含有粒细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子结合蛋白的产物

摘要

本发明涉及含有G-CSF或其药学上可接受的盐和TNF结合蛋白或其药学上可接受的盐，并且如果需要时还含有药学上可接受之载体的作为组合制剂的产品，G-CSF或其药学上可接受的盐用于制造预防和/或治疗接受TNF结合蛋白或其药学上可接受的盐之病人的败血性休克的药物，TNF结合蛋白或其药学上可接受的盐用于制造预防和治疗接受G-CSF之病人的败血性休克的药物。本发明还涉及治疗和/或阻败血性休克的方法，该方法包含合用TNF结合蛋白或其药学上有活性的盐和G-CSF或其药学上有活性的盐。

说明书

本发明涉及含有粒细胞集落刺激因子（G-CSF）或其药学上可接受的盐和肿瘤坏死因子（TNF）结合蛋白（TNF-BP）或其药学上可接受的盐，特别是在败血性休克的预防和/或治疗中作为结合制剂的产物。

G-CSF是粒细胞成熟和分化中的基本因子〔Metcalf    D.，Blood67，257-267（1986）〕。已经表明用G-CSF治疗可导致诱导的嗜中性白细胞减少症动物模型〔Cohen    A.M.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sa.USA    84，2484-2488（1987）〕和嗜中性白细胞减少症病人〔Gabrilove，J.L.et    al.，N.Engl.J.Med.318，1414-1422（1988）〕的免疫状况迅速改善。和这一发现一致的是，已证明G-CSF能减少嗜中性白细胞减少症病人和经受细胞抑制化疗之癌症病人中的热病发作和医院内获得性感染〔Crawford，J.etal.，N.Engl.J.Med.325，164-170（1991）〕的发生率。但是，G-CSF对嗜中性白细胞的影响不只限于分化和增殖。变得日益清楚的是，它在调解成熟白细胞功能中也起着重要的作用〔Lopez，A.F.et    al.，J.Immunol.131，2983（1983）〕。

最近发现，G-CSF能减小动物体内脂多糖（LPS）诱导的败血性休克的致死率〔Gorgen，I.et    al.，J.Immunol.149，918-024（192）〕。这一点对于可溶性的TNF受体（TNFR）片段或含这样的可溶性片段的嵌合多肽来说也是已知的〔Lesslauer，W.et    al.，Eur.J.Immunol.21，2883-2886（1991）〕。LPS诱导的休克模型已被广泛地用于鉴定在人类休克的预防和治疗中有潜在作用的化合物。但是，似乎感染诱导的败血性休克模型比LPS诱导的休克模型和临床状况关系更大〔Zanetti，G.et    al.，J.Immunol.148，1890-1897（1992）〕。已经在由弥漫性大肠杆菌腹膜炎引发的休克模型中，研究了G-CSF和这样的嵌合多肽。在另一方面，G-CSF和上述嵌合多肽单独并不显示出存活率的明显增加，已令人惊奇地发现，当G-CSF和嵌合多肽两者用于同一模型时，则观察到保护功能明显改善的情况。因此，本的目的是提供含有G-CSF或其药学上可接受的盐和TNF-BP或药学上可接受的盐的作为同时地、分别或相继地用于败血性休克的预防和/或治疗之结合制剂的产物。

本说明书和权利要求书中的术语G-CSF就本领域技术人员所知道的生物活性来说，是以其最广的意义使用的。并且该G-CSF包含科学文献和下述许多专利文献中限定和描述的（包括它们的制备及应用）的多肽（天然的或合成的，包括重组来源的，经过修饰的或没被修饰的）：DE3027105，EP159566，EP215126，EP237545，EP396158，EP22-520，EP217404，EP230980，EP231819，DE3723781，EP263490，EP344796，EP355811，EP373679，EP401384，EP456812，EP459630，EP459516，EP439795，EP243153，EP272703，EP331186，EP335423，WO93/15211。如EP237545”〔人类多潜能G-CSF（hpG-CSF）〕中公开的G-CSF，即在其N末端可含蛋氨酸的重组体G-CSF是优选的。更具体地说，优选的是有特定氨基酸序列和由EP237545中给出的DNA序列编码的G-CSF。

换句话说，除了自然来源的G-CSF外，术语G-CSF还包括由DNA序列编码的任何G-CSF，该DNA序列在原核和真核宿主细胞中表达后，产生的多肽产物至少有如EP237545中所述的天然产生的hpG-CSF的至少一部分一级结构和一种或多种生物学特性，所述的DNA序列选自：

（a）EP237545的表Ⅶ中列出的DNA的序列或其互补链;

（b）在任何适当杂交条件下，如EP237545中所描述的或Sambrook等人在“Molecular    Cloning”（1959，Cold    Spring    Harbor    Lab.Press，Cold    Spring    Harbor）中所描述的条件下杂交的DNA序列，

（c）除了因遗传密码简并性外的，将能与（a）和（b）中所限定的DNA序列杂交的，并编码具有相同氨基酸序列之多肽的DNA序列。

和上述一种序列杂交的DNA序列，即所谓的突变DNA序列，能通过随机的或位点针对性的突变或通过化学合成或通过聚合酶链反应（PCR）技术制备，该PCR技术使用基于EP237545中给出的DNA序列限定的引物并使本领域已知的和如Sambrook等人（S.a.）描述的或lnnis等人就PCR技术所描述的〔PCR    Protocols：A    Guide    to    Methods    and    Applications，A    Academic    Press，Inc.（1990）〕已知方法完成的。因此，可使用这样的突变DNA序列，按已知的和如以上所提及的专利出版物中所描述的方法制备术语“G-CCF”所包含的突变G-CSF。EP243153，WO90/12874，WO89/05824，EP272703或EP456200中对突变体G-CSF作了限定并具体描述了它们的制备方法。

如上所述，术语G-CSF包含天然或重组来源的，以及被修饰形式的G-CSF，例如，当偶联到不改变G-CSF之基本生物学活性的化学实体上时，即可以一种治疗上有利的方式修饰之。对多肽例如G-CSF的一种较好的和众所周知的修饰是将其偶联到有较宽的分子量范围（如500到20，000道尔顿）的水溶性多聚物例如聚乙二醇或聚丙二醇上。这样就可产生基本上无免疫原性的被保护的G-CSF，现有技术中可利用的和如由C.F.Meares编著的“Perspec-tives    in    Bioconjugate    Chemistry”（American    Chemical    Society，Washington    1993）中，特别是如美国专利4，179，337号中所描述的有几种通过不同的连结物将G-CSF与多聚物相偶联的方式。EP401384，EP335423和EP473268中描述了被修饰的G-CSF和它们的制备。被修饰的G-CSF也包含如表现有不同糖基化特征的G-CSF，这些糖基化特征对于如EP370205中所述的以至少有一个附加多糖链形式存在的天然或重组G-CSF来说是已知的。

术语TNF结合蛋白（TNF-BP）包括任何由足够的氨基酸组成以便能形成一种允许不论从何处或怎样得到的连结人类TNF之结构的蛋白质或蛋白质片段。这样的TNF-BF可以抗TNF的抗体如单克隆抗体，也可以是如WO        91/02078中所述的抗人TNF的任何类型的嵌合抗体。这种嵌合抗体是其分子的不同部分有不同的物种起源的，即人和动物的，如小鼠，大鼠或兔子来源的抗体。在这种抗体的优选具体实例中，只有互补决定区是非人类起源的，并且在需要的可变区中可含有附加的氨基酸。可依据已知的和如在EP239400或WO        90/07861中所述的方法制备这些抗体。

如上限定的TNF-BP也可以是任何自然发生的或重组制造的TNF受体或其一部分，更好是含有从人P55-或P75-TNFR或其一部分衍生的蛋白质，这一部分仍和TNF结合而为例如这些受体的可溶性部分，或者是所谓的嵌合多肽，这些多肽如包含这些受体可溶性部分和人类免疫球蛋白重链或轻链的所有的或部分的恒定区，但至少有一个恒定区。最好，这种嵌合多肽中的TNF结合部分是由人P55-TNFR衍生的或其一部分。更进一步地说，其中的免疫球蛋白部分包含除人类免疫球蛋白例如IgG，IgA，IgM或IgE，特别是IgG，象IgG或IgG₃之重链恒定区的第一区域外的所有区域的嵌合多肽是优选的。本领域中熟练技术人员很清楚这样的事实，即只要TNF结合部分仍同TNF结合并且免疫球蛋白部分表现有其一种或多种特性，那么免疫球蛋白部分或TNF结合部分的任何氨基酸均可被删除或被一个或多个氨基酸取代或加入一个或多个氨基酸。这些改变对于没有免疫球蛋白部分的如上限定的TNF-BP也是适合的。下列专利出版物中描述了从天然来源分离或通过重组方法制备TNF-BP，该重组方法包含例如以嵌合多肽形式制备特定构建体，所说的嵌合多肽除了含TNF结合部分外，还包含免疫球蛋白部分。这些出版物是：EP308378，EP422339，GB2218101，EP393438，WO90/13575，EP398327，EP412486，WO91/03553，EP418014，JP127，800/191，EP433900，美国专利5，136，021，GB2246569，EP464533，WP92/01002，WO92/13095，WO92/16221，EP512528，EP526905，WO93/07863，EP568928，WO93/21946，WP93.19777和EP417563。特别优选的是以hTNFR，特别是仍与TNF结合的P55-TNFR的重组可溶部分形式存在的TNF-BP，或者含有如上限定的和EP417563中所述的这种可溶性部分及免疫球蛋白部分的嵌合多肽。本技术领域的熟练人员将会理解，本发明TNF-BP的定义也包含借助象WO92/16221等文献中所述的方法，以如上述处理G-CSF的同样方式，例如连结到水溶的多聚物上，即聚乙二醇或聚丙三醇等多聚物上，经化学修饰的TNF-BP。

更进一步地说，本发明的目的是提供如上所述的产品，其中的G-CSF和/或TNF-BP是作为药学上可接受的盐的形式存在的。这里所使用的术语“作为药学上可接受的盐”是指本发明产物的两种盐。这种羧基的盐可通过本技术领域中已知的方法生成，并且该盐包括无机盐如钠、钙、铵、铁或锌盐等，以及与有机碱如三乙醇胺等胺、精氨酸或赖氨酸、吡啶、普鲁卡因等形成的盐。酸加成盐例如包括与盐酸或硫酸等无机酸形成的盐，和与有机酸或硫酸形成的盐，以及与乙酸或草酸等有机酸形成的盐。

本发明另外的目的是将G-CSF或其药学上可接受的盐用于生产药品，特别用于治疗和/或预防接受如上文限定的TNF-BP或其药学上可接受的盐之病人的败血性休克，以及将如上限定的TNF结合蛋白或者药学上可接受的盐用于药品生产，特别用于生产治疗和/或预防接受G-CSF或者其药学上可接受的盐之病人的败血性休克。

另外，本发明的目的还包括治疗败血性休克的方法，该方法包括给病人使用TNF-BP或者其药学上有活性的盐和G-CSF或其药学上有活性的盐。

含G-CSF和TNF-BP的产品是结合形式的，更好是由各部分组成的药盒形式的，在各分隔空间中含有活性成分，用于同时、分开或连续给药，特别是用于败血性休克的预防和/或治疗中。对病人来说，这就意谓着G-SCF和TNF-BP在同一时间（同时）分别用于病人，或者以有协同作用的加续方式分别应用于病人。但是，该组合也包含其中G-CSF和TNF-BP在同一分隔室中以混合物的形式的组合。

在按上文提及的败血性休克的预防和/或治疗方法中，给病人使用G-CSF的给药途径可从是本领域中已知的，如肌肉注射，静脉注射，皮下注射等任何已知的途径，如EP246322所述的皮下给药，如EP459516和EP459795中所述的以特定口服剂量形式口服给药，如EP565722中所述的经鼻给药，或者如EP505123中所述的经肺部给药。

可依据所选择的特殊给药途径将G-CSF配制成适当的剂型。当G-CSF是通过任何已知的方法得到的含G-CSF溶液时，最好将其保存在4℃左右的溶液中，但是根据所得到的G-CSF类型，也可将其储存在冷冻状态。或者，在按EP355423中针对PEG-G-CSF所描述的冻干或真空干燥脱水之后，可将溶液以冻干形式保存。如果需要，可将G-CSF保存在适当的缓冲液中，然后通过微孔滤器或用任何其它适当的方法进行无菌过滤，以便配制成可供注射的制剂。

为了制成适合于通过一定途径对病人给药的剂型，在本发明的治疗方法中所用的G-CSF可包含适当的添加物，这些添加物可选自已知的药物载体、赋形剂、稀释剂、稳定剂例如人血清白蛋白等蛋白质、抗吸附剂、防腐剂、溶解剂和如DE3723781中所述的乳化剂，或者将该G-CSF配制成如EP373679中所述的稳定化的疏水配制品形式，或者采用如EP263490或EP58481中所描述的或如EP473268中针对pegylated    G-CSF所述的延迟释放的颗粒制剂。

G-CSF的给药剂量水平和频率可依据不同因素例如将被治疗的休克严重程序、病人的体重、年龄和性别、以及给药的途经等而适当地确定。给药剂量一般可以是10-2000μg/kg，较好是大约50-1500μg/kg，最好是大约10-250μg    G-CSF/kg体重。

本发明的TNF-BP较好是通过经肠道外途径注射给药，但其它的有效的给药形式，例如关节内注射剂、口服用的活性制剂、穿皮离子电渗剂或栓剂也是可行的。一个较好的载体是生理盐水溶液，但是也预料到其它一些药学上可接受的载体也可以使用。在这样一种载体中基本溶剂，在本质上可以是含水的或不含水的。另外，该载体可含有用于修饰或维持pH值、渗透压、粘度、透明度、颜色、无菌性、稳定性、溶解率，或制备物之气味等的药学上可接受的赋形剂。类似地，该载体还可含有用于修饰或维持稳定性、溶解率，TNF抑制剂的释放或吸收等药学上可接受的赋形剂。这样的赋形剂是通常用于配制以单位剂量或多剂量形式经胃肠道外途径给药之制剂的那些物质。

一旦配制了治疗组合物后，即可将其从溶液，悬浮液、凝胶、乳液、固体，或脱水或冻干粉的形式保存在无菌小瓶中。这些配制品可以以易于使用的形式，或者可在给药前立即重新配制的形式保存。这些配制品的优选保存条件是至少在4℃以下且最好在-70℃。含TNF-BP的配制品较好在生理pH或接近该生理pH的条件下保存和给药。

在某些具体实例中，为了使病人血液中有预选的TNF-BP浓度范围，而设计了给药剂量。为了有效，认为保持每毫升血浆中TNF-BP的循环浓度大于0.01ng是必要的。

用于治疗败血性休克的可能剂量范围，大约在每24小时每公斤病人体重0.1-200mg之间，每24小时以相等剂量给药大约4-15次。用量频率和最适剂量将取决于所用制剂中TNF-BP的药物动力学参数。

败血性休克的治疗应在败血病发生后尽可能早地治疗，或者在被诊断为可能是败血病时开始治疗。例如，可在手术后或事故后或任何可能包括败血性休克的事件之后立即进行治疗。

不管采用什么给药方式，均根据病人的近似体重计算具体剂量。更精确的计算对于由本领域熟练技术人员确定上述每种制剂的适当治疗剂量是必要的。

实施例

由弥漫性大肠杆菌腹膜炎菌诱发的败血性休克

按表1的设计，给Swiss    albino小鼠注射G-CSF（Neupogen，Hoffmann-la    Roche，Basle，CH;0.1mg/kg    sc）和/或TNFR/IgG₃（按EP417563所描述的TNF-BP，它由融合到人类IgG₃重链的铰链区上的并在小鼠J558L骨髓瘤细胞中表达的人类P55-TNFR的前182个氨基酸组成;2.5mg/kg，ip）的水溶液。通过向腹膜腔内注射10⁶CFU₃（集落形成单位）大肠杆菌25922的过夜培养物以诱导腹膜炎，该培养物的量大约是在72小时内杀死50%未用药治疗的动物所需求的细菌量的500倍。对照和治疗组各由5-10只小鼠组成。在细菌攻击后3.8小时给用头孢三嗪噻肟〔Hoffmann-la>8CFU/mL对3.5×10⁸CFU/mL）。已用鲎属阿粑状细胞溶胞产物分析法（敏感度：0.06EU/ml），测定了G-CSF（25μg/mL）和TNFR/IgG₃（250μg/ml）的内毒素含量小于0.05EU/mL。因此可以排除抗LPS的脱敏感作用。表2中列出了在Swiss>3）。

表2