制备肾病综合症出血热疫苗的方法

摘要

本发明涉及了使用正常人二倍体细胞系制备肾病综合症出血热Hanta病毒疫苗的新方法以及由此生产出的疫苗。本发明的方法包括：在来自胚胎源的正常人二倍体细胞上增殖Hanta病毒；收集所述增殖后的病毒；冻/融或超声处理收集的病毒；用热、福尔马林或紫外线处理来灭活病毒；加入如Al(OH)

说明书

本发明涉及一种制备Hanta病毒疫苗的方法，特别是利用正常人的二倍体细胞系制备肾病综合症出血热Hanta病毒疫苗的方法，以及由此生产的一种疫苗。

自本世细三十年代以来，对流行性出血热病原已进行了广泛的研究，虽然日本和俄国研究者推测是一种病毒，但未能分离出。

1976年，一位韩国病毒学家Ho-Wang  Lee首次从韩国京畿道Dongdoochun-Eup  Songnae-Ri捕获的条斑地鼠（Apodemus  agrarius）的肺组织中发现了病毒，同时他也发现该病毒与未康复的出血热病人血清特异性地结合着;在这种情况下，就将其初步命名为“韩国抗原”（参见：Lee  et  al.，The  Korean  Journal  of  Internal  Medicine，9：371-383，1976）。1978年，“韩国抗原”被证明是流行性出血热的病原（参见：Lee  et  al.，J.Infect.Dis.，137：298-308，1978）;并于1980年重新命名为“Hantaan病毒”（参见：Information  Exchange  Sulicommittee，American  Committee  on  Arthropod-borne  Viruses（Karabastos，ed.）Ft.Collins，Colo.，80522，1980），其根据为：它是一种病毒，并且，这种条斑田鼠是由韩国Hantaan河周围捕获的。目前，Hantaan病毒已被收录在美国出版的虫媒病毒手册（Arbovirus  Catalogue）中。

具有类似症状的疾病不仅在韩国，而且在日本、中国和斯堪迪纳维亚国家出现，从抗原结构看，被鉴出的致病性病毒与所说的Hantaan病毒相似（参见：Gajdusek，J.Pediatr.，60：841-857，1962;Lee  and  Lee，Lancet，i：186-187，1979;Svedmyr  et  al.，Lancet，i：100，1979;Lee  et  al.，Lancet，i：819-820;Lee  et  al.，Lancet，i：1025-1026，1980;Gavrilovskaya.，Lancet，i：1050，1981;Kitamura  et  al.，Jap.J.Med.Sci.Biol.，36：17-25，1983;Song  et  al.，J.Infec.Dis.，150：889-894，1984;Sugiyama  et  al.，J.Infec.Dis.，152：126-136，1985）。在这种情况下，世界卫生组织（WHO）决定称所有这类类流行性出血热为“肾病综合症出血热（Hemorrhagic  Fever  with  Renal  Syndrome，HFRS）”（参见：WHO  Report，1982，Tokyo，WHO/WPR/RPD/WG/82，16）。

肾病综合症出血热的病原已被分类为Bunya病毒科的一个新病毒属，即Hanta病毒。Hanta病毒的亚属包括：Hantaan病毒，汉城病毒（Seoul  Virus），景山病毒（Prospect  Hill  Virus）和Puumala病毒，它们均已按其血清学特性作了鉴定（参见：Schmaljohn，Science，227：1041-1044，1985）。

1981年，用一株肺癌细胞-A549细胞（ATCC登记号：CCL185）首先将Hantaan病毒繁殖成功（参见：French  et  al.，Science，211：1040-1048，1981）;1982年用一株非洲绿猴（African  Monkey）肾细胞克隆Vero  E6细胞（ATCC登记号：C1008，CRL1586），成功地繁殖了该病毒（参见：McCormik  et  al.，Lancet，i：765-768，1982）。

另一方面，一些其他Hanta病毒，如汉城病毒、景山病毒和Puumala病毒据报道也能感染所说的Hantaan病毒的宿主细胞Vero  E6细胞株（参见：Lee  et  al.，Manual  of  Hemorrhagic  Fever  withRenal  Syndrome，Ryo  Moon  Gak  Press，1989）;1989年也报告了Hantaan病毒感染了MDCK细胞（ATCC登记号：CCL34）、一株狗肾细胞（参见：Chung，Sang-In，Choongang  J.Med.，Vol.14，Number  2，1989）。

Song  Gan等人报告指出肾病综合症出血热疫苗可通过灭活金黄仓鼠肾细胞（GHKC）和蒙古Gerbils肾细胞（MGKC）而制备得到的（参见：Song  Gan  et  al.，J.of  Korean  Virology  Society，Vol.21，Number  2，abstract，222-223，1991）。

为了制备适合于人用的疫苗，从人器官中分离的病毒通常被认为是制备疫苗基质材料的理想毒种，因为它可降低由接种外源蛋白而引起的副作用;因而，MRC-5（ATCC登记号：CCL171）和WI-38细胞（ATCC登记号：CCL75）已被很好地建议用于此目的。可是，这些细胞也已发现有其不利的一面，即：它是已转化的细胞（肺癌）和/或异源细胞（即来源于狗或猴肾细胞;或仓鼠或小鼠肾细胞）。

因此，一直不断地存在有各种需求即采用人器官细胞来研制出一种增殖Hanta病毒的实用方法，以满足所提到的稳定性和/或同源性的要求。

根据本发明亦已发现的肾病综合症出血热病原Hanta病毒能在来自胎儿的正常人二倍体细胞系上增殖，由此分离出的病毒是疫苗生产最好的基本材料。

因此，本发明的一个主要目的是提供一种使用正常人二倍体细胞系制备肾病综合症出血热Hanta病毒疫苗的新方法。

本发明的另一个目的是提供一种由此而生产出的疫苗。

本发明人研制出可以使Hantaan病毒增殖的胚源化的正常人二倍体细胞系;也就是说，所述的这些细胞系源自胎儿的肺、肾、皮肤肌肉和胸腺，并分别命名为“LuMA”（源自肺），“KiMA”（源自肾）、“SMMA”（源自皮肤肌肉）和“ThyMA”（源自胸腺）。本发明使用上述细胞系作为宿主细胞用于Hanta病毒培养。这些细胞中有2株于1992年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC  NO：C92007（LuMA）和CCTCC  NO：C92006（KiMA）。另一面，来自肺癌细胞的MRC-5和WI-38两株细胞也已由ATCC分发供应作为对照细胞。

本发明的正常人二倍体细胞系来自胎儿器官和组织，具有接触抑制效应，是非转化细胞。它们均保持各自原有的形态学、生物学特征和染色体数（2n＝46）。本发明人还发现：本发明使用的正常的原代人二倍体细胞系的染色体数目，统计学上非常近似于2n＝46，这一点不同于MRC-5和WI-38细胞;所述细胞系从未受到外源病原的感染（参见：Song-Yong  Park  et  al.，J.Kor.Soc.Virol.，Vol.21.No.1：1-9，1991）。

本发明使用下列组份的复合培养基用于细胞培养：90%（V/V）Eagle培养基和10%（V/V）胎牛血清（FBS）作为生长培养基;98%（V/V）Eagle培养基（Gibco.U.S.A.，Cat.No.＃430-2100）和2%（V/V）胎牛血清作为维持培养基;细胞在37℃和5%CO₂条件下培养。用Hanta病毒属四个亚属，即Hantaan病毒，汉城病毒，景山病毒和Puumala病毒，感染正常人二倍体细胞系，在相同的生长条件下培养10多天。用间接免疫荧光抗体方法监测病毒对所说细胞的感染情况（参见：J.of>

在上述情况下，本发明人惊奇地发现Hanta病毒能够在正常人二倍体细胞系上大量繁殖;因此，本发明可用这种培养病毒来研制一种更为实用的生产疫苗的方法。按照本发明，以酶免疫测定法（enzyme  immunoassay-EIA）为基础，就能从组织培养器（表面积：150cm²）培养Hanta病毒后的LuMA细胞上获得10，000多抗原滴度。

经广泛的研究，用本发明培养的病毒生产的Hantaan病毒疫苗，其抗体的产生能力要高于现有技术所用小鼠或大鼠脑组织繁殖的病毒疫苗。这一点与Lee等人的早期结果，即Hantaan病毒苗诱导的抗体产生是不显著的，正好相反（参见：Lee  et  al.，Arch  Virol.，（Suppl.1）：35-47.1990）。

本发明提出制备疫苗的新方法包括以下几个步骤：在胎儿的正常人二倍体细胞上增殖Hanta病毒;用胰蛋白酶或EDTA处理细胞培养物来收集所述的病毒;冻/融或超声处理所收集的病毒，然后离心所述的病毒，用含有福尔马林的溶液或用热或紫外线灭活病毒，再加入氢氧化铝佐剂以及按下列配方的稳定剂（参见表1）。

表1

成份含量乳糖葡萄糖人血清白蛋白明胶氧化钠磷酸氢二钠磷酸二氢钠氯化钾  蒸馏水pH2.5%(W/V)2.5%(W/V)0.2%(W/V)0.3%(W/V)8.0g1.15g0.2g0.2g1L7.2

在下列条件下，可通过热、福尔马林和紫外线处理以完全灭活Hanta病毒：60℃ 20分钟热处理，0.05%（V/V）福尔马林处理7天，或高于5.4×10⁴J/m²（波长为365nm）的紫外线处理。根据测定，在福尔马林或紫外线处理时采用低温（低于4℃）会更好。

本发明在下列实施例中将进一步阐明，但这些并不应用来限定本发明的范围。

本发明在上述或其它的目的和特性将在下面的附图表的说明中表述得十分明显，即：

图1显示Hantaan病毒对不同宿主细胞的感染性发展过程测定;

图2A显示不同时间的热处理对EIA值的影响;

图2B描述不同时间的福尔马林处理对EIA值的影响;

图2C显示不同紫外辐射剂量对EIA值的影响。

实施例1：确定正常人二倍体细胞系对Hanta病毒的敏感性

正常人二倍体细胞系对Hanta病毒的敏感性确定按下列步骤进行：胎组织正常人二倍体细胞和Vero E6细胞（对照）培养成单层;以10∶1的比例（V/V）用维持培养基将吮乳小鼠或吮乳大鼠体内增殖的Hanta病毒（Hantaan病毒、汉城病毒、景山病毒和Puumala病毒）制成病毒悬液，用滤膜（孔径0.22μm）过滤。按上述培养好的细胞用过滤后的病毒感染，在37℃，5%CO₂培养箱中培养，每3-4天用间接免疫荧光抗体方法监测病毒感染情况。

如上述所示那样，对Hanta病毒敏感的正常人二倍体细胞系进行了研究。表2和图1提供了宿主细胞对Hantaan病毒的敏感性和按不同培养时间进行感染性的比较结果。表3也给出了对其它Hanta病毒敏感性的测定结果。

表2

细胞名称（来源）检查的期限（天）4天7天14天42天LuMA(人，肺）SMMA(人，皮肤肌肉）KiMA(人，肾）ThyMA(人,胸腺）MRC-5(人，肺）WI-38(人，肺）Vero E6 (猴，肾）－－－－－－±＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

表3

细胞名称（来源）Hanta病毒汉城病毒景山病毒Puumala病毒LuMA(人，肺）SMMA(人，皮肤肌肉）KiMA(人，肾）ThyMA(人,胸腺）MRC-5(人，肺）WI-38(人，肺）Vero E6 (猴，肾）＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

从上述结果来看，已确定Hanta病毒能感染Hantaan病毒的各种宿主细胞;进而通过在LuMA细胞系上感染Hantaan病毒来制备疫苗为本发明的优选实施例。

实施例2：大量细胞培养

按照下列方法中的任何一种就可以进行大量病毒培养：用Hantaan病毒感染的正常人二倍体细胞（LuMA，CCTCC NO：C92007）和长好的宿主细胞以1∶10至1∶50（V/V）比例同时培养;或用Hantaan病毒感染的细胞直接加入到培养好的单层细胞上培养。用几种物理方法（超声、冻/融）将Hantaan病毒感染的细胞破碎，该溶液以0.1至0.02M.O.I（感染复数-multiplicity of infection）接种到单层细胞，这样获得的接种液置5%CO₂中吸收30多分钟，加入维持培养基后进行10天增殖培养。最后，收获病毒感染的宿主细胞。

实施例3：病毒的分离

病毒分离按如下步骤进行：在实施例2中获得的病毒感染宿主细胞通过反复冻（-70℃）和融（37℃或室温）;或，在20KHz超声30-90秒来破碎，含有破碎细胞的病毒液以3500rpm离心30分钟，收集上清液为以后使用。按韩国专利号39，291公开的方法确定上清液和沉淀物的EIA值，在表4已列出结果。

表4

破碎方法EIA值＊沉淀物上清液冻／融3次超声1，3503358，70010，000

＊：组织培养器的表面积为150cm₂

实施例4：病毒的灭活

用热、福尔马林或紫外线辐射处理来灭活上述获得的病毒。表5和图2提供了抗原滴度和灭活比率。

从表5和图2的结果可知，可以肯定在下列条件下可达到完全灭活：热处理（60℃，20分钟以上），福尔马林处理（0.05%（V/V），七天以上），紫外辐射（波长365nm，大于5.4×10⁴J/m²）。

实施例5：Hantaan病毒疫苗的配制

通过给由实施例4获得的灭活Hantaan病毒液中加入表1中所列的稳定剂来配制Hantaan病毒疫苗。以0.5ml/大鼠的剂量接种大鼠，用间接免疫荧光抗体法来确定免疫原性。依照不同的灭活方法在表6中提供了各抗体滴度值的比较。

从表6的结果来看，用各种灭活方法制备的疫苗在抗体产生中没有明显的差异。

为了说明本发明的Hantaan病毒疫苗，按实施例6和7对药物特性进行了研究。

实施例6：大鼠免疫剂量的确定

用实施例1至5中制备的Hantaan病毒疫苗以不同的抗原滴度接种大鼠以获得最佳免疫剂量，同时用间接免疫荧光抗体方法监测抗体产生情况，每10天肌肉内注射Hantaan病毒一次，共三次，表7表示三次接种后的抗体效价。

表7的结果表明，本发明的疫苗注射10多个EIA值的量时就可监测到抗体的产生力。

实施例7：比较Hantaan病毒的免疫原性

来自正常人二倍体细胞系和鼠脑的Hantaan病毒疫苗，即，用本发明生产的和在韩国专利号39.291上描述的现有技术制备的疫苗，它们的免疫原性，在它们以不同抗原滴度接种到大鼠后进行了比较。表8提供肌肉内接种后确定的抗体滴度值。

如表8所示，已确定用本发明中的正常人二倍体细胞系生产的Hantaan病毒疫苗诱导的抗体要比早先鼠脑制造的疫苗诱导的抗体更优越。

实施例8：使用来自肾（KiMA）、皮肤肌肉（SMMA）和胸腺（ThyMA）的细胞系进行疫苗生产

来自肾（KiMA，CCTCC NO：C92006），皮肤肌肉（SMMA）和胸腺（ThyMA）的细胞系也按实施例2、3和4中所描述的相同程序参与了病毒培养、分离和灭活过程;同时也确定了免疫原性。几种细胞系生产的免疫原性分别确定为8，500EIA（KiMA）、6，000EIA（SMMA）和5，200EIA（ThyMA），它们在实际使用中相当于在实施例3中用150cm²组织培养瓶获得的10，000EIA>

随着上述清楚的说明和讨论，已确定本发明使用正常人二倍体细胞系，即来自肺的LuMA细胞，来自肾的KiMA细胞，来自皮肤肌肉的SMMA细胞和来自胸腺的ThyMA细胞，制备Hanta病毒疫苗的新方法适合于制备针对肾病综合症出血热的疫苗，以及由此生产的疫苗按抗体产生和免疫原性看也对预防所述疾病是高度有效的。