氧降低的因子VIII水溶液

摘要

本发明涉及一种在降低了氧浓度的水溶液中含有凝固因子VIII的最终药品。用这种方法，在贮藏过程中因子VIII活性可保持到意想不到的高度。如果最终药品还含有一种惰性气体和/或一种抗氧化剂，因子VIII活性可保持更长时间。本发明还涉及降低水溶液氧浓度的方法，以及一种通过在惰性气体环境下贮藏溶液而改进因子VIII稳定性的方法。通过本发明，在温度为2至10℃，溶液pH为6.5至8.5下贮藏至少6个月后，可能至少保持因子VIII初始活性的50％。

说明书

本发明涉及一种在降低了氧浓度的水溶液中含有凝固因子VIII的最终药品。用这种方法，在贮藏过程中因子VIII活性可保持到意想不到的高度。如果最终药品还含有一种惰性气体和/或一种抗氧化剂，因子VIII活性可保持更长时间。本发明还涉及降低水溶液氧浓度的方法，以及一种通过在惰性气体环境下贮藏溶液而改进因子VIII稳定性的方法。通过本发明，在温度为2至10℃，溶液pH为6.5至8.5下贮藏至少6个月后，可能至少保持因子VIII初始活性的50％。

在制药工业中，蛋白质的稳定性是一个普遍问题。经常借助各种干燥方法(如冷冻干燥)干燥蛋白质来解决这一问题。所以蛋白质是以干燥的形式输送和贮藏的。为避免干燥过程以及贮藏和输送过程中显著的活性损失，干燥或冷冻干燥前的溶液、干燥的原料和复水(reconstituted)产品都应是稳定的。

制造商品时，冷冻干燥工艺是一个费用高且费时的工艺步骤，如能避免这一步骤将是非常有利的。此外，使用前病人必须把干燥的蛋白质溶解于溶剂中，这对病人来说是不方便的。

血友病是一种为人所知已有几个世纪的遗传疾病，但只是在过去三十年中才能把各种类型区分开来：血友病A，血友病B和血友病C。血友病A是最常见的类型。它只作用于男性，发病率为1或2个每10000个成活男性。这种疾病是由生物活性的凝固因子VIII(抗血友病因子)的水平急剧降低或没有凝固因子VIII引起的，凝固因子VHI是血浆中正常存在的一种蛋白质。血友病A的临床表现是强烈的流血倾向，而且在引入用因子VIII浓缩物治疗之前，那些病人的平均寿命低于20岁。得自血浆的因子VIII浓缩物的供应已有大约三十年。这已大大改进了血友病病人的治疗状况并且给予他们正常生活的可能性。

至今，通过血浆的分级分离来制备治疗用因子VIII浓缩物。然而，现在已有用重组DNA技术在细胞培养中生产因子VIII，例如，象在J.Gitschier等，Nature 312，P.330—37，1984和EP—A—160457中报道的那样。

得自人血浆的因子VIII浓缩物含有几种片断的完全活性因子VIII结构(Andersson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol83，P.2979—83，May 1986)。最小的活性结构具有170kDa的分子量，含有由一金属离子桥连接的90kDa和80kDa的两条链。这里涉及EP—A—197901。

Kabi Pharmacia已开发了一种重组因子VIII产品，它与治疗用因子VIII浓缩物中的170 kDa血浆因子VIII结构相一致。缺失的重组因子VIII的分子被称作r—VIII SQ，在细胞培养过程中由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在无血清培养基中有限转接而产生的。

r—VIII SQ的比活性约为15 000IU VIII：C每mg蛋白质。

重组因子VIII SQ用于治疗典型的血友病。用量与血浆因子VIII浓缩物的用量相似。

重组因子VIII产品的一般结构和生物化学已由Kaufman在Tibtech，Vol.9，1991和Hematology，63，P.155—65，1991中作了描述。在WO—A—91/09122中已描述了r—VIII SQ的结构和生物化学。

已从血浆中分级分离的因子VIII通常是以冷冻干燥的粉末形式出售的，它应该用水溶解。

在纯化，无菌加工过程中，在包装中或给药过程中，含有少量蛋白质的配方通常会损失活性。通常通过加入能大大降低活性蛋白质损失的人清蛋白来解决这个问题。在纯化，无菌加工和冷冻干燥过程中，人清蛋白起到一般稳定剂的作用(参见Wang等的综述，J.of Parenteral Sci.and Tech.Vol42，Number 2S，Supplement.1988)。清蛋白用于因子VIII的稳定已为人知，并且目前用于市场上所有高度纯化的因子VIII产品。

然而，最好能避免向由重组DNA技术生产的治疗用蛋白质中加入人清蛋白。另外，将人清蛋白用作配方赋形剂往往限制许多用于蛋白质特征的最有力而灵敏的分析方法的应用。

已经推荐了几个用于稳定不同蛋白质的解决方案。例如，EP35 204(Cutter)公开了一种在多羟基化合物存在下给予蛋白质成分热稳定性的方法。另外，WO—A—89/09614(Genentech)公开了一种含有甘氨酸、甘露糖醇的人生长激素的稳定配方，而且公开了一种缓冲液，在一个优选实施方案中加入一种非离子表面活性剂如吐温80。加入非离子表面活性剂是为了减少凝集和变性作用。在冷冻干燥配制和溶解中，这种配方的稳定性提高了。US—A—4783441(Hoechst)公开了一种含有一种蛋白质(如胰岛素)和一种表面活性物质的水溶液。

EP77870(Green Cross)公开了为改进含因子VIII的溶液的稳定性而加入氨基酸、单糖、寡糖或糖醇或羧酸。EP117064(Green Cross)公开了为提高热处理过程中的稳定性而向因子VIII的水溶液中加入糖醇或二糖。

WO—A—91/10439(Octapharma)要求保护含有一种二糖(优选蔗糖)和一种或多种氨基酸的因子VIII或因子IX的稳定注射液。EP315968和EP314095(Rorer)要求保护具有不同离子强度的因子VIII的稳定配方。

US—A—4727027(Diamond Scientific)是针对一种为使活性损失最小，将含有得自血液或血液成分的生物活性蛋白质的含水配方进行光化学净化的方法。这种方法包括向配方中加入至少一种呋喃并香豆素和用紫外(UV)线照射得到的配方。为抑制变性作用，在照射之前可以降低含水配方的氧浓度。例如，可以通过加入清除剂、清蛋白和/或酶体系和/或者通过用惰性气体清洗达此目的。在有或无抗坏血酸的情况下用氩清洗含有因子VIII的溶液6小时。US—A—4727027对贮藏溶液更长时间以及在这样的贮藏中氧浓度的降低对因子VIII的可能影响保持缄默。

EP—A—0212040(Immuno)通过在氧降低环境中加热干物质涉及到病毒钝化。既然稳定剂通过降低处理效率也可以保护病毒，就在没有稳定剂的情况下进行热处理。90℃下测试进行30分钟。EP—A—0212040对含有因子VIII的水溶液的稳定性差的问题保持缄默，这个问题通常是比干燥产品的稳定性差更难克服的问题。这是因为，溶液中的化学变化(例如水解和脱酰氨基作用)比干燥状态中的化学变化更为显著。

蛋白质在物理化学性质上是不同的。在制备生理上可接受而且能长期稳定的药剂时，不仅要考虑蛋白质的性质而且要考虑其它方面。后者的例子是，工业生产以及便于使用和对病人安全可靠。测试不同配方时不能预期这些方面的结果而且每种蛋白质往往有独特的溶液。

如果能将蛋白质配制成不加清蛋白且贮藏期长的稳定溶液，并将其供给病人，这将促进因子VIII的使用和生产。对病人而言，这样的溶液也便于最终药品的使用。这样，病人能够直接注射最终药品成分而不需溶解。

含有包括药品而不是蛋白质的氧敏感化合物的水溶液可用下面方法脱氧：

用氮气鼓泡通过注射用水以降低氧浓度。组分溶解，用氮气鼓泡通过溶液，其后，保持于氮气层下。装灌过程中，用氮气清洗瓶子，在氮气气流下封瓶。

然而，不可能通过向溶液中通气使蛋白质溶液脱氧。蛋白质溶液会大量起泡，而且如果进行这种处理许多蛋白质药品(如凝固因子VIII)会变性。因此，以前从没有人提出过含有凝固因子VIII的水溶液应在一种惰性气体(如氮气)下贮藏。

然而，我们已经发现，含有凝固因子VIII的溶液可被脱氧而没有蛋白质变性。因此，令我们惊奇的是，我们发现可在没有清蛋白的情况下稳定凝固因子VIII，而且这种氧含量低的水溶液在例如2—8℃下贮藏时是稳定的。

因此，本发明涉及一种在氧浓度降低的水溶液中含有凝固因子VIII的最终药品，在贮藏中基本保持凝固因子VIII活性。

因子VIII或者是血浆因子VIII或者是重组因子VIII。当因子VIII是重组体时，它或者是全长(full—length)形式或者优选其一种缺失衍生物。缺失衍生物更优选重组缺失衍生物FVIII SQ(r—VIH SQ)。

因子VIII活性可从10至100000IU/ml，优选从50至10000IU/ml。

实施例中使用的因子VIII是高度纯化的，即具有高于5000IU/mg蛋白质的比活性。在不加入清蛋白的情况下稳定根据本发明的成份。

或者通过将水溶液置于惰性气体环境中，或者通过先减压再引入惰性气体来降低氧浓度。优选在几次循环中重复进行后一方法。通过这种方法，溶液中氧含量可降至很低水平，而因子VIII活性没有大的损失。溶液中氧浓度可低于200ppm，低于50ppm较好，优选低于10ppm，更优选低于2ppm。可用同样方式降低所用容器中的氧含量，优选通过将容器置于惰性气体环境中。

最终药品涉及最终容器中的按配方制备的药。本发明中合适的容器是例如小玻璃瓶，注射器和注射装置。

为大体上保持低的氧含量，在惰性气体如氮气、氩气或氦气下适当地贮藏此溶液。惰性气体优选非贵惰性气体，更优选氮气。

通过向水溶液中加入抗氧化剂也可基本保持低的氧含量。因此，优选溶液还含有至少一种抗氧化剂如谷胱甘肽、乙酰半胱氨酸、甲硫氨酸、生育酚、丁基经基甲苯、丁基羟基苯甲醚或酚类化合物。优选抗氧化剂是至少一种选自谷胱甘肽、乙酰半胱氨酸和甲硫氨酸的化合物。配位剂如EDTA和柠檬酸可进一步改善因子VIII的稳定性。

抗氧化剂的量取决于所用的化合物。因此，不能笼统地给出浓度或用量。而重要的是，抗氧化剂(如果使用的话)的用量是药物上可接受的用量。

溶液合适的pH是6.5至8.5，优选约为7。

优选溶液中存在非离子表面活性剂。非离子表面活性剂(如果存在的话)优选自嵌段共聚物如Poloxamer或聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯如吐温20和吐温80。

应该以高于临界胶束浓度(CMC)的量使用非离子表面活性剂(如果使用的话)。参见Wan and Lee，Journal of Pharm Sci，63，P.136，1974。因此，优选以至少0.01mg/ml的量使用聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。

水溶液还可含有氯化钠或氯化钾，优选含量高于0.1M。

因子VIII的重链和轻链的缔合取决于钙(或其它二价金属离子)的存在。这里以氯化钙(CaCl₂)形式加入钙，但也可使用其它盐如葡萄糖酸钙、calcium glubionate或葡庚糖酸钙，优选含量高于0.5mM。

水溶液适当含有一种氨基酸如L—组氨酸、赖氨酸和/或精氨酸，含量高于1mM。可加入单糖或二糖(如蔗糖)或蔗糖。优选溶液含有L—组氨酸和蔗糖。

优选最终药品含有一种水溶液，该水溶液含有：

i)10—100000IU/ml重组凝固因子VIII

ii)至少0.01mg/ml的一种聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯

iii)氯化钠，优选含量高于0.1mM

iv)钙盐，如氯化钙或葡萄糖酸钙，优选含量高于0.5mM

v)一种氨基酸，如L—组氨酸，含量高于1mM。

vi)一种单糖或二糖或者一种糖醇，优选蔗糖或甘露糖醇。

以药物上可接受的量向这种溶液中加入一种抗氧化剂。

因此，最终药品含有一种待用的稳定水溶液。

可用一种方法制备这种要求保护的溶液，其中，凝固因子VIII与水溶液混合，或用水溶液从最后的纯化步骤洗脱凝固因子VIII。水溶液优选含有至少一种选自非离子表面活性剂，抗氧化剂，氨基酸如L—组氨酸，钠盐，钙盐和蔗糖的添加剂。

本发明还涉及一种改善凝固因子VIII在水溶液中稳定性的方法，根据此方法溶液在惰性气体环境下保藏。本发明进一步涉及一种方法，借助此方法，在温度为2至10℃，溶液pH为6.5至8.5下贮藏至少6个月后，可能至少保持因子VIII初始活性的50％甚至80％。应用本发明，在水溶液中含有因子VIII的最终药品可能贮藏12个月甚至24个月，而没有明显的因子VIII活性损失。当因子VIII是r—VIII SQ时这种方法尤其适用，因为实施例中给出的数据表明，当r—VIII SQ于5±3℃在氮气下贮藏时至少在6个月内是基本稳定的。

下面实施例阐述本发明，并且表示出将不同水溶液在氮气和氩气中处理(把在空气中作为对比)时的稳定性数据。专利保护不局限于这些实施例。实验

大体上按照专利WO—A—91/09122中所述方法生产重组因子VIII SQ(r—VIII SQ)，实施例1—3。用一个含有r—VIII SQ基因的表达型载体和一个含有二氢叶酸还原酶基因的表达型载体电击(electroporate)DHFR缺陷CHO细胞系(celline)(DG44N.Y.)。在选择培养基上选择后，存活菌落通过在逐渐增加量的氨甲蝶呤中生长而扩增。对所得菌落的上清液进行针对因子VIII活性的个体筛选。选择出生产克隆，接着使它适应于特定培养基中的无血清悬浮液生长，最后开发大规模发酵过程。一定时期后收集上清液并用下述方法纯化。

调节澄清的条件培养基的pH，将培养基加到S—SepharoseFF柱上。洗涤后，用含有5mM CaCl₂的盐缓冲液洗脱因子VIII。

在免疫亲和树脂上进行免疫吸附，其中配体是一种针对因子VIII的重链的单克隆抗体(8A4)。上柱前用0.3％TNBP和1％Octoxynol9处理S—洗出液。

将柱平衡、洗涤，用含有0.05M CaCl₂和50％乙二醇的缓冲液洗脱因子VIII。

把mAb—洗出液加到在免疫亲和步骤中用洗脱缓冲液平衡过的Q—Sepharose FF柱上。洗涤后，用0.05ML—组氨酸，4mMCaCl₂，0.6M NaCl，pH6.8洗脱因子VIII。

将Q—洗出液加到凝胶过滤柱(Superdex 200p.g.)上。用如下面实施例所给组成的配制缓冲液进行平衡和洗脱。

从最后的纯化步骤收集r—VIII SQ的疏松材料。通过用合适的缓冲液稀释来调节因子VIII的活性和非活性成分的浓度。然后，溶液被无菌过滤(0.22μm)和分散并通过在几次循环中将溶液减压再引入惰性气体来脱氧。

通过色原底物分析确定凝固因子VIII的活性(Coatest FactorVIII，Chromogenix AB，Mlndal，Sweden)。通过因子VIH作为辅因子的独特途径产生活化因子X(Xa)。接着，通过在用来防止底物被凝血酶水解的凝血酶抑制剂I—2581存在下使用合成色原底物S—2222，检测因子X(Xa)。用酸终止反应，在450nm下对照空白试剂用光测法检测VIII：C，VIII：C与pNA(对硝基苯胺)的释放成正比。因子VIII：C的单位是用WHO建立的现行国际浓度标准(IS)所规定的国际单位(IU)表示的。实施例1    空气或氮气下贮藏的溶液间的比较

根据“实验”中所述方法制备重组因子VIII。

溶液于三个不同温度下贮藏，分别是7，25℃和30℃。

小玻璃瓶中的配制体积为2ml。

                   表1组成如下：

              1A   1B     1C     1D     1E     1FL—组氨酸mM      14.7  14.7  14.7   14.7   14.7   14.7氯化钠    M      0.31  0.31  0.31   0.31   0.31   0.31氯化钙    mM     3.7   3.7   3.7    3.7    3.7    3.7聚山梨酸酯mg/ml  0.23  0.23  0.23   0.23   0.23   0.23pH               7     6     7      7      6      7液面上空间       氮气  氮气  空气   氮气   氮气   空气VIII：CIU/ml初始             267   258   267    260    259    2603个月，7℃       238   219   -      224    151    -6个月，7℃       217   186   158    204    84     201个月，25℃      220   -     -      232    -      -3个月，25℃      198   -     -      186    -      -1个月，30℃      210   181   136    210    160    83个月，30℃      158   126   26     152    54     2

从实施例清楚地看出，以溶液形式贮藏时7℃无氧条件下6个月后得到可接受的VIII：C回收率。甚至在25或30℃下仍能贮藏本发明的溶液，而没有太大的活性损失。进一步可看出，PH7下的稳定性优于pH6下的稳定性。实施例2    含有一种抗氧化剂和蔗糖的溶液

根据“实验”中所述方法制备重组因子VIII。

溶液于两个不同温度下贮藏，分别是7和25℃。

小玻璃瓶中的配制体积是2ml。

                    表2

组成如下：

                  2A     2B

氯化钠    ，M     0.31  0.31

氯化钙    ，mM    3.7   3.7

聚山梨酸酯mg/ml   0.23  0.23

L—组氨酸mM       14.7  59

蔗糖，mg/ml       200   200

谷胱甘肽mg/ml     0.3   -

乙酰半胱氨酸mg/ml -     3

pH                7     7

液面上空间        氮气  氮气

VIII：C IU/ml

初始              105   108

3个月，7℃        99    105

6个月，7℃        90    91

2个月，25℃       85    78

3个月，25℃       78    66

7℃下6个月后，两种溶液都显示出可接受的稳定性。实施例3    在空气或氮气下贮藏的含有谷胱甘肽或抗坏血酸的溶液间的比较

根据“实验”中所述方法制备重组因子VIII。

溶液于25℃下贮藏。

小玻璃瓶中的配制体积是2ml。

                     表3组成如下：

              3A    3B     3C     3D     3E     3FL—组氨酸mg/ml   2.27  2.27   2.27   2.27   2.27   2.27氯化钠    .mg/ml 18.1  18.1   18.1   18.1   18.1   18.1氯化钙    ，mM   3.7   3.7    3.7    3.7    3.7    3.7吐温80  ，mg/ml  0.23  0.23   0.23   0.23   0.23   0.23谷胱甘肽，mg/ml  0     0      0.3    0.3    0      0抗坏血酸，mg/ml  0     0      0      0      4      4 pH              7     7      7      7      7      7液面上空间      氮气  空气    氮气   空气   氮气   空气VIII：C IU/ml

初始         231   231    225    225    220    220

1个月        212   15     203    170    169    2

2个月        200   6      177    113    -      -

3个月        210   -      163    -      -      -

氮气下贮藏2个月后，因子VIII活性保持在初始值的80％左右或更高。这与有无谷胱甘肽无关。然而，当在液面上方有空气的情况下贮藏溶液时，谷胱甘肽可使稳定性大大提高。抗坏血酸降低因子VIII的稳定性。实施例4在空气或氩气下贮藏的含或不含谷胱甘肽的溶液间的比较

根据“实验”中所述方法制备重组因子VIII。

溶液于两个不同温度下贮藏，分别是7和25℃。

小玻璃瓶中的配制体积是2ml。

                   表4组成如下：

                4A    4B    4C     4D    4E    4FL—组氨酸mg/ml     2.29  2.29   2.29  2.29  2.29  2.29氯化钠    ，mg/ml  18.1  18.1   18.1  18.1  18.1  18.1氯化钙    ，mM     3.7   3.7    3.7   3.7   3.7   3.7吐温80    ，mg/ml  0.23  0.23   0.23  0.23  0.23  0.23谷胱甘肽mg/ml      -     0.6    0.6   -     0.6   0.6pH                 7     7      7     7     7     7贮藏温度    ，℃   25    25     25    7     7     7液面上空间         氩气  氩气   空气  氩气  氩气  空气VIII：C IU/ml

初始           234   176    234   234   176   234

1个月          213   157    133   232   172   160

2个月          187   139    90    200   153   148

3个月          185   138    72    207   159   131

4个月          158   116     -    186   144   125

6个月          149   111     -    188   147   114

9个月          -     -       -    130   106    67

氩气下于25℃贮藏6个月后，因子VIII活性保持在初始值的65％左右或更高。7℃贮藏后，相应值为80％或更高。