防病增产基因工程菌荧光93及研制方法

摘要

本发明利用转座子Tn5诱变技术对荧光假单胞菌进行遗传改良。得到一株纯的基因工程细菌，分类上属于假单胞菌属(Pseudomonas)、荧光假单胞菌种(P.fluoresccns Migula)，菌株名荧光93。对小麦有明显促进生长和增产作用，对小麦全蚀病(Gaeumannomyces graminis var.tritici)具有显著防病增产效果，对水稻纹枯病、小麦纹枯病、棉花立枯病和棉花黑根腐病等土传根病也有显著拮抗作用。

说明书

本发明是关于防病增产基因工程菌荧光93及其研制方法，特别是关于假单胞菌属（Pseudomonas），荧光假单胞菌种（P.fluorescens  Migula），菌株名荧光93及其研制方法。

近年来，我国广大麦区，尤其是北方冬、春麦区土传病害发生十分普遍，危害逐年加重，已成为威胁小麦生产的一个重要因素。自山东、宁夏、和甘肃采集引起小麦根病和白穗症状的病害标样5432份，分离得到全蚀病菌、纹枯病菌、根腐病菌和镰刀菌等3676株，其中全蚀病菌占69.6%。小麦全蚀病是一种典型的毁灭性土传病害，发生后一般可减产20-30%，严重为害减产50%以上以至绝收。据报道，这一病害现已蔓延到我国近20个省（区），尤以山东、甘肃、宁夏、内蒙等省（区）为害严重。1987年宁夏引黄灌区42%的小麦发生全蚀病，损失小麦1亿多斤。1988年山东81个县（市）发病，面积近640万亩，损失巨大。

由于土传病害种类多、发病周期长、传播途径广泛，现有化学防治等措施往往难以奏效，加上缺乏抗病品种，更为病害的控制带来极大的困难。必须积极研究新的防治方法，探索新的防治途径。

70年代以来，现代生物科学与生物技术的发展促进了生物防治基础与应用研究的不断深入。利用有益微生物防治土传病害已成为一个十分活跃，并开始显示良好应用前景的研究领域。在各类有益微生物中，荧光假单胞菌（主要是Pseudomonas  fluorescens，P.putida等）因其同植物密切的关系、对根围环境高度的适应性、独特的防病增产作用、以及便于用现代生物技术进行遗传操作等引起了研究者极大的兴趣。近年国外在病菌与益菌生物学研究的基础上，致力于试用荧光假单胞菌防治小麦全蚀病、水稻纹枯病、棉苗立枯病等多种土传病害，同时也十分重视此种益菌的生化和分子遗传研究。

本发明的目的之一是创建基因工程菌株，为小麦全蚀病等作物土传病害的防治和增产开辟一条新途径。

本发明的目的之二是应用转座子诱变等现代生物技术创造一种微生物育种新方法。

本发明的目的之三是开发新的抗病增产基因资源，为用生物工程技术培育抗病作物品种和防病增产微生物育种提供目的基因。

本发明其它目的和任务将通过以下具体描述进一步说明。

本发明的特征在于创建了一株基因工程细菌，分类上属于假单胞菌属（Pse-udomonas）、荧光假单胞菌种（P.fluorescens），菌株名荧光93。

本发明菌株的主要形态和生理生化特征是：杆菌，直或稍弯曲，有多根极鞭，革兰氏染色阴性，不产生芽孢。在KB培养基上产生荧光色素，在4-30℃均能生长，在37℃或41℃均不能生长。在pH4.5或以下均不能生长，适宜pH为5.5-8.5。氧化酶反应阳性，明胶液化阳性，硝酸盐还原阳性，脱氮作用阳性，奎尼酸盐阳性，山梨醇阳性，肌醇阳性，果聚糖阳性，蔗糖阳性，甜菜碱阳性，颉氨酸阳性，β-丙氨酸阳性，L-乳酸盐阳性，甘露醇阴性，D-酒石酸盐阴性，L-酒石酸盐阴性，苯甲酸盐阴性，邻氨基苯甲酸阴性，阿东糖醇阴性。

本发明的菌株研制方法如下：首先从小麦全蚀病（Gaeumannomyces  graminis（Sacc.）Arx  &  Olivier  var.tritici  Walker，又称白穗病，根腐病）发生严重的病田中取出生长正常的小麦植株，将小麦根部用流水洗净，用常规的组织分离方法结合KB或NBY选择性培养基通过稀释分离培养得到荧光假单胞菌，培养温度为26℃，pH为7.0-7.5。在此KB培养基见King，E.O.，Ward，M.K.，and  Raney，D.E.1954.Two  simple  media  for  the  demonstration  of  pyocyanin  and  fluorescin.J.Lab.Clin.Med.44：301-307.NBY培养基见Vidaver，A.K.1967.Synthetic  and  complex  media  for  the  rapid  detection  of  fluorescence  of  phytopathogenic  pseudomonads：Effects  of  the  carbon  source.Appl.Microbiol.15：1523-1524.以上二篇文献通过参考引入本文。将分离得到的荧光假单胞菌进行转座子诱变，筛选获得基因工程菌株荧光93。

本发明的荧光93具有在小麦根部和叶部的定殖和上下转移能力，即用荧光93处理小麦种子后细菌能在小麦根部定殖并向上转移到茎和叶部，在叶部施用后能在叶部定殖并向下转移到根系，因此该菌株在生产中应用时可以采用浸种、拌种等种子处理、土壤处理、地上部喷雾等方法。荧光93同作物关系密切，亲和性好，具有刺激和促进作物生长发育、提高作物产量的能力，特别是对小麦全蚀病有显著防治效果，对水稻纹枯病、小麦纹枯病、棉花立枯病、棉花黑根腐病等多种作物土传病菌也有显著拮抗作用。

本发明的菌种根据中国专利法的规定，在申请日之前已经进行了保藏，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是CGMCC  0169。

在此，申请人声明，本专业普通技术人员依据本发明所公开的内容可以作出许多变化和改变，但均应理解为在本发明的范围内。以下通过实施例来进一步说明本发明。请注意，实施例仅用于说明本发明，但并不能限制本发明的权利要求范围。

例1.防病增产自然菌株的分离和纯化

从宁夏回族自治区贺兰县春小麦全蚀病发生严重的病田中取生长正常的小麦植株，将其根部洗净后晾干。在超净工作台内将小麦根用0.1%升汞表面消毒或不经过表面消毒，灭菌水冲洗5次，切取4毫米左右的根段，用灭菌的玻棒将根组织研碎，在研钵中加约1毫升灭菌水或NBY液体培养基，充分混匀后静置15-30分钟，使根组织中的细菌流入水中而成悬浮液。悬浮液经系列稀释后在稀释倍数为10、10²、10³的试管中用微量取样器吸取0.1毫升移入KB或NBY选择性培养基中。在26-28℃培养2-3天后挑取单菌落。用移植环在KB平板上划线培养再次获得单菌落，即为纯培养物。纯培养物经过形态特征鉴定、对小麦全蚀病菌的离体拮抗作用测定以及温室防病增产效果试验后筛选获得对小麦全蚀病有良好防病增产效果的荧光假单胞菌（Pseudomonas>

例2  防病增产基因工程细菌的构建和应用

通过细菌的接合转移（Conjugation），将转座子Tn5转移并插入到例1中荧光假单胞菌自然菌株CN12的基因组中，筛选获得防病增产效果显著提高的基因工程菌株荧光93（见表1-2）。基主要过程如下：以含自杀性质粒pSUP2021的大肠杆菌S17-1为转座Tn5供体，荧光假单胞菌CN12为受体。当供体和受体生长到对数晚期时取等量细胞（1∶1，V/V）在LB培养基上进行平板接合交配，22℃2小时。菌体经系列稀释后转移到含Rif和Km的选择性培养基上筛选接合子，同时分别取等量供体和受体细胞测量自发突变率，重复5次。接合子经单胞分离纯化后在NBY培养基上繁殖并进行抗生素耐性测验，其中兼抗Km和Rif，但对Ap和Cm敏感的接合子视为Tn5突变体。在此请参见附图1。在Tn5诱变试验中，共获得突变体5100个，以受体细胞计算，Tn5的转移频率为1.2×10^-7。对Tn5诱变株再次进行单孢分离纯化后，在PDA（马铃薯250克，葡萄糖10克，琼脂15克，蒸馏水1000毫升）平板上测验对小麦全蚀病菌的拮抗作用，在温室和田间自然条件测验对小麦全蚀病的防病增产效果，获得基因工程菌株，菌株名荧光93，株号D93。与亲本菌自然菌株CN12相比，荧光93对小麦全蚀病菌的拮抗作用提高1-2倍，对小麦全蚀病的田间防治效果提高72.8%，防病增产率提高1.2倍（见表3）。在无病条件下，荧光93使小麦产量增产26.4%（见表4）。

表1是荧光假单胞菌CN12及其Tn5诱变株对小麦全蚀病的温室防治效果。

表2是荧光93对小麦全蚀病的防治效果。

表3为基因工程菌荧光93与自然菌株CN12对小麦全蚀病的田间防病增产效果的比较。

表4是荧光93对小麦的防病和增产效果。

图1为荧光假单胞菌转座子Tn5诱变程序。

表1  荧光假单胞菌CN12及其Tn5诱变株对小麦全蚀病的温室

防治效果

处理  株高（mm）  地下部干重（mg/株）  发病级别（0-5）

Ggt对照  193  d  D  87.3  e  E  3.53  a  A

Ggt+CN12  226  c  C  110.9  d  D  3.03  b  B

Ggt+2942  260.2  b  B  166.5  c  C  2.5  c  C

Ggt+727  261  b  B  166.8  c  BC  2.37  cd  C

Ggt+1533  263  b  B  168.5  b  B  2.13  d  C

无Ggt，无  281  a  A  206.8  a  A  0  e  D

细菌

表2  荧光93对小麦全蚀病的防治效果

病菌接种  菌剂处理  死株和白穗率%  病指  产量（mg/盆

Ggt  -  100  91.67  638.5

Ggt  浸种  0  31.67  2439.8

-  浸种  0  0  2857.0

Ggt  土壤  0  30.00  2733.3

-  -  0  0  2260.5

病土  -  100  88.33  686.2

病土  浸种  0  33.33  2576.2

-  -  0  0  2238.4

Ggt为人工接种全蚀病菌，设4次重复;病土为宁夏自然病土，设5次重复。

表3  基因工程菌荧光93与自然菌株CN12对小麦全蚀病防

病增产效果的比较

处理  白穗率%  防效%  实产（kg/区）  增产%

CK  24.94  -  5.655  -

CN12  15.32  38.6  6.350  12.3

D93  8.31  66.7  7.195  27.2

试验设2块田6次重复，小区面积10平方米。白穗数每小区逐行调查，产量按小区单收单打。

表4  荧光93对小麦的防病和增产效果

人工接种  D93菌株  病指  产量  较发病对  较无病对

Ggt  处理  （mg/盆）  照增产%  照增产%

-  种子  0  2857.0±52.50  347.5  26.4

+  土壤  30.00  2733.3±76.40  328.1  20.9

+  种子  31.67  2439.8±53.55  282.1  7.9

-  -  0  2260.5±39.13  254.0

+  -  91.67  638.50±99.71  -  71.8