用南昌链霉菌发酵生产梅岭霉素的方法

摘要

一种用南昌链霉菌生产梅岭霉素的生产方法，包括斜面种子培养，茄子瓶固体培养，种子罐深层培养，发酵罐深层培养，发酵液预处理和提取浓缩等步骤。采用该方法生产的梅岭霉素，具有杀昆虫、杀螨和杀线虫等功效。

说明书

本发明涉及用微生物发酵方式生产抗生素的方法。特别是涉及用南昌链霉菌（Streptomyces    nanchangensis）发酵生产杀虫素梅岭霉素的方法。

本发明人于1984年报道了有关他们发现的南昌链霉菌的情况。（请详见《微生物学报》24（3）：195-199，1984）。该菌是从江西农业大学校园油茶根际土壤中分离到的一株具有产生多种杀虫抗生素的链霉菌新种，其中对鸡的球虫病具有显著防治效果的一种抗生素，依产生菌名称命名为南昌霉素。南昌链霉菌发酵生产南昌霉素的方法已由本发明人于1991年10月18日向中国专利局申请发明专利（申请号91109736.8），并已于1992年2月21日得到中国专利局初审合格通知。

本发明人现在申请用南昌链霉菌发酵生产另一种杀虫抗生素-梅岭霉素的发明专利。

本发明主要涉及有下述的十六元大环内酯结构的杀虫素梅岭霉素及其相近衍生物。

结构式：

梅岭霉素（Meilingmycin）

本发明的目的在于提供一种以南昌链霉菌为发酵菌种生产杀虫抗生素梅岭霉素的工业方法。

本发明的另一目的在于提供一种具有杀昆虫、杀螨和杀线虫抗生素功效-梅岭霉素。

本发明主要涉及一种用南昌链霉菌生产杀虫抗生素梅岭霉素的方法。包括斜面种子培养，茄子瓶固体培养，种子罐深层培养，发酵罐深层培养，发酵液预处理和分离提取浓缩步骤。其中首先将在砂土管中保存的南昌链霉菌接种到高氏一号培养基或麸皮培养基斜面上在24-34℃下培养1-3周。将培养好的上述培养基斜面上的南昌链霉菌孢子接入内装本发明设计的种子培养基的种子罐发酵培养，其发酵条件为，发酵温度24-34℃，通气量1∶0.45-1.6V/V，搅拌速度210-610转/分，发酵时间24-60小时，将经种子罐发酵培养得到的合格培养物进一步接种到内装本发明设计的发酵培养基的发酵罐中发酵培养，其发酵条件为：接种量6-18%（V/V），发酵温度24-34℃，通气量1∶0.45-1.6V/V，搅拌速度210-610转/分，发酵周期72-192小时。

在发酵罐发酵过程中可以进行多次中间补料。这时发酵时间可延长到100-240小时，所述的中间补料依碳、氮、磷代谢曲线，产素曲线，比生长量检定数据适时补进，可以是1-25%糖液（或淀粉），或1-25%糖液（或淀粉）另加0.1-1%硫酸铵，或另加0.5-5%十六烷，或以原发酵培养基各组分浓度2-4倍培养液补充加入发酵罐。每次补料量为发酵罐内培养液容积0.5-10%。

在发酵过程中，通常采用植物油如豆油、菜油、花生油等或采用泡敌做消泡剂。

本发明也可以经一步发酵法完成整个发酵过程。

本发明也可以用固体培养基经一步发酵法或多级培养法完成整个发酵过程。

将经上述发酵培养得到的发酵液先经加温或加碱液预处理，然后用压滤或离心技术使发酵液的液相部分和固相部分分离，前者称为清液部分，后者称为菌丝体部分。

得到的菌丝体部分用乙醇浸提，真空浓缩得到菌丝体浓缩液。

得到的清液部分可以弃去，或直接薄膜浓缩后再用工业酒精浸提并浓缩得到清液浓缩液。

得到的两种浓缩液合并再浓缩（或稀释）到含梅岭霉素的含量符合产品质量规定标准，得到Ⅰ型产品;或者两种浓缩液再用乙酸乙酯提取，再浓缩成油状物，再用辅料如碳酸钙吸附所述的油状物后，烘干、磨粉、加填充料，分别制得液态或粉状梅岭霉素制品。

梅岭霉素是十六元大环内酯类抗生素，纯品为无色片状结晶，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、丙酮，微溶于石油醚、己烷，不溶于水，所以它的分离方法可用溶媒提取。

梅岭霉素对多种农林害虫如天蛾、凤蝶、刺蛾、粘虫、蚜虫、红蜘蛛等有很强的毒杀作用，对线虫也有强的杀灭作用。

本发明中所用的有机溶剂可以采用本领域中熟知的方法加以回收。

本发明上述涉及的麸皮琼脂培养基，其组分包括（%    W/V）

麸皮    1.6-4.2

磷酸氢二铵    0.01-0.05

硫酸镁    0.008-0.03

磷酸二氢钾    0.01-0.05

琼脂    1.8-2.2

本发明在种子罐和发酵罐中采用的培养基主要含有0.8-8%的有机碳源，0.1-5%的氮源和0.002-0.04%的矿物质（均为%W/V），其pH为5.6-8.5，所述的碳源为各种糖类、淀粉，所述的氮源为各种有机氮如黄豆饼粉，鱼粉，蛋白胨和无机氮如硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵，所述的矿物质主要由P、K、S、Mg、Fe、Ca、Zn和Mn等。

本发明种子罐中采用的培养基的组分包括（%    W/V）：

蔗糖    0.1-4

淀粉    0.4-3

玉米粉    1-6

黄豆饼粉    0.1-3

酵母粉    0-1

硫酸铵    0.1-0.25

磷酸铵    0-0.25

磷酸二氢钾    0.1-0.3

氯化钠    0.02-0.05

碳酸钙    0.3-1.8

硫酸镁    0-0.5

硫酸锰    0-0.35

氯化锌    0-0.2

植物油    0.1-1.2

本发明发酵罐中采用的培养基的组分包括（%W/V）

蔗糖    0.1-4

玉米粉    1-6

淀粉    2.5-7.5

黄豆饼粉    0-2.5

鱼粉    0-2.5

蚕蛹粉    0-2

酵母粉    0-1.6

玉米浆    0-2.5

硫酸铵    0.08-0.6

磷酸铵    0-0.25

磷酸二氢钾    0.1-0.5

碳酸钙    0.4-1.6

氯化钠    0-0.1

硫酸镁    0-0.5

硫酸锰    0-0.35

氯化锌    0-0.2

植物油    0.1-1.2

α-淀粉酶    淀粉量的1/210-1/400

下面将结合实施例和附图进一步说明本发明：

附图1，为本发明的工艺流程图。

现将本发明的方法过程分作两大工段，其一为发酵培养工段，其二为分离提取工段。

实施例1

利用南昌链霉菌培养生产含梅岭霉素的发酵液。

取南昌链霉菌NMUB-1砂土管孢子接种在麸皮琼脂斜面培养基上，32℃培养2周，其所述培养基的配方（%    W/V）为：

麸皮    3.2

磷酸氢二铵    0.03

硫酸镁    0.01

磷酸二氢钾    0.02

琼脂    2

选择产生暗绿色水溶性色素，孢子褐灰色，生长丰满的斜面存贮于冰箱（4℃）中各用。

取上述南昌链霉菌NMUB-1斜面1支，用10毫升无菌水分两次注入，洗下孢子，制成孢子悬液。用1毫升的无菌吸管吸取0.5毫升孢子悬浮，注入盛有麸皮琼脂培养基的茄形瓶内，并用灭菌玻璃刮铲将悬液涂布均匀，置于32℃培养2周。选择孢子生长丰满呈褐灰色，培养基转为暗绿色的茄形孢子瓶，贮存于冰箱（4℃）内备用。

用无菌操作法将100毫升无菌水注入上述已长满孢子的茄形孢子瓶中，刮洗下表面孢子，制成孢子悬液。在瓶口上塞上已灭菌的接种专用针头，用无菌操作法将该针头刺入种子罐的接种孔上的橡皮使茄形孢子瓶与罐内相连通，然后用负压法将茄形瓶内的孢子悬液吸入40升的不锈钢种子罐内。接种完毕后开动搅拌装置开始种子培养，其接种量按每20升种子发酵培养基接入一瓶孢子悬液。

种子罐培养温度31℃，搅拌速度460转/分，通气量1∶0.8，罐内压力0.4kg/cm²，种子罐培养时间为48小时，其使用培养基见表1：

采用灭菌移种管道，利用种子罐与发酵罐内气压差将上述种子罐培养物移种入200升不锈钢发酵罐，接种量为15%（V/V），发酵罐使用的培养基见表1，培养温度为31℃，通气量1∶1.4，搅拌速度300转/分。

自移种后开始取样，每隔12小时取样测定发酵液的总糖和还原糖、氨基氮、溶磷含量、菌体DNA含量，和产梅岭霉素效价等（见表2）。

第一次补料时间发酵液总糖下降至1.49g/100ml时，在培养时间中间，约76小时左右，补料容积为10升。

第二次补料时间是发酵液总糖消耗至1.40g/100ml时，约在培养时间中间100小时左右，补料容积为10升。

中间补料的浓度和具体数量详见表1和表2

当显微镜检查到菌丝形成空泡、染色不均匀，并有菌丝自溶，生化测定总糖下降至1.2g/100ml以下，菌体DNA含量开始下降，培养基pH上升时，放罐。

在发酵罐培养时间为144小时，最后放罐体积为120升，放罐单位305μg/ml，放罐总亿0.366亿。

实施例2

根据实施例1中所述的发酵步骤进行发酵培养，其中种子罐和发酵罐采用的培养基以及中间补料使用情况见表3，发酵罐内南昌链霉菌的生长情况见表4。

最后放罐体积为115升，放罐单位为321μg/ml，放罐总亿为0.369亿。

下述的实例主要涉及梅岭霉素的分离和提取工艺。

实施例3

发酵在200升罐进行，放罐体积115毫升，发酵单位321μg/ml，用5N氢氧化钠调pH8.5-9.0后用小板框过滤，并用压缩空气适量吹干，得滤饼12kg（效价2700mg/g），滤液95升（效价40μg/ml），滤饼用60升工业酒精分三次浸提，得浸提液62升，在60℃真空浓缩至3升，效价8380μg/ml;滤液经薄膜浓缩至5升，效价730μg/ml，用10升工业酒精浸提，浸提液经薄膜浓缩至3升，效佳580μg/ml。混合两种浓缩液，再用薄膜浓缩至2.68升，使效价达到产品质量标准10000μg/ml，即得梅岭霉素Ⅰ型产品，最后产品得率为72.6%，各提取步骤及参数详见表5。

实施例4

发酵在200升罐中进行，放罐体积120升，发酵单位305μg/ml，发酵液用板框压滤，得滤饼13kg，滤液效价含量较低放弃处理，滤饼效价2550μg/ml，用65升工业酒精分三次浸提菌丝体，得滤液67升，65℃真空浓缩至4升，用醋酸乙酯12升分三次萃取，得萃取液11.2升，萃取液加活性碳脱色过滤，滤液60℃浓缩至浆状物163克，浆状物溶于二氯甲烷溶媒中，分子筛Sephadex      LH-20柱分离，石油醚-二氯甲烷-甲醇系统洗脱，收集洗脱液4.5升，浓缩至油状物73克，效价327mg/g，提取总收率占菌丝体含量的72%，占下罐总含量的65.3%，加辅料166g制成产品质量标准100mg/g成品239克。即得梅岭霉素Ⅱ型产品。（详见表6）

实施例5

固体发酵法实例

1.培养基成份（高氏培养基）

可溶性淀粉    2%

硝酸钾    0.1%

硫酸镁    0.05%

磷酸氢二钾    0.05%

氯化钠    0.05%

硫酸亚铁    0.001%

琼脂    2%

pH    7.2

2.发酵

选用高氏培养基制备成茄形瓶斜面，每瓶接种南昌链霉菌NMUB-1孢子悬液1ml，置28-32℃培养15-20天，当斜面孢子呈褐灰色，产生暗绿色水溶性色素时，终止培养。

3.提取分离

固体培养终止后，每个茄形瓶用50ml酒精分二次各浸提24小时后过滤，滤液经减压浓缩去酒精后，用乙酸乙酯1∶1提取二次，提取液脱色，减压浓缩后得浓缩物，浓缩物上硅胶柱层析，用三倍柱体积二氯甲烷-乙醚（8∶2）洗脱，洗脱液真空浓缩，得油状物，可供直接加入填料或乳化后制成适用于家畜饲料填加剂和大田使用的农药。提取各参考数见表7。