来。细胞一旦汇合，立即用来鉴定，然后弃掉。

对细胞进行碱性磷酸酶表达试验以确定成骨细胞表现型。用AP组织化学染色试剂盒86R(Sigma，st.Louis，MO)，按生产者的说明书对细胞进行组织化学染色。结果显示，异种原代细胞群有30—70％是碱性磷酸酶阳性细胞，增大细胞密度，Ap⁺细胞的百分比增多。实施例II

在PDGF—BB、PDGF—BB和1α，25-二羟胆钙化醇及1α，25—二羟胆钙化醇单独存在的情况下对原代成骨细胞(按上述方法准备的)进行相对促有丝分裂活性试验。促有丝分裂活性是根据Raines和Ross(Meth.Enzymology 109：749—773，1985)的方法，通过测量3H—胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入而进行鉴定的。简言之，将置于含10％胎牛血清的(FCS)的Eagle MEM培养液(GIBCO—BRL，Gaither-burg，MD)中的猪原代成骨细胞以3×10⁴个/ml的密度铺于96孔培养板，让其生长3—4天，即可得静止期猪原代猪成骨细胞。吸去培养液，每孔加入180μl含0.1％FCS的DFC(表1)。半数孔加入10nM1α，25—二经胆钙化醇(Biomol.Research Labs，plymath Mereting，PA)，细胞在37℃、5％CO₂环境中培养3天。因1α，25—二羟胆钙化醇是用乙醇溶解的，因此，另一组孔含有等量的乙醇作为加入1α，25—二羟胆钙化醇的对照。加入20微升10×PDGF，以使最后浓度在0.2—50ng/ml。阴性对照设置为不加PDGF—BB和+/-维生素D，培养板在37℃孵育20小时，移出培养液，每孔加入含0.1％FCS和2μci/ml³H—胸腺嘧啶脱氧核苷的DFC 100微升，再在37℃下孵育3小时。吸掉培养液，每孔加入150μl的胰蛋白酶，在37℃下孵育直至细胞分离(至少10分钟)。分离的细胞用LKB Wallac 1295—001细胞采集器(LKB Wallac，Pharmacia，Gaithersburg，MD)收集到滤纸上，滤纸在微波炉中加热10分钟干燥，如供货商所描述的那样在LKB Bataplate 1250闪烁记数器中计数(LKB Wallac)。

                    表1250ml Dulbecco改良的Eagle’s培养液(DMEM)250ml Han′s F12培养液0.29mg/ml L—谷氨酰胺1mM丙酮酸钠25mM HEPES(Sigma，st.Louis，MO)10μg/ml胎球蛋白(Aldrich，Milwaukee，WI)50μg/ml胰岛素(GIBCO—BRL)3ng/ml硒(Aldrich，Milwaukee，WI)20μg/ml转铁蛋白(JRH，Lenexa，KS)

结果如图1所说明的，显示了在猪原代成骨细胞培养中PDGF—BB刺激胸腺嘧啶脱氧核苷的摄取，6—10ng/ml时刺激效应最大。在有10nM 1α，25—二羟胆钙化醇存在时，胸腺嘧啶脱氧核苷的摄取则是最大摄取量的2倍。在1α，25—二羟胆钙化醇单独存在时，没观察到生长刺激作用。实施例III

为确定是否1α，25—二羟胆钙化醇和PDGF必须同时存在才能观察到二者的协同的生长效应，进行了有丝分裂鉴定。方法同例II中所述的，但做了下列改动：a)1α，25—二经胆钙化醇的最后浓度是100nM；b)附加组的孔移走用于预处理细胞的含1α，25—二羟胆钙化醇的培养液，加入仅含合适稀释度的PDGF的新鲜培养液，造成有PDGF存在而无1α，25—二羟胆钙化醇存在的环境。

结果如图2所说明的，表明PDGF和1α，25—二羟胆钙化醇必须同时存在才能观察有丝分裂的2倍增多。实施例IV

为确定1α，25—二羟胆钙化醇在PDGF诱导的猪原代成骨细胞有丝分裂中的作用是否剂量依赖性的而进行了如例II所述的并做了如下改动的鉴定：a)1α，25—二羟胆钙化醇浓度范围从0.01nM至100nM：b)PDGF以单一的浓度6.2ng/ml存在。结果如图3所示，表明PDGF和1α，25—二羟胆钙化醇的协同效应随1α，25—二羟胆钙化醇的浓度而变。实施例V

为确定所见的效应是否是维生素D特异性地针对PDGF的，对维生素D进行了与基础的成纤维细胞生长因子(FGF)结合的试验。人的重组体基础FGF(BRL—GIBO)在如例II所述的促有丝分裂鉴定试验中，从浓度0.4ng/ml至100ng/ml进行试验。结果如图4所示，显示应用基础FGF和1α，25—二羟胆钙化醇，没有协同效应出现。实施例VI

进行鉴定实验以确定成纤维细胞，这种在从骨进行原代培养中的一种潜在的污染细胞类是否引起所见的PDGF和1α，25—二羟胆钙化醇的协同效应，用小鼠成纤维细胞系Swiss 3T3(ATCC No.CCL92)进行了例II中所述的鉴定实验，不同之处是成纤维细胞以3×10⁴个/ml的密度铺于含10％FCS的DMEM中。结果如图5所示，表明1α，25—二羟胆钙化醇不影响PDGF诱导的这些成纤维细胞的有丝分裂作用。实施例VII

为验证在成骨细胞所见的1α，25—二羟胆钙化醇和PDGF协同作用，用已建立的小鼠成骨细胞系MC3T3(Suda等，J.Cell Biol.96：191—198，1983)进行试验。除了细胞是在含10％FCF的α—MEM培养液(GIBCO—BRL)中以3×10⁴个/ml的密度铺板外，鉴定试验基本同例II中所述。与Swiss 3T3成纤维细胞和猪原代成骨细胞不同，1α，25—二羟胆钙化醇抑制MC3T3细胞生长。因此根据胸腺嘧啶脱氧核苷摄取的诱导倍数(fold—induction)对资料进行了分析。诱导倍数的定义为在有PDGF存在时掺入³H—胸腺嘧啶脱氧核苷的闪烁记数的次数/分(cpm)与无PDGF存在时的比率。结果如图6所示，显示了PDGF在有1α，25—二羟胆钙化醇存在时诱导的诱导倍数较无维生素D存在时的大。实施例VIII

为证实猪原代骨细胞培养中的成骨细胞对PDGF和1α，25—二羟胆钙化醇的应答，用有丝分裂和碱性磷酸酶表达试验进行鉴定。在相同细胞中，对猪原代骨细胞进行了³H—胸腺嘧啶脱氧核苷摄取和成骨细胞标记碱性磷酸酶表达试验。猪原代骨细胞铺板和处理如上所述，有以下不同：a)细胞铺于Lab—tek腔载物片，型号177445(All world Seientific，Seattle，WA)；b)PDGF—BB用100ng/ml一个浓度；c)1α，25—二羟胆钙化醇用10nM一个浓度。³H—胸腺嘧啶脱氧核苷结合后，载物片用PBS洗三遍，按前文所述的方法进行碱性磷酸酶表达染色。染色后，风干载物片，用NTB3乳剂(Kodak，Rochester，NY)覆盖。让乳剂风干，载物片在4℃暴露一个星期，之后在室温下置于D—19显影剂中显象5分钟，用水漂洗，在快速定影剂(Kodak)中固定5分钟。用美蓝(sigma)复染，美蓝按1∶100稀释于水中作用细胞1分钟。

表达碱性磷酸酶(Ap⁺)的细胞呈粉色能被辨认出，而掺入了³H—胸腺嘧啶脱氧核苷的细胞通过其核周银色颗粒的积聚而被辨认出。无PDGF—BB存在的，结合³H—胸腺嘧啶脱氧核苷的细胞仅2—4％，且百分比不受加入1α，25—二羟胆钙化醇的影响。加入PDGF—BB能使与³H—胸腺嘧啶脱氧核苷结合的细胞百分比增加10倍。Ap⁺和AP^-细胞都与PDGF—BB反应。算出在与PDGF反应中有无1α，25—二羟胆钙化醇存在情况下与³H—胸腺嘧啶脱氧核苷结合的AP⁺细胞百分比，对AP^-细胞进行同样的计算。结果概括于表2中。加1α，25—二羟胆钙化醇能增多与胸腺嘧啶脱氧核苷结合的Ap⁺细胞数，几乎2倍，而AP^-细胞数却增加较少。这些结果表明，经它们的AP表达而辨认出的培养的成骨细胞显示了对1α，25—二羟胆钙化醇和PDGF的协同性应答。对1α，25—二羟胆钙化醇和PDGF呈现协同反应的AP^-细胞可以是或不是成骨细胞，因为成骨细胞在它们整个分化阶段不表达AP。

               表2

掺入³H—胸腺嘧啶脱氧核苷的细胞细胞群            无维生素D    有维生素D碱性磷酸酶阳性    31％         55％碱性磷酸酶阴性    41％         54％实施例IX

已知维生素D在体外颅盖骨实验时加入，是骨吸收的一有效刺激物，在此实验中，PDGF显示轻微的骨吸收作用。因为骨吸收对刺激骨形成来说是禁忌，因而对PDGF和维生素D在骨吸收实验中的相互作用进行了评价。

包括带有矢状缝的顶骨在内的颅盖骨取自4天大小的CD—1小鼠(Charles River Laboratories，San Diego，CA)。骨置于6孔Petri养皿(American Science Products，McGraw Park；IL)内，其中加有1ml生长培养液(DMEM、0.29mg/ml L—谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和15％加热灭活的马血清(HIHS))，在37℃，5％CO₂环境中孵育24小时，并轻轻摇动。孵育后，从孔中吸出培养液，换为1.5ml含200ng/ml PDGF—BB，10^-8M 1α，25—二羟胆钙化醇或PDGF和维生素D都有的生长培养液。每个样本组5块骨，标本在37℃、5％CO₂环境中摇动着孵育72小时。孵育后，从孔中取出培养液，用NoVA—7总钙分析仪(Nova Biomedical，Waltham，MA)按使用说明书分析培养液中的Ca²⁺水平。除样本培养液外，也对来自24小时孵育的培养液进行分析，以保证在取标本过程中无骨损害。损伤的骨释放高水平的钙进入培养液，不能用于最后的分析。

结果如图7中所示，PDGF和1α，25—二羟胆钙化醇分别加到颅盖骨时都刺激骨吸收。然而，当PDGF和1α，25—二羟胆钙化醇联合加入时，可见由于骨吸收造成的Ca²⁺释放水平较维生素D状态时降低了，提示PDGF的抑制效应。实施例X

为试验PDGF和维生素D协同增加骨向内生长进入多孔的羟磷灰石内植物的能力，用有190—230μm孔洞的羟磷灰石车出25mm长、直径4mm的圆柱状内植物(Interpore，Irvine，CA)。圆柱有一1mm长和直径3mm的倒凹区域。内植物通过浸入PDGF溶液而载有0.5—50ng/内植物剂量的PDGF。维生素D由ALZET微量泵(ALZa Corp。)局部给药，导致10—100ng/内植物量的维生素D。PDGF与维生素D的剂量比为1∶6。装载有载体的内植物用于对照组。

24只骨骼成熟、平均体重3.5kg的NEW Zealand白兔用于研究。用5.0mg/kg xylazine和35.0mg/kg氯氨酮半量注射入每块副棘状肌肉进行麻醉。然后，动物进行气管插管，用氟烷维持麻醉。

骨髓内植物用自远端逼近法植入(Anderson等，J.Orthop.Res.10：588—595，1992)。在副髌骨侧做一2.5cm侧切口，沿髌骨韧带的侧边进入膝，用腿牵张术造成髌骨侧脱位。4.0mm的钻头直接就近导入股骨髁之间，一旦通过关节软骨和干骺端骨，证明孔探查到了髓内定位部分。内植物就近插入并推向其最终部位，用骨蜡填塞远端的入口。伤口用4—0号可吸收的缝线和不锈钢线逐层缝合。

做组织学和生物力学分析。做横截面切片，制出长3.5mm的带有内植物的股骨标本，以便对下列区域进行研究；近端股骨的邻近小梁区，骨缝部位和股骨近中端的邻近内膜层。每一部位的标本对切成两份：一份用于组织学研究，另一份用于生物力学研究，每一个实验部位与来自对侧股骨的装有载体的对照部位进行比较。

组织学标本在磷酸缓冲的甲醛溶液中固定，在一系到浓度逐渐增高的乙醇中脱水：95％乙醇24小时，然后l00％乙醇每24小时换一次，换三次，最后100％乙醇处理过的标本，用二甲苯清洁两次，每次24小时。向塑料包埋物浸润的组织被取出。如Bain等人所述(Stain Technol.65(4)：159，1990)的，标本向塑料柱方向横切，在室温下，埋于甲基丙烯酸酯树脂塑料内，置于氮气真空干燥器中。用低速金钢轮锯(Struers Accutom—2，Torrance，CA)从每一个标本部位制成150μm的切片，然后将厚片置于覆有1200grit金钢砂布的两片玻璃载玻片之间，手磨成约30μm的片子。磨成的片子用Immuno—Mount(Shandon，Pittsburgh，PA)封固在玻璃载物片上。

骨向内植物生长的区域特性和骨形成的动力学指标用Bioquant骨形态测定法程序(Biometrics，Inc.，Nashville，TN)测定，此程序是照相机Lucida与Olympus BH—2光/发荧光显微镜相连(ScicntificInstruments，Inc.，Redmond，WA)。向内植物内生长的总骨用荧光显微镜在×40放大倍率下测出。无机盐附着和骨形成的参数在×100倍下，从体内荧光标志测定。在内植物界面，用平均内标记宽度除以内标记时间周期计算无机物附着率。总的骨生成率是通过扫描新形成的骨区(如被荧光标记物结合的骨)，用总的新骨区除以内标记时间而得。

骨向内生长是用推出试验进行力学评价的。要试验的标本固定于Instron试验仪器上，向内植的中心部施以恒定力0.5mm/s。推出内植物所需的力，用生物力学试验步骤确定。此过程如Knowles等人(Biomaterials，13(8)：491—496，1992)所披露的，已为本专业领域技术人员所熟知。实施例XI

在新生大鼠股骨和5周的小鼠颅盖骨中用PDGF、维生素D或PDGF与维生素D结合来测定PDGF—BB和维生素D刺激骨膜骨生长的能力。在股骨的试验中，所用PDGF的剂量范围是每天2—200ng，维生素D的剂量是每天20ng—2μg。连续10天向新生大鼠仔(2—3天)左股骨中前段骨膜注射化合物，对侧股骨作为载体对照。5天时腹膜内注射四环素(10mg/kg)，17天和22天时腹膜内注射钙黄绿素(10mg/kg)，骨被标记以做组织形态测量。每个治疗组8个大鼠仔。第24天动物被处死，取出两侧股骨，加工以做未脱钙骨组织形态测定。

颅盖骨生成的检查是将PDGF，维生素D或PDGF与维生素D联合经皮下注射至附于矢状缝部的内膜组织而进行试验的。每天注射一次共10天。PDGF的剂量为每天2—200ng，维生素D剂量为每天20ng—2μg。用1天时腹膜内注射四环素，18天、25天时腹腔内注射钙黄绿素的方法来标记新骨形成以做测量。收集颅盖骨并加工做组织学评价。

虽然为达清楚理解的目的，前述的发明在某些细节方面已用图示说明和实例进行了详细描述，但很明显，在所附权利范围内，可进行一些改变和补充。