脑蛋白水解液—脑乐注射液的制备方法

摘要

本发明提供了一种从动物脑、特别是猪脑中提取脑蛋白水解物——脑乐的方法，本发明还提供了所述脑蛋白水解物的注射液及其制备方法。

说明书

本发明涉及一种从动物、特别是猪脑中提取脑蛋白水解物一脑乐的方法，本发明还涉及所述脑蛋白水解物的注射液及其制备方法。

脑蛋白水解物最早由奥地利EBEWE药厂以Cerebrolysin为商品名出售，其中含有多种人体必需的氨基酸以及非必需氨基酸，并且含有分子量为10，000或更低的肽。尽管其应用早已公开（参见EP452299等），但是其提取方法至今未见报道。

本发明的目的在于提供一种从动物脑、尤其是猪脑中提取脑蛋白水解物（下文简称为“脑乐”）的方法。

本发明的另一个目的是提供制备脑乐注射液的方法。

下文将详细说明本发明的目的。

图1概括了脑乐的提取方法及制备成注射液的方法；

图2为进口脑活素注射液对照品肽含量HPLC色谱图；

图3为进口脑活素201468肽含量HPLC色谱图；

图4为进口脑活素901724肽含量HPLC色谱图；

图5为进口脑活素912950肽含量HPLC色谱图；

图6为脑乐注射液930401肽含量HPLC色谱图；

图7为脑乐注射液930402肽含量HPLC色谱图；

图8为脑乐注射液930403肽含量HPLC色谱图；

图9为脑活素肽Ⅱ（MW5270）纯品HPLC色谱图；

图10为脑活素肽Ⅰ（MW1770）纯品HPLC色谱图。

本文所述的脑乐注射液是通过以下过程制备的：

（1）匀浆：将新鲜猪脑去脑膜脂肪，剪成小块，于匀浆机中匀浆，重复一次，得脑匀浆液；

（2）脱脂：将脑匀浆液倒入带盖缸中，边搅拌边加入冷丙酮，然后于4℃放置4小时后，倾去上清液，重复2-3次，将沉淀物倒入瓷盘中，置通风橱吹干，研磨成粉，过筛，得脱脂干脑粉；

（3）水解：取干脑粉，加酶液，置37℃水浴保温8小时，然后离心，弃去沉淀物，得到水解液；

（4）浓缩：将水解液用旋转薄膜蒸发器浓缩；

（5）离心：浓缩液用冷冻、高速、大容量离心机离心（10000-20000rpm），取上清液；

（6）超滤：离心后的上清液经超滤器一万分子量截留膜超滤，得到棕黄色澄明溶液；

（7）精制：将超滤后的溶液经DEAE-Sephadex    A-25柱色谱分离，用Tris-HCl缓冲液和含NaCl的缓冲液洗脱，用紫外分光光度计监测，并收集各主峰馏分，得精制清液；

（8）灭菌：将所得精制清液灭菌，得无菌注射液。

实施例：

取新鲜猪脑，去脑膜脂肪，剪成小块，于匀浆机中两次匀浆。将匀浆液倒入带盖缸中，边搅拌边加入冷丙酮，然后于4℃放置4小时，倾去上清液，重复此过程两次。将沉淀物倒入瓷盘中，置通风橱中吹干，研磨成粉，过筛，得脱脂干脑粉。向干脑粉中加入酶液，于37℃水浴中保温8小时，然后离心，弃去沉淀，得水解液。用旋转薄膜蒸发器浓缩水解液。将浓缩液于冷冻、高速、大容量离心机上离心（15000rpm），取上清液。将离心后的上清液经超滤器一万分子量截留膜超滤，得棕黄色澄明溶液。所得溶液经DEAE-Sephadex    A-25柱色谱分离，方法如下：

（1）配制Tris-HCl缓冲液，作为基础缓冲液；向部分基础缓冲液中加入NaCl，作为洗脱液。

（2）装DEAE-Sephadex    A-25柱（5×120cm），DEAE-Sephadex    A-25预先用Tris-HCl基础缓冲液浸泡1-2天，装柱后用基础缓冲液平衡。

（3）将超滤完的溶液用吸管缓缓加入层析柱的上面，待样品渗入胶中加少许基础缓冲液，然后封柱，启动恒流泵，控制流速为60ml/小时，每次上样6克。

（4）用洗脱液与基础缓冲液，在梯度仪容量瓶中进行梯度洗脱。

（5）流出液经紫外分光光度仪测定并绘出光密度与管数的吸收曲线，收集各主峰馏分。

（6）经HPLC凝胶柱分离该样品的肽成分，得到国内外均未报道的二个肽成分，其含量超过90%。所得馏分经灭菌制成无菌注射液。分析方法如下：

一、样品：奥地利依比威大药厂        批号：901724，912950。

本研制样品批号：930401，930402，930403。

中国药品生物制品检定所生化药品室脑活素肽Ⅰ及肽Ⅱ    HPLC纯标准品

二、方法：HPLC凝胶过滤法

1、试剂：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、异丙醇。

2、仪器：Waters    HPLC，510型泵，481型检测器、740型数据处理器。

3、色谱分析条件：流动相为0.1M（PH=7）的磷酸盐缓冲液，流速0.3ml/分；

凝胶柱：柱温30℃±0.1，检测波长280nm。

4、操作方法：取待测样品10ul，进样，记录分析结果，计算出肽的百分比含量。

三、结果

1、进口脑活素注射液与本研制品肽成分分析的HPLC色谱图；

（1）、脑蛋白水解物中肽Ⅰ和肽Ⅱ的HPLC纯品的色谱图；

（2）、进口脑活素：（见图）901724批，912950批；

（3）、本研制品脑乐注射液：（见图）930401，930402，930403批。

2、HPLC分析进口脑活素和本研制品脑乐注射液肽成分的百分含量和保留时间的数理统计。

表1肽Ⅰ和肽Ⅱ的HPLC保留时间与含量的数理统计结果

表2肽总量与其比值的结果

小结：

1、用HPLC凝胶柱Protein60分离脑活素或脑乐注射液中的肽成分。得二个主成分肽Ⅰ和肽Ⅱ。本制品所得肽Ⅰ和肽Ⅱ与进口样肽Ⅰ和肽Ⅱ其保留时间一致。亦与HPLC纯的肽Ⅰ和肽Ⅱ标准品相一致。说明本研制品与标准品、国外同类样品其肽Ⅰ和肽Ⅱ成分相同。（见色谱图与表1）。

2、进口脑活素中肽Ⅰ其百分含量为12.86～15.59，肽Ⅱ其百分含量为63.19～65.83。

本研制品中肽Ⅰ其百分含量为18.11～18.29，肽Ⅱ其百分含量为74.00～74.33。

结果说明本研制品的主要成分不但成分与进口样品相同，且含量与纯度高于同类进口样品。（见表1）。

3、进口脑活素肽的总含量为77.38～79.66%，其肽Ⅰ/肽Ⅱ比值0.20～0.24。本研制品肽的总含量为92.11～92.62%，其肽Ⅰ/肽Ⅱ比值为0.25。（见表2）。

结果得出本研制品主要成分肽的总含量已超过国外产品。

对脑乐注射液和进口样品脑活素注射液进行对比实验，发现其游离氨基酸的结果十分一致。分析结果见下表3：

表3进口脑活素和本研制品脑乐注射液的游离氨基酸分析结果