疫苗效力促进物和效力扩增食物

摘要

一种疫苗效力增强剂，含有作为其有效成分的具有IgA生产促进作用的IgA生产促进物。该促进物能够增强致病病毒疫苗的效力。若施用含细菌或杆菌或病毒抗原并且具有诱导抗传染疾病免疫性作用的疫苗时，IgA生产促进物剌激IgA生产细胞如集合淋巴结细胞以促进分泌性IgA的生产。总之，增强了抗疫苗中抗原抗体的生产，成功地诱导了保护性免疫并增强了疫苗的效力。另外，该增强剂能够抑制疫苗的副作用。同时描述了含有促进物的效力增强食物。

说明书

本发明涉及疫苗效力增强剂，包括作为有效成分的IgA生产促进物，如属于双歧杆菌属的细菌，具有良好的IgA生产增强效力，另外还涉及效力增强食物。

每年，不仅在发展中国家，而且在发达国家，都有许多患者患有由病原病毒引起的传染性疾病。而且，这种疾病是婴幼儿和儿童死亡的主要原因。

例如，每年有数百万包括婴幼儿在内的受害者传染上轮状病毒传染的疾病。在日本，每隔几年，流感便大规模流行。为了治疗这些传染性疾病，已用病毒抗原研制了各种类型的抗病毒药物和疫苗。

然而，对于特定类型的病原病毒，任何适当的抗病毒药物或疫苗的研制都从未成功过。

使用集合淋巴结细胞，本发明人已研制出一种检测物质的方法，该物质促进在生物防御中有用的分泌性IgA的生产。用该方法，已发现一种IgA生产促进物。它含有作为其有效成分的，具有良好IgA生产促进作用的双歧杆菌属细菌（日本公告专利申请No.280059/1990）。

本文所用的术语“具有良好IgA生产促进作用的IgA生产促进物”指在上文提到的检测方法中，在培养7天以上的培养溶液中，从IgA产生性细胞分泌的分泌性IgA量与未加被检测物质（培养前）组的分泌性IgA量的指数比例不小于12。

为了进一步增强IgA生产促进物的IgA生产促进效能，进行了一种使双岐杆菌原生质体化的尝试，即将其细胞质膜去掉，（日本公告专利申请No.139469/1991）。

本发明人发现，当属于双岐杆菌属并具有良好IgA生产促进作用的细菌与疫菌（病原病毒抗原）一起服用，可显著地增加与病毒抗原相对应的特异性抗体的生产量，由此增强预防传染的效果。

本发明目的是提供一种疫菌效力增强剂，其中，当病原病毒疫苗与增强剂一起给药时，可以增强疫苗的效力，同时也提供含所述增强剂的效力增强的食物。

根据本发明的一方面，特别是如权利要求1中所述的，疫苗效力增强剂含有作为有效成分，具有IgA生产促进作用的IgA生产促进物，以便当其与疫苗一起给药时，可增强与疫苗中抗原相对应的抗体的生产，从而增加疫苗的效力。它也极可能抑制疫苗的副作用。

如已知的，疫苗含细菌或病毒抗原，并用于诱导抗传染性疾病的免疫力。当具有IgA生产促进作用的IgA生产促进物与疫苗一起给药时，该促进物刺激IgA生产细胞如集合淋巴结细胞（PP细胞），促进分泌性IgA的生产。同时，也增加了与疫苗中所含抗原相当的抗体的生产，由此，诱导预防免疫性，并提高了疫苗的效力。

特异性IgA生产促进是具有良好IgA生产促进作用并用前述日本公告专利申请No.280059/1990公开的方法得到的那些，所述方法用于检测具有良好的诱导IgA能力的物质。该方法包括无菌培养含大量IgA生产细胞的PP细胞，将被检测物质的溶液或悬浮液加到培养溶液中，将所得的混合物培养已给定的一段时间，测量溶液中从IgA生产细胞分泌的分泌性IgA的数量，然后根据加有物质组的分泌性IgA的数量与未加物质组分泌性IgA数量的比例，选择性地收集具有IgA诱导能力的物质。

根据本发明优选的实施方案，IgA生产促进物表现出上述所说IgA生产促进作用，在培养7天以上后，在培养溶液中从IgA生产分泌的分泌性IgA数量与未加被测物质（培养前）组的分泌性IgA数量的指数比率（增加率），例如，不小于12。上述促进物有显著的效果。

根据本发明另一优选的实施方案，特异性的疫苗效力促进物含有作为其有效组分的具有良好IgA生产促进效力的双岐杆菌属细菌。

具体的实例包括来自人的菌株，如青春双岐杆菌，角双岐杆菌（Bifidobacterium    angulatum），双岐双岐杆菌，短双岐杆菌，链形双岐杆菌（Bifidobacterium    catenulatum），Bifidobacterium    gallicum，幼儿双岐杆菌，长双岐杆菌，假链形双岐杆菌（Bifidobacterium    pseudo    cate    nulatum），等。

此外，实例还包括来自动物的菌株，如动物双岐杆菌（Bifidobacterium    animalis），Bifidobacterium    boum，Bifidobacterium    choerinum，Bifidobacterium    cuniculi，牙双岐杆菌（Bifidobacterium    dentium），Bifidobacterium    gallinarum，Bifidobacterium    magnum，Bifidobacterium    merycicum，微小双岐杆菌（Bifidobacterium    minimum），假长双岐杆菌假长亚种，假长双岐杆菌浑园亚种，Bifidobacterium    pullorum，反刍双岐杆菌（bifidobacterium    ruminantium），Bifidobacterium    saeculare，猪双岐杆菌，嗜热双岐杆菌，等。

除此以外，还可以是来自昆虫的菌株，如星状双岐杆菌，Bifidobacterium    coryneforme，Bifidobacterium    indicum，Bifidobacterium    subtile等。不用说，可用的菌株并不限于上文提及的那些。

双岐杆菌属优选的菌株包括来自人的，其中长双岐杆菌YIT4062菌株（寄存于1989，4，19，FERM    No.2822），短双岐杆菌YIT4063菌株（以FERM    No.2823于1989，4，19寄存），短双岐杆菌YIT4064菌株（以FERM    No.2824于1989，4，19寄存）是更优选的。这些菌株对疫苗表现出良好的增效作用。

认为根据本发明的疫苗效力的增强剂表现出如下的增强作用：

即：IgA生产促进物如一种双岐杆菌菌株按这样的方式主要在肠内表现出其作用，即促进物的有效成分可作用于PP细胞。同时认为，所得的IgA被转移至身体各部位，特别是可表现其作用的系统粘膜组织。从这种意义上说，疫苗的运作机制并不是仅限于肠。

然而，由于有关分泌性IgA的生产细胞不仅存在于PP细胞，而且在粘膜细胞中也有，认为对于由粘膜的口腔，呼吸系统和消化系统进入而引起的粘液传染性疾病表现出现好的疫苗增效作用。

由于借助本发明促进物生产的IgA可系统性地表现出其功能，所以从直接刺激PP细胞及便于给药观点看，认为将其与口服型疫苗一起给药，对于施用传染性疾病的疫苗包括经皮接种，皮下注射，口服是非常有效的。

若使用经皮和皮下疫苗，要极其注意安全性，如对高纯度的要求。从有效性的立场出发，还未进入实用阶段的口服疫苗，若将其与本发明的增效剂结合起来，则可能提供易于处理且安全性高的口服疫苗。

此外，由于还未研制出任何供临床应用的针对传染性疾病疫苗，若与本发明的增效剂结合使用；极可能研制出抗这类疾病的有效疫苗。从这种意义上说，不应将可与本发明增效剂结合使用的疫苗限于目前正研制的那些。

可用本发明的效力增强剂抵抗的传染性疾病包括由轮状病毒，脊髓灰质炎病毒，流感病毒，甲型和乙型肝炎病毒引起的疾病，和经粘膜感染的爱滋病病毒。尤其是，对于轮状病毒和流感病毒的作用极其显著。可以将各种类型的疫苗结合使用，包括杀死的疫苗（失活疫苗），使用减毒菌株的疫苗（活疫苗），使用部分细菌结构的疫苗（组分疫苗）等。

属于双岐杆菌的菌株，作为本发明增效剂的有效组分，可以是活的或杀死的。另外，如通过形成原生质体，除去细胞膜（日本公告专利申请No.139469/1991），自溶处理（日本公告专利申请No.46094/1993）及其它不失去增效作用的处理方法对其进行处理，以增强其IgA生产促进作用。

可将作为本发明增效剂主要成分的双岐杆菌菌株用于食品如普通发酵奶，并且没有安全问题。因此，数量并不重要，且一般从每剂，10mg到10g，一天可数剂。口服剂是最佳的。

根据本发明的其它实施方案，以发酵奶或饮料的形式使用双岐杆菌菌株，可以在施用疫苗之前或之后施用它们的利用其作为一种食物增强疫苗的效力。

图1.图解表示由不同天数大的乳鼠感染后，腹泻发生率与天数变化的关系。

图2.图解说明活体内的粘液免疫机制；

图3.图解表示小鼠血清中的免疫球蛋白量与小鼠年龄变化的关系；

图4.图解说明本发明实施例中所用的检测程序；

图5.图解说明另一实施例中所用的检测程序；和

图6.图解说明在本发明其它实施例中所用的其它检测程序。

实施例A（轮状病毒感染抑制作用）

1.制备已感染的小鼠模型系统

使用可在MA-104细胞中生长良好的轮状病毒，用该病毒很容易感染的其它动物种，并使用表现出短双岐杆菌（下文缩写为B.breve）YIT4064（FERM保藏号No.2824）最高IgA诱导活性的BALB/C小鼠制备轮状病毒感染的模型小鼠。

所用的轮状病毒是一种来自猴的SA-11菌株（A类Ⅲ型）。用轮状病毒感染的小鼠由经11至19周龄的雌性BALB/C小鼠和7至15周龄的雄性BALB/C小鼠杂交并生出的乳鼠组成。

以下列方式给乳鼠施用轮状病毒，以每20微升2×10⁶PFu的量，分别给4天龄、5天龄，8天龄和12天龄的每头乳鼠口服轮状病毒SA-11，然后每天观察这些小鼠是否患有腹泻。

图1是当给不同天龄的乳鼠施用轮状病毒后，表示腹泻发生率的图。如图中所示，当以2×10⁶PFu分别给4天龄；5天龄和8天龄小鼠施用轮状病毒SA-11后，在第三天，均观察到所有小鼠腹泻。对于12天龄小鼠，腹泻的发生率仅为30%。在第5或第6天，完全治愈了小鼠的腹泻，表明腹泻是暂时性的。

从上述看出，甚至对于8天龄的乳鼠，以2×10⁶PFU口服SA-11会100%发生腹泻。因此，通过用轮状病毒感染8天龄或更小的乳鼠，可以提供轮状病毒感染的模型小鼠。

2.乳鼠产生抗体的能力

图2是一个说明性的图，图解说明体内的粘液免疫机制。如在图中特别说明的，不同的粘液组织相互有关联。在肠内被刺激并分化成IgA生产细胞的细胞被转移至粘液组织如乳腺，上呼吸道，肠固有层粘膜，由此分泌分泌性IgA。

因此，认为仅在成年小鼠中，发现了（具有IgA生产促进作用的）短双岐杆菌YIT4064的IgA抗体生产增强作用。通过测量血清中的免疫球蛋白，已经实验确定（可作为感染模型小鼠的）8天龄或更小小鼠的抗体生产能力的成熟值。

按ELISA方法测量抗体值，其中测量抗-SA-11，IgA，IgM和IgG抗体和总IgA，总IgM和总IgG抗体的量。更具体地说，以0.1μg的浓度，用碳酸盐缓冲液（PH9.6），将用氯化铯纯化的SA-11包被在ELISA平板，加入样品和超免疫血清，接着加入不同类型的酶抗体。根据底物的显色程度确定抗-S-11，IgA，IgM和IgG抗体的量。以u数表示抗-SA-11抗体，其中，取超免疫血清稀释液的某一值为一个单位，用绝对值表示抗体的总量。

图3是表示血清中免疫球蛋白量与（以天计）年龄变化的关系图。如图3中所示，若在雌亲的血清中，分别检测到高水平IgA和IgM，但在甚至15天龄的乳鼠中，均未检测到它们。在出生时，即检测到与雌亲量相等的IgG。其中，3天龄到15天龄小鼠的IgG量超过其雌亲。认为其原因是经胎盘和乳汁转移了雌亲的IgG。

从上述看出，通过直接给乳鼠施用短双岐杆菌YIT4064，不可能检测感染抑制作用。因此，考虑到疫苗和作为疫苗效果增效剂的双岐杆菌菌株的施用效果，将作为疫苗的抗原施用给用作感染模型的乳鼠的雌亲。然后，给乳鼠哺乳，确认与施用疫苗有相同的效果，由此提供保护乳鼠免于轮状病毒感染的系统。

实施例B（疫苗增效作用）

1.短双岐杆菌YIT4064的被动免疫增效作用；

借助短双岐杆菌YIT4064，通过活化雌亲的免疫机制，确定乳鼠的抗轮状病毒感染的保护系统。更具体地说，按几种方法，接种轮状病毒SA-11（用uV照射灭菌活细胞）免疫雌亲，短双岐杆菌YIT4064的施用引起免疫活化作用，并检测由用SA-11免疫的雌亲哺乳的乳鼠，在腹泻发展中有怎样的致变。

图4是表示本实施例中检测程序的说明图。在该图中，特别表示了特定的方式，包括施用短双岐杆菌YIT4064，免疫，饲养，交配，分娩，给乳鼠施用SA-11，取奶和血清样。

将0.5%热杀死的细菌短双岐杆菌YIT4064加到饲料（MM-3）中，并允许雌亲自由摄取该饲料，而实现短双岐杆菌YIT4064的口服给药。可用下列三种方法免疫雌亲，包括一种对雌亲没有进行免疫方法（组1和2），一种是接种一次1×10⁶PFu>6PFu>

应注意，在组1到4分娩前，13个星期以上，持续口服短双岐杆菌YIT4064（0.05%）。对于组5，6，分娩前，服用短双岐杆菌YIT4064 10个星期以上，分娩后，继续服用。给5天龄的乳鼠施用SA-11（2×10⁶PFu），然后每天观察腹泻的发展情况。

表1说明给乳鼠施用SA-11的结果。如表1中所示，在所有免疫情况下，均表现出由口服短双岐杆菌YIT4064的雌亲乳汁而产生的被动保护作用。对于组4，表现出很高的被动保护作用。

表1

在由口服短双岐杆菌YIT4064的雌亲杂交并哺育的乳鼠中，抗SA-11诱导的腹泻的被动保护作用

*1）：未免疫接种

*2）：1×10⁶PFU，一次，活细菌

*3）：1×10⁶PFU，三次，由uv照射杀死的细菌

从上述结果明显看出，由摄取短双岐杆菌YIT4064的雌亲的奶哺育的小鼠比由未摄取任何短双岐杆菌YIT4064的雌亲喂养的小鼠有更强的抗轮状病毒感染的抗性。

2.施用短双岐杆菌YIT4064，增加奶和血液中的抗体：

按ELISA方法测量雌亲奶和血液中抗体值和抗体的总量。

表2中表示雌亲奶中的抗体值和SA-11的抗体总量（分娩前9到12天前口服10⁶PFu>

表2

在哺养来自口服SA-11免疫并饲喂短双岐杆菌YIT4064的雌亲的乳鼠的奶中的抗体滴定度。

抗体类型短双杆菌YIT4064抗SA-11(u/g)总Ig(ug/g)IgAIgMIgG-(n=16)+(n=11)-+-+44.6±14.771.7±24.0★1.8±1.51.7±0.69.9±6.04.2±1.841.1±32.349.7±26.623.3±21.232.9±14.610.5±5.812.2±6.1

*P＜0.05，n=5

表3中列出了雌亲血液中的抗体值（在分娩前9到12天前，通过口服1×10⁶PFu>

表3

用SA-11免疫并饲喂短双岐杆菌YIT4064的雌亲繁殖并哺育的乳鼠血清中的抗体滴定度

抗体类型短双岐杆菌YIT4064抗-SA-11(u/g)总Ig(ug/g)IgA-+212.0±57.1268.2±118.1299.1±60.2249.3±84.0IgM-+123.9±17.8117.9±23.41543.9±480.11277.4±240.7IgG-+202.1±70.3138.9±21.9134.8±19.3111.1±14.2

从上述看出，给雌亲口服短双岐杆菌YIT4064，会导致奶中SA-11的IgA抗体值的增加。

实施例C（对流感病毒的影响）：

用鼠集合淋巴结（PP）细胞的体外检测系统测量抗流感病毒的抗体增加率。

将短双岐杆菌YIT4064（100μg/mL）加至带流感病毒HA抗原（0，0.34，或3.4μg蛋白质/ml）的PP细胞（2.5×10⁶mL）培养物中，第二天离心分离，以除去加入的流感病毒HA抗原，将PP细胞再培养6天。

用ELISA方法测量培养6天后，得到的上清液中IgA，IgG和IgM的量。结果列于表4。

由含鼠短双岐杆菌YIT4064的鼠PP细胞产生的抗流感病毒HA抗体的增强作用

*：P＜0.001

如表4中所示，从中可以看出，若将短双岐杆菌YIT4064加至PP细胞培养物，明显生产了抗流感病毒HA抗原的IgA。

实施例D（对流感口服疫苗的增强作用，体内）

为了证明短双岐杆菌YIT4064的流感口服疫苗增效作用，口服流感HA抗体（对照）或HA抗原和短双岐杆菌YIT4064（4064服用组）以测量血清，唾液和鼻及肺洗液中的抗流感抗体值，由此比较彼此的测量结果。

实验过程如下：

所用的实验动物是5周龄的BALB/C雌性小鼠。

以下列方式口服短双岐杆菌YIT4064，即使小鼠随意摄取其中加有0.5%热杀死的短双岐杆菌YIT4064细胞的MM-3饲料。用MM-3饲料作对照。

所用的抗原是流感病毒血细胞凝集素（HA）疫苗（由Microorganism    Research    Lab.of    Osaka    University，Japan生产）。在下面表5中列出了疫苗的病毒菌株及1mL的各疫苗中HA的含量。应注意蛋白质的含量是0.3mg/mL。

表5

A/Yamagata/32/89(H1NA)菌株*        :300CCA/ml效价

A/Beiging/352/89(H3N2)菌株*        :250CCA/ml

B/Bangkok/163/90菌株                                :250CCA/ml

                                                                                                    总和:800CCA/ml

*：苏联型A

**：香港型A

用胃探针口服抗原。抗原的经鼻施用是这样实现的，腹膜内施用2.5mg异戊巴比妥钠（由Nippon    Shinyaku    Co.，Ltd.，kyoto，Japan生产）进行麻醉，接着将10μL    1.5μg抗原和10μg霍乱毒素B（CTB）（辅剂）的混合溶液滴入鼻孔。

按如下完成取样：腹膜内施用4μg氨甲酰胆碱（WakoJunyaku    Co.，Ltd.，Japan），收集所得的唾液作为样品。此外，完全麻醉后，收集心脏血液，同样收集鼻和肺洗液。

按实验1（短双岐杆菌YIT4064的流感口服疫苗增效作用）中的方法，口服150μg的HA抗原，从中检测通过口服短双岐杆菌是否提高了抗体的生产。

更具体地，如图5所示，在5周龄时，开始给小鼠口服短双岐杆菌YIT4064，然后在9星期，15星期，18星期，21星期，25星期和28星期大小时，口服HA抗原。另一方面，在13星期，17星期，20星期和30星期大小时，对小鼠血清进行取样，并在23星期，24星期，26星期，27星期和29星期大小时，收集唾液。另外，在30星期大小时，对鼻和肺洗液进行取样。

在实验2（短双岐杆菌的流感经鼻疫苗增效作用），经鼻施用1.5μgHA抗原和5μgCTB，产生了抗体。以此为基础，检测经口服施用的短双岐杆菌YIT4064是否能增强经鼻的接种。

更具体地说，如图6所示，从给5周龄小鼠口服短双岐杆菌YIT4064开始，接着在9星期和16星期大小时，经鼻施用HA抗原和CTB的混合溶液，然后单独给22周龄小鼠口服HA抗原。另一方面，在13星期，18星期和30星期大小时，取血清样，在13星期和18星期大小时，取粪便样。此外，在24星期和28星期大小时，取唾液样。

应注意，按ELISA方法测量血清，粪便和唾液中的抗体值。

用1∶200的超免疫血清稀释液的测量值为1u，用u单位表示IgA抗-HA抗体值。类似地，用1∶200000的超免疫血清稀释液的测量值为1u，将IgG抗-HA抗体表示为u单位。

通过设定上述所测量血细胞凝集抑制作用的条件，用含0.1%牛血清蛋白（BSA）和0.002%明胶的磷酸盐缓冲溶液（PBS）以1∶2逐步稀释25μL    HA疫苗，将25μL缓冲溶液与50μL    0.2%人O型红血细胞震荡并混合，接着在室温反应3小时，以确定血细胞凝集作用，从而确定血细胞凝集抑制作用。在可识别出血细胞凝集作用的终稀释液的稀释度为1∶256000，并取为1HAu。对于血细胞凝集抑制作用实验，使用4HAu（稀释度为1∶64000）的HA抗原。将HA疫苗（4HAu）加到25μ1以1∶2逐步稀释的样品中，然后在37℃反应1小时，再加入50μL    0.2%人O型血红细胞，在室温过夜反应，以判断血细胞凝集抑制作用。

表6列出了结果，表明短双岐杆菌对抗-流感HA抗体生产的影响。如表6所示，施用3和6次后，短双岐杆菌YIT4064-施用组的血清中，IgG抗-HA抗体值比对照组的该值明显提高。但是，甚至在施用6次后，都未在各组之间发现施用6次后，血清中的IgA抗-HA抗体值有差异。

表6

抗体        施用次数        抗体滴定度(u/ml)

对照(n=10)        YIT4064(n=10)

1        8.9±7        10.5±7.6

IgA        2        10.1±9.6        12.8±4.4

3        32.0±21.0        48.0±33.0

6        178.0±195.0        260.0±189.0

1        53.0±157.0        32.0±52.0

IgG        2        132.0±309.0        305.0±348.0

3        560.0±754.0        1651.0±1342.0*

6        754.0±622.0        3876.0±2983.0**

**：P＜0.02，*：P＜0.05

表7列出了短双岐杆菌YIT4064对唾液中抗-流感抗体生产的影响。如表7所示，短双岐杆菌YIT4064施用组唾液中的IgA抗-HA抗体值似乎比对照组高，但未看出有显著差异的大变化。

表7

抗体类型        施用        抗体滴定度(u/mL)

对照(n)        YIT4064(n)

4-1        0.2±0.5(9)        0.7±0.9(9)

-2        0.8±0.4(10)        2.5±3.2(10)

IgA        5-1        0.7±0.6(10)        2.0±1.9(9)

-2        1.1±0.8(10)        2.4±2.3(10)

6        0.6±0.6(10)        1.2±1.0(10)

另外，表8列出了在施用抗原6次后，短双岐杆菌YIT4064对不同样品抗-流感HA抗体生产的影响。如表8中所示，施用6次HA抗原后，短双岐杆菌YIT4064-施用组鼻洗液中的IgA抗-HA抗体值比对照组明显提高。在肺洗液中的IgA抗-HA抗体值，短双岐杆菌YIT4064一施用组趋于提高，但未看到有显著的差异。对于血清中的IgG抗-HA抗体，施用短双岐杆菌YIT4064发现有显著的提高。

表8

样品,抗体类型        抗体滴定度(u/mL)

对照(n)        YIT4064(n)

血清        IgA        178±195(10)        260±189(10)

IgG        754±622(7)        3876±2983**(9)

肺洗液        IgA        2.08±1.17(9)        3.25±1.57(10)

鼻洗液        IgA        0.14±0.13(8)        1.35±1.37*(10)

**：P＜0.02，*：P＜0.05

如上文说明的，短双岐杆菌YIT4064能提高同时口服的抗HA抗原抗体的生产，同时增加上呼吸道的IgA及血清中的IgG抗-HA抗体。短双岐杆菌甚至能在自然发生口腔感染时，改善抗体的生产，从中可推断，短双岐杆菌YIT4064能提高抗后来感染的保护能力。

实施例E（增强疫苗作用的食物）

1.培养短双岐杆菌YIT4064菌株并收集培养的细菌及制备杀死的细胞产物的方法：

将YIT4064菌株接种于由乳糖（5.5wt%），酵母提取物（1.0wt%）及脱脂奶粉（1.0wt%）组成的培养基中，于37℃厌氧培养18小时，同时将PH调到5.5-6.0，然后离心分离，洗涤并收集所得的细菌。将由此收集的细菌在40℃到55℃，PH8.0处理1小时或更长并自溶，然后在100℃加热30分钟，然后冻干以得到杀死的细菌粉。

2    烤一条（块）面包的方法：

将300g小麦粉，4.5g食盐，3g糖，3g猪油，9g面包酵母，10g杀死的细菌产品和180g水混合，并放在模子中，然后烘烤以制成掺有双岐菌的面包。

3    制饼干的方法：

将100g小麦粉，10g糖，18g起酥油，1g食盐，1.2g焙烤粉，5g转化糖和5g热杀死的细菌均匀地掺和，确定模型，并在烤箱中烘烤，以得到掺有双岐菌的饼干。

4    生产巧克力的方法：

在热槽上，将180g巧克力块，165g可可黄油，430g糖粉，220g非脱脂奶粉，5g卵磷脂，少量香料，15g热致死的细菌搀合，接着冷却定形以得到含双岐菌的巧克力。

5    生产透明的果味糖果的方法：

将180g糖，120g淀粉糖浆，3g有机酸，10g热致死的细菌，和少量香料及着色剂搀和在约150℃煮沸，然后倾入模子，冷却定型得到含双岐菌的透明的果味糖果。

6    生产调控奶粉的方法

将脱脂奶加到原料乳中并标准化，然后以合适量加入糖，矿物质和维生素，灭菌，过滤并喷雾干燥以得到奶粉。将5%热致死的细菌加到奶粉中以得到含双岐菌的奶粉。

7    发酵奶

将短双岐杆菌YIT4064菌株接种到热奶培养基（15wt%脱脂奶，0.1wt%酵母提取物）中，在37℃培养直到培养基的PH达到4.6，然后冷却并用匀浆器匀浆。另一方面，将嗜热链球菌（streptococcus    thermofiles）接种于热灭菌的奶培养基（12′wt%脱脂奶）中并于37℃培养直到培养基的PH达到4.3用冰冷却，用匀浆器匀浆。将两种培养基和糖浆以1∶3∶1的比例混合以得到酸牛奶饮料。