分离的在植物转化中可作为嵌合基因终止区的DNA顺序

摘要

本发明涉及一种分离的DNA顺序，它能够作为用于植物转化的嵌合基因中的终止子区域。本发明还涉及(1)用于植物转化的嵌合基因。(2)在沿转录方向上，它含有至少一个启动子区域，一个转基因和一个终止子区域，其特征在于，终止子区域至少含有一个来源于组蛋白的基因的终止子区域，从而使其在植物的快速生长区域中表达蛋白质。(3)转基因植物的产生。

说明书

本发明涉及从植物转录基因中分离得到的终止区的用途，以及含该区域的新的嵌合基因的用途，和它们在植物转化方面的用途。

很多的表型特征与一个或少数几个基因的表达有关，这些基因可以被整合入植物的基因组，从而赋于这些转基因植物有利的农业性状。在一定程度上，这些性状包括有：对作物病原物的抗性，对具有植物毒性的植物保护产物的抗性，生产具有食物或药物价值的物质。除了对编码这些不同特性的基因进行分离和定性之外，还必须提供适当的表达。这合适的表达包括定性和定量两种水平。在定性水平上，例如在空间水平：在特定组织中的优先表达，或者在时间水平上：诱导表达。在定量水平，通过导入基因表达产物的数量的积累。很大程度上，这种合适的表达取决于与转移基因（transgene）相关的调节基因的存在，尤其与定量和定性的因素有关。在提供这种合适的调节的原始因素中，使用同源的或异源的，单一的或组合的启动子区域在科学文献中已有大量描述。对于转移基因下游的终止区的使用仅仅是为了设定一个边界，使转移基因的转录过程停止，而没有考虑到它们在转移基因的定性或定量表达方面的作用。

本发明涉及从植物转录基因中分离得到的终止区的用途，以及含该区域的新的嵌合基因的用途，以及它们在植物转化方面的用途。尤其涉及到同时使用从同一植物转录基因中分离得到的终止区和启动子的同时效用。它使转移基因的合适表达，无论是定性的还是定量的，可以在这些基因调节因子的控制下进行。通过使用本发明而获得的合适的表达涉及诸如对作物病原物的抗性、对具有植物毒性的植物保护产物的抗性以及生产具有食物或药物价值的物质之类的特征。尤其，通过在植物的快速生长区域优先地、定性和定量地表达嵌合基因的表达产物，可以将提高的除草剂耐受性赋予转基因植物。这种特定的耐除草剂基因的适当表达，是通过同时使用拟南芥菜（Arabidopsis thaliana）的H4A748组蛋白基因的启动子和终止区调控因子的同时效用而实现的。正如上面所提到的，通过使用调节因子赋于植物提高的耐除草剂性，这种表达模式可用于所有有价值的性状。本发明也涉及到用这些基因转化的植物细胞，以及这些细胞再生而得的转化植物，以及用这些转化植物通过杂交而得到的植物。

在用来保护作物的植物保护产物中，系统的特征在于它们被使用后转移进入植物，而且对于有效作物，在生长的部分，尤其是茎和根尖积累，因此在除草剂存在的情况下会造成敏感植物的损伤，直至死亡。对于某些表现这种类型的除草剂，其主要的作用方式是已知的，它能使与靶植物中正常生长发育所必需的化合物的生物合成途径中有关的特征酶失活。这些产物的靶酶可以位于不同的亚细胞结构中，而且对已知产物的作用方式的观察表明在大多数情况下其常常位于质体结构中。

对该组除草剂中的物质敏感、且其主要靶酶已知的植物的耐受性，可以通过将编码靶酶的基因稳定地导入其基因组中而实现，该基因可以来自于任一系统发育（phylogenetic）的起源，至于通过除草剂该基因表达产物的抑制特性可以改变，也可以不发生变化。另一种方法是在敏感植物的基因组中稳定地导入任一叶遗传性起源、能编码将除草剂代谢成为对于植物的生长发育无活性或者无毒的化合物的酶的基因。在后一种情况下，并不需要确定除草剂的靶目标的特性。

如果已知这种的除草剂在所防治的植物中的积累和分布模式，那么表达这些基因的翻译产物，从而使之在这些除草剂积累的地方，即植物快速生长的区域优先表达和积累是有利的。此外，当这些产物的靶目标位于除细胞质之外的其他细胞结构中时，以前体形式表达这些基因的翻译产物是有利的，该前体含有一段多肽顺序，这段多肽顺序使具有耐受性的蛋白质可被定位于适当的细胞结构中，尤其是质体结构。

为了阐明该方法，可以例举的除草剂有草甘膦，sulphosate和fosametin它们都是膦酰基甲基甘氨酸家族的广谱系统的除草剂。相对于PEP（磷酸烯醇式丙酮酸），这些除草剂主要是作为5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS，EC2.5.1.19）的竞争性抑制物（PEP为EPSPS的底物）。在它们施用于植物后，它们被输送入植物中快速生长的部位，尤其是在茎和根尖积累，从而使敏感植物受到损伤，直至死亡。

这些除草剂的主要靶目标，EPSPS是芳香族氨基酸生物合成途径中的一个酶，它位于质体结构中。该酶由一个或多个核基因编码并以细胞质前体的形式合成，然后被输送入质体并在此以其成熟形式积累。

植物对草甘膦以及该族除草剂的耐受性可以通过将植物或细菌来源的EPSPS基因稳定地导入其基因组中而实现，至于草甘膦抑制该基因产物的特性，可以改变也可以不发生变化。如果已知草甘磷的作用方式，那么表达这种基因的释放产物从而使它在质体中高积累，并且在这些除草剂积累的植物的快速生长区域积累是有利的。

通过在植物基因组中导入能够编码EPSPS的基因，该EPSPS至少携带有一个突变，从而使该酶对其竞争性抑制物（草甘膦）有更大的抗性，在将该酶定位于质体结构中后，可以赋于植物对上述类型的除草剂的耐受性，尤其是对N-膦酰基甲基甘氨酸或草甘膦的耐受性。但是，为了在农业条件下用这些除草剂处理植物时更具可靠性，有必要对这些技术加以改进。

在本发明的描述中，“植物”意指能进行光合作用的任何分化的多细胞有机体，“植物细胞”意指来自植的，能够形成脱分化组织如愈伤组织，或者分化的组织如胚或植物部分或植物或者种子的任何细胞。“终止子区域”是指分离得到的位于编码区的下游并且对应于转录基因的结构区的长度不同的一段DNA顺序。对除草剂有耐受性的基因是指任何经系统发育的起源，或者编码除草剂的靶酶，该酶具有或不具有一个或多个相对于除草剂抑制的特性方面的突变;或者编码能将除草剂代谢成对植物无活性或无毒的组合物的酶的任何基因。植物的快速生长区域是指大致上的细胞分裂繁殖的位点所在的区域，尤其是指顶端区域。

本发明涉及通过用含有对这些除草剂产品有耐受性的基因的新的嵌合基因转化植物细胞，并且再生后，生产对防治植物时积累于快速生长区域的除草剂具有提高的更大耐受性的转化植物。本发明的主旨还在于，通过用含有对这些除草剂有耐性的基因的新的嵌合基因转化植物细胞并且再生后，生产出对膦酰基甲基甘氨酸家族的除草剂具更大耐受性的转化植物。本发明还涉及这些新的嵌合基因，以及因为在这些植物的快速生长部位的耐受性更佳，从而更具耐受性的转化植物，和用这些转化植物杂交而得的植物。本发明的主旨还在于用于构建上述嵌合基因的新的终止子区域。

更具体地，本发明的主旨是一种能赋于植物尤其是针对以EPSPS为靶目标的除草剂的更大的耐受性的嵌合基因，它包括，在转录方向上，一个启动子区域，一转运肽区域，一个编码对膦酰基甲基甘氨酸家族的除草剂有抗性的酶的序列和一个终止子区域，其特征在于，该终止子区域由植物组蛋白基因的终止子区域的一个片段构成，该片段与其在衍生出该片段的基因中的最初定向相比处于任何定向，从而允许对除草剂具有抗性的蛋白质能够在该除草剂所积累的区域优先表达和积累。

本发明中的终止子区域来自于组蛋白基因，该组蛋白基因来自于单子叶植物，如小麦、玉米或水稻，或者更好的可以来自于双子叶植物，如苜蓿、向日葵、大豆、菜子或者更佳的是拟南芥菜（Arabidopsis thaliana）。最好使用H3或更好的是H4组蛋白基因。

转运肽区域包括，在转录方向上，至少一个来自编码酶的质体定位的植物基因的转运肽，一部分编码酶的质体定位的植物基因的N-末端成熟部分的顺序，和来自编码酶的质体定位的植物基因的另一段转运肽，较好的是根据欧洲专利申请/PCT 508，909的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶小亚基基因。该特征区域的作用是能够最高效率地将成熟的多肽，最好是天然形式的，释放进入质体结构。

能用于本发明的嵌合基因的编码顺序来自于任何系统发育起源的具除草剂抗性的基因。该顺序尤其可以是具有一定程度耐草甘磷的突变的EPSPS的顺序。

根据欧洲专利申请/PCT 507，698，启动子区域可以是任何来源的，可以是单一或双重形式，或者是在植物中与天然表达的基因相结合的形式，即，例如可以是细菌来源的，如胭脂碱合成酶基因的启动子，或是病毒来源的，如花椰菜花叶病毒的35s转录的启动子，或者更佳的是植物来源的，例如核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶小亚基的启动子或者更佳的是植物组蛋白基因的启动子，而且最好来自于拟南芥菜（Arabidopsis thaliana）。最好使用H3或更佳为H4组蛋的基因的启动子。

除了上述所提及的基本部分之外，本发明的嵌合基因还可以包括，位于启动子区域和编码区域之间的不翻译的中间区域（连接区域），它也可位于编码区域和终止子区域之间且来源于任何系统发育。

实施例1：嵌合基因的构建

根据本发明，嵌合基因的构建由下列因子开始进行：

1）组蛋白基因启动子：该启动子是从拟南芥菜（Arabidopsis thaliana）的Strasboury的品种的H4A748克隆中分离得到的（M.E.Chaboute，Strasbourg大学，论文，1987和M.E.Chaboute等人（1987）Plant Mol.Biol.8，179-191）。该启动子，在用来分离它的AvaI位点之间含有约900 bp。在用Klenow聚合酶填平SalI和AvaI的突出末端后，将该启动子亚克隆入pUC18的SalI位点。pUc18可从目录中得到（pharmacia ＃ 27-4949-01）。在所获得的一个亚克隆中，启动子的5′端接近pUC18中，多连接物的Hind Ⅲ酶切位点，而启动子的3′端接近pUC18中多连接物的XbaI酶切位点，此克隆随后被使用，并且称之内：prom H4A 748/AvaI/SalI-pUC18。

2）转运肽区域：两个转运肽以及所用的成熟蛋白质因子，和它们的装配方式已有描述（M.Lebrun等人，欧洲专利申请/PCT508，909）。该区域包含约350bp并被称多为优化的转运肽（Optimized Transit Peptides OTP）。

3）抗除草剂的CT7基因：它是由Salmonella thyphymurium中的EPSPS的突变的CT7基因分离得到的。（Pro 101至Ser），由Stalker等人分离而得（1985）J.Biol.Chem.，260，4724-4728。由Calgene提供的pGM34-2克隆，在用XbaI酶线性化后，再用Vigna radiata（豇豆属）核酸酶处理。再用SmaI重新酶切后，连接两个钝末端。所获得的克隆在翻译起始子ATG处有一个NcoI位点，并且在密码终止子下游区域17bp处有一个SalI位点。该克隆被称为pRPA-BL-104。

4）OTP/CT7的融合：含有按照阅读框架将CT7基因与优化转运肽（OTP）相融合的表达片段（B.Leroux等人，欧洲专利申请/PCT 507，608）被克隆入pBSII SK（一）载体（Stratagens目录＃212206）。该5′-OTP/CT7-3′片段在其5′端含有一个XbaI位点，在3′编有一个SstI位点。

5）GUS报告基因：它是一个编码β-葡糖苷酸酶（GUS）的基因，存在于质粒pBI101-I上，该质粒可从目录（Clontech ＃ 6017-1）上得到。

6）组蛋白终止子区域：它从拟南芥菜中的H4A748组蛋白基因分离得到（M.E.Chaboute，Strasbourg大学，论文，1987年和M.E.Chabout等人（1987）Plant Mol.Biol.，8，179-191）。分离出的一个661bp的Sau 3AI片段，用Klenow聚合酶处理后产生平头末端，然后被亚克隆入phagemide pBluescriptⅡ KS（+）的SmaI位点（Stratagene目录 ＃ 212207）。该片段的DNA顺序列于下达的“顺序清单”部分。通过S1谱图法（mapping）表明，该分离的DNA片段在其内部的5′端处的200bp区域，沿起始的转录方向，含有对应于分离得到的从该基因转录而来的mRNA的聚合腺嘌呤化位点前的顺序。位于661 bp顺序中的165位置处的核苷酸A（腺嘌呤）对应于转录中存在的增加聚合腺嘌呤化的位点（Chaboute M.E.等人，（1988）Gene，71，217-223）。所保存的两个亚克隆中，其中一个的插入是按照H4A 748基因的起始的转录方向排列的，处于SstI-EcoRI片段的形式，被称为t-正向（转录正向）H4A748/Sau 3AI/SmaI-pKS，另一个克隆的插入处于相反方向，并处于SstI-EcoRI片段的形式，被称为t-反向（转录反向）H4A748/Sau 3AI/SmaI-pKS。

沿基团的起始转录方向的拟南芥菜H4A748组蛋白基因的661bp的终止子区域的顺序如下：

7）终止子区域“nos”：该片段含有pTi37中胭脂碱合成酶（nopaline synthase，nos）基因的终止子区域的信号（Bevan M.等人（1983）Nucl，Acids. Res.，11，369-385），它位于质粒pBI101-1上（Clontech ＃ 6017-I），该质粒可由目录上可得。

所有这些因子的装配，以通过根癌农杆杆菌（Agrobacterium tumefaciens）转化植物的二元载体，pBI 101-1的骨架结构为基础，按以下方式进行（pBI 101-1见：Clontech 目录 ＃ 6017-1）：pRA-1的构建：

来自拟南芥菜的H4A748组蛋白的启动子，以约900bp的Hind Ⅲ/XbaI片段的形式从质粒prom.H4A748/AvaI/SalI-pUC 18上切下。通过连接将该片段插入用Hind Ⅲ/XbaI消化后的质粒pBI 101-1中。所获得的重组质粒，在嵌合基因的转录方向上，含有H4A748启动子/GUS/nos终止子区域，并被称为pRA-1。

pRA-4的构建

来自拟南芥菜的H4A748的终止子区域，以约670bp的SstI/EcoRI片段形式从质粒t-正向（转录正向）H4A748/Sau 3AI/SmaI-pKS上切下。在用SstI/EcoRI消化质粒pRA-1后，通过连接，将H4A748终止子区域片段插入替代nos终止子区域。所获得的重组质粒，在嵌合基因的转录方向上，含有H4A748启动子/GUS/H4A748沿正向起始的终止子（引导方向）区域，并被称为pRA-2。

pRA-3的构建：

来自拟南芥菜的H4A748终止子区域，以约670bp的SstI/EcoRI片段的形式，从质粒（t-反向）转录反向H4A748/Sau 3AI/SmaI-pKS上切下。在用SstI/EcoRI消化质粒pRA-1后，通过连接将该片段插入替代nos终止子区域。所获得的重组质粒，在嵌合基因的转录方向上，含有H4A748启动子/GUS/H4A748终止子（反向）区域，并被称为pRA-3。

pRPA-RD-146的构建

在用XbaI/Sst I消化质粒PRA-1后，通过连接，将含有OTP/CT7的约1.75kbp的XbaI/Sst IDNA片段插入替代GUS基因。所获得的重组质粒，在嵌合基团的转录方向上，含有：H4A748启动子/OTP/CT7/nos终止子区域，并被称为pRPA-RD-146。

pRAA-RD-147的构建

在用XbaI/SstI消化质粒pRA-2后，通过连接将含OTP/CT7的约1.75Kbp的XbaI/SstIDNA片段插入替代GUS基因。所获得的重组质粒，在嵌合基因的转录方向上，含有：H4A748启动子/OTP/CT7/H4A748沿正向起始的终止子区域，并被称为pRPA-RD-147。

pRPA-RD-148的构建：

在用XbaI/SstI消化质粒pRA3后，通过连接将含OTP/CT7的约1.75kbp的XbaI/SstI片段插入替代GUS基因。所获得的重组质粒，在嵌合基团的转录方向上，含有：H4A748启动子/CTP/CT7/H4A748终止子区域（反向），并被称为pRPA-RD-148。

实施例2：报告基因活性的表达

1）转化和再生

按照Bevan M.（184）Nucl.Acids Res.，12，8711-8721所述的转化程序，用大肠杆菌HB101中的帮助质粒pRK2013，通过三亲结合法将载体引入根癌农杆菌的非致癌性菌株LBA 4404（clontech目录＃6027-1）中。

按照Valvekens D.等人（1988）Proc，Natl.Acad.Sci.USA，85，5536-5540中所述的转化程序，用来自拟南芥菜L-生态型C24的根外植体，进行转化。简而言之，有3个步骤是必须的：在补充了2，4-D和激动素的Gambory B5培养基上诱导愈伤组织的形成;在补充了2iP和IAA的Gambory B5培养基上形成芽;在无激素的MS培养基上生根和产生种子。

2）测量植物中的GUS酶活性

a-组织化学观察

在大量的转基因植物器官中GUS酶活性的显示（Jefferson R.A.等人，（1987）EMBO J.，6，3901-3907）表明，GUS酶活性在分生组织区域内优克表达是由载体pRA-2和3所维持的。此外，载体pRA-2使得有可能在成熟组织（叶，根，穗状花序）中观察到GUS酶活性而对于载体pRA-1则不出现此情况。

b-荧光检测

对于每个载体PRA-1，2和3，通过荧光法测量来自12株植物的花芽和小玫瑰的叶子的提取物来确定GUS酶活性（Jefferson R. A.等人（1987）EMBO J.，6，3901-3907）。这12株植物分别对应于各自的转化过程。

积累数据的平均值，以pmol MU/min.mg prot.为单位表示，列于下表。

载体  叶(L)  芽(B)  B/L比

pRA-1  850.25  3965.33  4.66

pRA-2  4890.67  33683.75  6.89

pRA-3  4211.73  27752.45  6.59

这些测量值清楚地表明，H4A748终止子区域，无论是正向或是反向，都能够诱导嵌合基因表达活性的增加，尤其是在植物快速生长的部位。

实施例3：转基因植物对除草剂的抗性

1）转化和再生

按照Bevan M.（1984）Nucl.Acids Res.，12，8711-8721所述的转化程序，用大肠杆菌HB101中的“帮助”质粒pRK2013，通过三亲结合此将载体导入根癌农杆菌的非致癌性菌株LBA  4404（Clontech目录＃6027-1）中。

对烟草叶外植体的转化是以Horsh R.等人（1985），Science，227，1229-1231所描述的程序为基础进行的。从叶外植体再生的PBD6烟草（来源SEITA-法国）是在含有30g/l蔗糖以及200μg/ml卡那霉素的Murashige和Skong（MS）基础培养基上，通过三个连续步骤进行的：第一步是在附加有30g/l蔗糖并含有0.05mg/L萘乙酸（NAA）和2mg/l 6-苄基嘌呤（BAP）的MS培养基上诱导出芽，时间为15天。在第一步中有芽的形成，接着在附加有30g/l蔗糖但不含激素的MS培养基上培养生长10天。然后收集分化生长的芽，将其在1/2MS培养基中生根（含有1/2原含量的盐、维生素和糖但不含激素）。约15天之后，生根的芽被称栽于土壤中。

2）对草甘膦抗性的测量

对于每个载体即pRPA-R-A，B和C有20株转化植物再生，它们被移入温室继续生长。当这些植物在温室中长至5叶龄时，用Roundup的水悬浮液，相当于每公顷0.8kg草甘膦的活性物质，处理温室中的这些植物。结果对应于处理3周后所记录的对植物毒性值的观察。在这些条件下，可以观察到，用载体的转化的植物均表现出可接受的抗性（pRPA-RD-146），或者较好的抗性（pRPA-RD-147和148），而非转化的对照植物却完全死亡。这些结果清楚地表明了对于同样的编码具草甘膦抗性的基因通过使用本发明的基因，所带来的抗性的提高。

按照本发明所得的转化植物可以作为父本用于生产具有与导入的嵌合基因所表达的表型特征相当的品系和杂交种。