达玛烷型皂甙人参低元醇衍生物及制备方法

摘要

本发明涉及到具有达玛烷为母环结构的新的人参低元醇衍生物及其制备方法，以及此系列化合物作为药物的应用。本发明所述的人参三醇葡萄糖甙、人参二醇琥珀酸钾、人参三醇琥珀酸钠以及人参二醇葡萄糖甙经实验，具有较强的抑瘤效应和杀伤癌细胞的能力。用本发明所述的达玛烷型皂甙人参低元醇衍生物分别以12—25mg/ml，可以制成医药上可接受的剂型制剂。

说明书

本发明涉及到具有达玛烷为母环结构的新的人参低元醇衍生物及其制备方法，以及此系列化合物作为药物的应用。

三七皂甙具有多种重要生理活性，如对心脏血管疾病作用代谢，增加免疫作用等，但作用不够强。又且分离各种皂甙单体的技术，不能适用于生产。使用总皂甙由于组成的皂甙单体不一致，多糖甙性疚不稳定导造成疗效不稳定。所以分离三七中二种主要皂甙元人参二醇及人参三醇半合成性质稳定的衍生物，以增强其效果，稳定其疗效，适用于生产及临床应用，很有必要。

本发明的目的是提供一系列具有抗癌活性而且毒性低的化合物、化合物的制备方法以及作为药物的应用。

本发明所述的达玛烷型皂甙人参低元醇衍生物具有式Ⅰ的通式，式Ⅰ为：

式Ⅰ中，R＝H、COCH₂CH₂COOK，COCH₂CH₂COONa、（简称Ⅱ），R′＝Ⅱ、H、OCOCH₂CH₂COONa。当R＝H时，R′＝Ⅱ，式Ⅰ所表示的化合物为人参三醇葡萄糖甙，分子式C₃₆H₆₂O₉，白色晶体。当R＝COCH₂CH₂COOK时，R′＝H，式Ⅰ所表示的化合物为人参二醇琥珀酸钾，分子式C₃₄H₅₅O₆K，白色晶体，360℃以上变色。当R＝COCH₂CH₂COONa时，R′＝OCOCH₂COONa，式Ⅰ所表示的化合物为人参三醇琥珀酸钠，分子式C₃₈H₅₈O₁₀Na₂，白色晶体，300℃以上变色。当R＝Ⅱ时，R′＝H，式Ⅰ所表示的化合物为人参二醇葡萄糖甙，分子式C₃₆H₆₂O₈，白色晶体，熔点223-226℃。

人参三醇葡萄糖甙C₃₆H₆₂O₉的制备方法为：取人参三醇4-5g，干燥乙醚90-190ml，二氯乙烷85-120ml混合，加热溶解，加乙酰溴代葡萄糖6-12g，回流搅拌4-10小时，再加入碳酸银4-7.9g回流搅拌4-10小时，过滤，滤液回收溶剂，残余物溶于甲醇，过滤，滤液加入蒸馏水至溶液浑浊，再加入6-12ml三乙胺，室温搅拌8-14小时，回收溶剂至干，通过硅胶柱层析，以氯仿-甲醇9∶1冲洗，即得成品。

人参二醇琥珀酸钾C₃₄H₅₅O₆K的制备方法：a：将人参二醇，琥珀酸酐，吡啶按1-3∶5-6∶15-20的比例混合，加热搅拌回流，室温放冷，倾入冷水中，有沉淀析出，过滤得灰白色沉淀物，将沉淀物溶于乙醇中，加热溶解，加活性炭脱色，减压过滤，回收乙醇，放冷，有白色簇状结晶析出，滤干，得人参二醇琥珀酸;b、人参二醇琥珀酸加入丙酮中搅拌溶解，滴加KOH无水乙醇溶液，搅拌直至沉淀完全，静置，过滤，沉淀物用丙酮洗涤，减压过滤，即得成品。

人参三醇琥珀酸钠C₃₈H₅₈O₁₀Na₂的制备方法为：a、将人参三醇、琥珀酸酐、吡啶按1-2.5∶3-6∶9-12的比例混合，在134-135℃的油浴中回流3-5小时，然后将反应混合物倾入水中，静置、过滤、干燥，得灰白色固体，将此固体溶于乙醇中，以活性炭脱色，过滤，滤液倾入水中，静置，滤取析出物，制得人参三醇3，6-二琥珀酸。

b、将人参三醇-3，6-二琥珀酸溶于丙酮中，搅拌滴入NaOH甲醇溶液至沉淀完全，过滤，用丙酮洗涤，干燥，得成品。

本发明所述的人参三醇葡萄甙糖、人参二醇琥珀酸钾、人参三醇琥珀酸钠以及人参二醇葡萄糖甙（简称B′3）经实验，具有较强的抑瘤效应和杀伤癌细胞的能力。上述化合物的人癌细胞体外培养杀伤试验数据见表1，结果表明，上述化合物具有杀伤肺腺癌细胞的作用，并有明显的浓度-效应依赖关系，最终浓度为100μg/ml以上时，杀伤率可超过50%。B′3对Lewis肺癌抑瘤作用如表2所示，结果表明连续给药7天对Lewis肝癌有明显的抑瘤作用，50mg/kg组抑瘤率为53.3%，达到规程要求。在同等条件下与顺铂相比其抑瘤作用稍低于顺铂。B′3对H₂₂肝癌腹水型延寿作用如表3所示，结果表明，连续给药7天H₂₂肝癌有明显延寿作用，50mg/kg组能延寿155.3%，达到规程要求，在同等条件下与顺铂相比，其抗肿瘤作用与化疗药相当。B′3对小鼠艾氏EAS抑瘤作用如表4所示，结果表明，连续给药7天，对艾氏EAS有明显的抑瘤作用，其作用强度与顺铂相当。

本发明所述的达玛烷型皂甙人参低元醇衍生物分别以12-25mg/ml，可以制成医药上可接受的剂型制剂。

实施例：

1、人参三醇葡萄糖甙的制备：人参三醇4.2克、乙酰溴代葡萄糖7.2克、乙醚（干燥）190毫升、二氯乙烷85毫升、碳酸银7.9克

制备方法：

人参三醇，干燥乙醚，二氯乙烷混合物加热溶解，加入乙酰溴代葡萄糖，回流搅拌10小时，加入碳酸银回流搅拌10小时，过滤，回收溶剂，残余物用20ml甲醇溶解，滤除不溶物，滤液加水至浑浊（加入水约10-15ml），加12ml三乙胺搅拌12小时，回收溶剂至干，吸附在5克160-200目硅胶上通过85克硅胶湿法上柱，以9∶1氯仿冲洗，每份50毫升，第10-19份收集人参三醇葡萄糖甙。重0.94克。

2、人参三醇琥珀酸钠的制备

（A）人参三醇-3，6-二琥珀酸的制备：

4.76克人参三醇和20克琥珀酸酐溶于50ml吡啶中，在134-135℃的油浴中回流3.5小时，然后将反应混合物倾入800ml水中静置过夜，过滤，干燥，得到6.57克灰白色固体。将此溶于200ml95%乙醇之中，以活性炭脱色，过滤，滤液倾入800ml水中（醇1∶水4-5），静置过夜，过滤，浓硫酸真空干燥器内真空干燥，得白色固体5.46克，产率80.8%。

（B）人参三醇琥珀酸钠的制备：

3.0克的人参三醇-3.6-二琥珀酸溶于600ml丙醇中，在不断搅拌下，滴入10ml1N的NaOH甲醇溶液，滴至沉淀完全，继续搅拌1小时，过滤，真空干燥，得3.13g白色固体。

3、人参二醇琥珀酸钾的制备：

人参二醇3克，琥珀酸酐6克，吡啶15毫升，装入100ml三角锥形瓶中，水浴上搅拌回流，反应2小时，放冷，倾入300毫升冷水中，有沉淀析出，减压抽滤，得白色沉淀物。TLC反应呈一点，上述反应物溶于200ml（95%）乙醇中，加热溶解，活性炭适当脱色，减压抽滤，回收乙醇至约30ml，放冷有白色簇状针晶析出，抽滤、干燥，得3g产品，产率100%。

TLC条件：展开剂CHC13-MeOH（9∶1）显色剂15%硫酸乙醇溶液，105℃加热。薄层板硅胶G板。

8克人参二醇琥珀酸置于500ml锥形瓶中，加入400ml丙酮，充分搅拌，缓缓滴入0.5mlKOH乙醇液，共30ml，继续搅拌20分钟，静置片刻，待沉淀完全，减压过滤，沉淀物用丙酮洗涤3次，每次10ml，沉淀自然干燥，研细，称重得白色粉末7.5gm，得率94%。

4、人参二醇葡萄糖甙（B′3）的制备

（A）溴代四乙酰葡萄糖的制备：

在500ml的三颈瓶中，装上搅拌，加入乙酸酐及少许浓硫酸，搅拌情况下，分次加入葡萄糖，控制温度60-80℃，加完后继续搅拌30分，冰水冷却至30℃以下，分次加入红磷，加完后继续搅拌30分钟，30℃以下缓缓滴加Br₂，加完后，瓶塞塞好，放冰箱中过夜。加入定量水，以氯仿提取，氯仿层水洗，加入CaC₁₂干燥，过滤，滤液减压收回氯仿，残余物无水乙醇中重结晶，真空干燥。

（B）乙酰化B′3制备：

人参二醇，乙酰化溴代葡萄糖，无水乙醚，二氯乙烷溶液，水浴上加热到40℃，加入碳酸银，避光搅拌8小时，过滤，回收溶剂残余物加20ml甲醇，过滤除去不溶物，蒸干甲醇，上硅胶柱，以石油醚-丙酮8∶2洗脱，得乙酰化B′3。得率约25%。

（3）B′3的制备

乙酰化B′3加入甲醇溶解，滴加水至微浑，加入三乙胺，室温搅拌10小时，蒸干溶剂，乙醇中结晶，薄层检查B′3及人参二醇，结晶溶于甲醇，通过硅胶柱层析，石油醚-丙酮8∶2洗脱人参二醇，再以氯仿-甲醇9∶1冲洗得B′3，在醋酸乙酯中结晶，得率约10%。

表1.

药物名称活细胞均数杀伤率7.核分裂相空白一对照170.804.9氟脲嘧啶100ug10ug1ug102.3134.3147.740.121.413.60.10.30.4人参二醇100ug琥珀酸钾10ug1ug18.692.8185.389.245.7000.64.5人参三醇100ug葡萄糖甙10ug1ug70.4136.7182.658.820.001.14.55.2人参二醇100ug葡萄糖甙10ug1ug0.1109.7176.0100.035.8001.75.6

表2.

组别        鼠数        剂量        瘤重(mg)      抑瘤率        P值                       （mg/kg×d)   (×±SD)          %正常鼠组      9            N.S×7      1703.0±1078   -             -对照组        9            20％DMSO×7   159.5±731   -             -合成B′3      9          50×7        915.9±702      53.3          ＜0.01              7          100×7       986±467        49.7          ＜0.01 CDDP          10         3×4         653.2±326.5    66.7          ＜0.001

表3.

组别          鼠数          剂量          活存天数          生命延长    P值                          (mg/kg×d)      (×±SD)             %正常鼠组      10            N.S×7        16.1±3.0            -          -对照组        10            20%DMSO×7    15.9±1.0            -          -合成B′3        10          50×7         40.6±9.6           155.3    ＜0.001               10            100×7        32.4±12.2          103.8    ＜0.001CDDP          10            3×4          40.5±7.7           154.7    ＜0.001

表4.

组别        鼠数        剂量        瘤重(mg)      抑瘤率        P值                       （mg/kg×d)   (×±SD)          %正常鼠组      10          N.S×7      1.48±0.50        -             -对照组        9           20％DMSO×7 1.40±0.38        -             -合成B′3      9           25×7       0.52±0.16      62.9          ＜0.001              10          50×7       0.51±0.19      63.6          ＜0.001CDDP          9           3×4        0.47±0.22      66.4          ＜0.001