在植物中诱导赖氨酸过量生成的方法

摘要

一种增加植物中游离L—赖氨酸水平的方法，包括：(a)在植物组织源的细胞中导入一个外源基因，和(b)在所述细胞中表达所述外源基因，其中所述基因的第一DNA顺序编码二氢吡啶二羧酸合酶(DHDPS)，这种酶对内源产生的游离L—赖氨酸的反馈抑制作用基本上具有抗性。

说明书

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近些年来，随着基因转移技术的发展，人们能够赋予植物某些特殊性质。为了使宿主植物对逆境具有一定的防卫特性，曾进行过几种基因的转移。例如，有些基因可以增加植物对化学除莠剂的耐受性，如草甘膦（Comai，Nature        317：741-744，1985;Shah，Science        233：478-481，1986），三次磷酸（Phosphinothricin）（De        Block，EMBO        6：2513-2518，1987），溴苯腈（Stalker，1987，国际专利申请PCT/US87/00044），和磺酰脲类（Haughn，Mol.Gen.Genet.211：266-271，1988）。转移基因植物也可抵抗某些虫害（Adang，1985，欧洲专利申请公开号142，924;Vaeck，Nature        328：33-37，1987），真菌疾病（Taylor，Mol.Gen.Genet.210：572-577，1987）和病毒疾病（Abel，Science        232：738-743，1986;Nelson，Bio/Technol.6：403-405，1988）。

另一方面，植物设计也是一个热门课题，尤其是加入有有利特性的农作物。这种特性的实例之一即有些粮食作物改良的营养品质。人和单胃动物食品内的基本氨基酸-赖氨酸，是大多数谷类作物中三种最有限的养分之一。因此，以谷类例如谷、大麦、小麦、玉米、大米、小米、高梁等为主的食品，必须配以昂贵的合成赖氨酸或含赖氨酸的油籽蛋白粉。如果增加这些谷类或其他任何粮食作物内的赖氨酸含量，其价值意义是很大的。迄今为止，为了增加植物内赖氨酸的含量，一直沿用传统的育种方法。近些年来，又采用了基因诱变和细胞培养技术。

已经证实，玉米（Mertz，Science        145：279，1964;Nelson，Science        150：1469-1470，1965）、大麦（Munck，Science        168：985-987，1970）和高梁（Singh等人，Crop        SCi.13：535-539，1973）内存在着自然发生的高赖氨酸突变体。上述各种情况中，赖氨酸含量的增加并不是由于游离赖氨酸生成的增加，而是由于谷类总蛋白成分的转移所致。也就是说，对于赖氨酸不足的胚乳蛋白（醇溶谷蛋白），其赖氨酸水平的降低由富含赖氨酸的蛋白质（白蛋白、球蛋白、谷蛋白）来补充。尽管从营养角度看，这些突变体大有好处，但也会带来产量的降低和谷类质量的下降，因此限制了其农业上的应用。

另一种用来改善营养品质的途径是离体选择增加了游离赖氨酸含量的生化变种。赖氨酸是高等植物和微生物的氨基酸中“天冬氨酸家族”的成员（见图1）。因此，赖氨酸生物合成的调节与该家族内其他成员如苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸等的生物合成密切相关。对中间代谢产物流动的调节似乎主要是通过对关键酶的终产物反馈抑制进行。这些反应的第一步是，天冬氨酸激酶（AK）催化天冬氨酸的磷酸化，这一步对四种终产物都是共同的。第二个调节点是分支处的反应：即丙酮酸和天冬氨酰半缩醛缩合形成二氢吡啶二羧酸。这步反应是由赖氨酸生物合成所独有的第一步反应，该反应由二氢吡啶二羧酸合酶所催化。在所检查的植物中，这种酶受到赖氨酸强烈的反馈抑制（Wallsgrove等人，Phytochem.20：2651-2655，1981;Kumpaisal，Plant        Physiol.85：145-151，1987）。

已经证明，AK的存在形式不止一种（Miflin，1980，《植物生物化学，第5卷：氨基酸和衍生物》，Stumpf和Conn编，420-426页，ACademic        Press）。有一种形式的AK对苏氨酸的抑制具有敏感性，而其他形式的AK对赖氨酸的抑制有敏感性。在等摩尔赖氨酸和苏氨酸存在的情况下，可以抑制植物细胞培养物的生长。加入蛋氨酸或高丝氨酸（易于转化成蛋氨酸）后可逆转上述抑制作用（Green等人，Crop        Sci.14：827-830，1974）。Hibbert（Planta        148：183-187，1980）选择出对这种生长抑制有抗性的稳定的玉米愈伤组织系。这些组织系过量产生苏氨酸（6-9倍）及在较小的程度上过量产生蛋氨酸、赖氨酸和异亮氨酸（2-4倍）。已经证实，导致上述变化的原因是存在可耐受赖氨酸的天冬氨酸激酶（AK）。在再生成完整可育植株的那些系中，这种过量生成是一种稳定的可遗传特性（Hibbert等人，PNAS79：559-563，1982）。在烟草（Bourgin，1982，《由组织培养再生植株的可变性》，Earle和Demarly编，163-174页，Praeger，New        York）、大麦（Arruda，Plant        Physiol.76：442-446，1984）和胡萝卜（Cattoir-Reynaerts，Biochem.Physiol.Pflanzen        178：81-90，1983）中进行了相似的筛选。

曾经单独采用赖氨酸类似物，尤其是S（2-氨乙基）半胱氨酸（AEC），或者和赖氨酸苏氨酸选择结合在一起来分离过量生成赖氨酸的突变体。Sano等（J.Gen.Appl.Microbiol.16：373-391，1970）能够用AEC分离高赖氨酸的细菌突变体，并认为AEC是作为AK或DHDPS或者二者的假反馈抑制剂起作用的。有人曾试图在植物中分离类似的突变体，结果各不相同。Widholm（Can.J.Bot.54：1523-1529，1976）曾对烟草悬浮细胞进行诱变处理，得到能够过量产生10倍赖氨酸的抗AEC细胞系。还分离出了小米突变体，它可过量产生5-7倍的赖氨酸（Boyes等人，Plant        Sci.50：195-203，1987）。Bright（Planta        146：629-633，1979）选择到了抗AEC的大麦系，它只有在存在AEC的情况下才产生赖氨酸，表明这种大麦系属于AEC摄入突变体。而且也证实，AEC的抑制效应是通过掺入蛋白质而不是通过干扰赖氨酸的生物合成表现出来的。Schaeffer等人（Plant        Physiol.84：509-515，1987）依次利用AEC和赖氨酸苏氨酸筛选获取了水稻突变体，这种突变体在种子储存蛋白内含有高于14%的赖氨酸，但游离赖氨酸并不更高。Jacobsen（J.Plant        Physiol.123：307-315，1986）选择出一种抗AEC的土豆培养物。这种突变体比对照培养物具有更高的总氨基酸水平，但这并不是赖氨酸、苏氨酸或蛋氨酸的过量生成所致。Negrutiu（Theor.Appl        Genet.68：11-20，1984）使烟草原生质体进行诱变，然后用AEC选择，得到两种抗性细胞系，能够过量产生10-30倍的赖氨酸。生化和基因分析表明，存在着一种对反馈不敏感的DHDP合酶。这种特征以单一显性基因遗传。

迄今为止，还没有人用重组DNA和基因转移技术增加代谢产物的生成，从而提高植物的价值。不过，众所周知，大肠杆菌通过与高等植物基本相同的途径合成赖氨酸。由大肠杆菌dap        A基因编码的二氢吡啶二羧酸合酶虽然对赖氨酸具有敏感性（Yugari等人，Biochem.Biophys.Acta        62：612-614，1962），但与从植物内分离的相同酶比较，这种酶在体外对赖氨酸抑制作用的敏感性至少要小200倍。在多拷贝质粒上带有dap        A基因的大肠杆菌能产生大量的游离赖氨酸（Dauce-LeReverand，Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.15：227-231，1982），提示DHDPS所催化的是速率限制步骤。这种基因的顺序和特征已进行了分析（Richaud，J.Bacteriol.166：297-300，1986;Glassman，1988，理学硕士论文，Universityof        Minnesota，Minneapolis，MN）。

鉴于传统的育种和组织培养技术相对来说不易获得赖氨酸显著增加的植物，因此需要利用重组DNA和基因转移技术来得到这种植物。

本发明提供了一种显著增加植物内游离赖氨酸含量的方法，包括：（a）向植物组织细胞内导入外源基因，和（b）在上述细胞内表达外源基因，这种基因包含一种编码二氢吡啶二羧酸合酶（DHDPS）的DNA顺序。这种酶基本上能够抵抗内源游离赖氨酸的反馈抑制作用。在本方法的实际应用过程中，外源基因还包括一个连接在DHDPSDNA顺序5′端的第二DNA顺序，它编码叶绿体转移肽（CTP）。CTP使DHDPS定位于所述细胞的叶绿体内，从而能够增加游离赖氨酸的生物合成。

因此，本发明还提供了通过外源基因的导入而得到的转化的植物细胞，该外源基因表达一种基本上抵抗内源赖氨酸反馈抑制作用的DHDPS。由于现有技术能从大量植物组织的细胞再生完整植株，因此本方法还提供了一种转化植物，该植物利用DHDPS通过生物合成途径生成游离赖氨酸，所述的DHDPS是一种外源（外来的）基因的产物，并能基本上抵抗内生赖氨酸的反馈抑制作用。按照本方法转化的优选植物包括禾本科植物，例如上文中所列举的那些植物。这些转化植物的食用部分含有的游离赖氨酸与未转化的同种植物相比至少高50倍。

用于转化植物细胞的外源基因最好是含有DHDPS基因密码或其酶活片段的嵌合基因盒，它基本上具有对反馈抑制作用的抗性。这个表达盒还包含有一个第二DNA顺序，它编码氨基未端叶绿体转移顺序（CTS）。DHDPS基因或其片段以正确的读码框结合在CTS基因的5′端。这个外源基因最好受到在植物靶细胞内起作用的调节区的转录和翻译控制。由根癌农杆菌（A.tumefaciens）的Ti或Ri质粒转移给植物细胞的DNA顺序（如“T-DNA”片段）中，可得到这种调节区。例如，从编码章鱼碱合酶、胭脂碱合酶或甘露碱（mannopine）合酶的Ti或Ri质粒基因中可分离出一个有用的转录起始区。这种表达盒最好再含有一种编码植物细胞内的可选择功能的基因，如抗药性或抗除莠剂特性，以便能够易于识别转化的细胞及由其生成的植物。

本发明进一步的具体方案还包括一种掺入有此表达盒的表达载体如质粒，这种质粒能够在细菌如大肠杆菌或农杆菌中进行复制。通过电穿孔、显微注射、显微抛物注射或通过脂质囊等方法，可以将外源基因以“裸露”DNA的形式导入植物细胞的基因组中。还可通过根癌农杆菌介导的转化作用将结合外源基因的质粒导入植物细胞基因组中。

本文有关基因或基因片段所用术语“外源的”是指这种基因或基因片段是从一种或多种来源中得到的，这些来源不是最终进行表达的各种植物。这种来源可以是自然的，例如，这种基因可以从其他生物体如细菌、酵母菌、真菌等或各种植物中获得。编码活性DHDPS的基因的来源最好是大肠杆菌dap        A基因。基因来源也可以人工合成，例如可以在体外用化学合成的方法制备基因或基因片段。

涉及到被导入植物细胞的外源基因或其片段时，本文所用术语“表达”是指这种基因稳定地结合在细胞的基因组内，这样由此基因编码的产物如DHDPS酶，在细胞内生成时即以活性形式存在。例如，这种活性形式的DHDPS可催化赖氨酸的内源生物合成步骤。

在描述内源赖氨酸对DHDPS的反馈抑制作用时，所用术语“基本上能抵抗”是指：即使植物内积累的赖氨酸显著超过不合成抗性DHDPS的同种植物所积累的量，DHDPS仍然保留有催化功能。例如，按照本发明得到的新植物与那些只含有天然DHDPS的同种植物相比，其中可提取的赖氨酸含量至少高大约10倍，优选至少高大约50倍，例如大约高50-250倍。此外，游离赖氨酸的存在水平不对所改造的特殊植物产生毒性。而且，这种被称为“转化的”植物细胞或植物所具有外源基因或其片段是以稳定的、具有功能的和可遗传的形式整合在它们的基因组中。

图1是赖氨酸生物合成途径示意图，其中所标字母代表下列意义：a-天冬氨酸激酶;b-天冬氨酰半醛脱氢酶;c-二氢吡啶二羧酸合酶;d-二氢吡啶二羧酸还原酶;e-琥珀酰氧代氨基庚二酸合酶;f-琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶;g-琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶;h-二氨基庚二酸和i-内消旋二氨基庚二酸脱羧酶。

图2是实例1中所述dap        A基因的调控示意图。

本发明涉及一种获取能生产高水平游离赖氨酸植物如谷类的新方法。通过导入和表达编码DHDPS的细菌基因而使赖氨酸过量生成，这里DHDPS是植物和细菌内赖氨酸生物合成过程中的一个分支反应酶。天然的植物DHDP合酶对于L-赖氨酸的反馈抑制具有高敏感性，因此构成代谢途径调节的关键位点。与此相反，从大肠杆菌分离出的DHDP合酶在至少高于200倍的L-赖氨酸存在的条件下还具有活性。

必须经过一系列长而复杂的操作，才能向植物内导入一种编码赖氨酸耐性的DHDP合酶的基因，从而提高植物内所积累的游离赖氨酸的含量。

第一步，先在体外对细菌DHDP合酶基因进行修饰，使之带有植物细胞内的基因表达所需的调节信号。由于植物内赖氨酸生物合成途径根据报道是隐蔽在叶绿体内的，因而最好对细菌基因加以修饰，增加编码氨基末端叶绿体转移肽的顺序，以便引导基因产物到达这些细胞器。

为了改变赖氨酸的生物合成，必须将基因导入植物细胞内并鉴别这些转化的细胞。并且要将这些基因稳定地掺入植物细胞的基因组内。该基因的转录信号必须能被植物细胞识别并在植物细胞内发挥作用。也就是说，必须将基因转录成信使RNA，这种mRNA必须稳定地存在于细胞核内并完整地转送到细胞质内进行翻译。这种基因必须具有适于植物胞细核糖体识别的翻译信号，从而由其准确地进行翻译。这种多肽基因产物必须避免细胞质内的蛋白水解作用，并且具有能够产生酶活性的三维构象。细菌DHDP合酶还必须进一步在赖氨酸的生物合成中起作用，也就是说，为了得到所需的底物（天冬氨酰半醛和丙酮酸）并传递适当的产物（二氢吡啶二羧酸），必须使此酶位于靠近催化生物合成（大概在叶绿体内）邻近步骤的天然植物酶的附近。

即使所有这些条件都满足了，也不一定能够成功地达到赖氨酸的过量生成。一定不能有其他用以补偿的控制机理向下调节DHDP合酶的反应步骤。这不仅意味着不存在其他对生物合成的抑制，而且也不存在增加赖氨酸分解速率的机理。赖氨酸过量生成的水平还一定不能对植物产生毒性。最后，赋予植物的特征要有稳定性和可遗传性，以便进行商业开发和使用。

对在植物细胞内表达和起作用的细菌基因进行修饰

通过二氨基庚二酸途径，可从任何能够合成赖氨酸的微生物中得到编码二氢吡啶二羧酸合酶（DHDPS）的基因。选择基因的关键标准在于基因产物（DHDPS）对于赖氨酸抑制作用的相对敏感度。用作本方法的起始物质最好是大肠杆菌dap        A基因，它编码一种具有活性的32KD的DHDPS，它对于赖氨酸的反馈抑制作用具有高度抗性。可以采用现有技术中众所周知的方法从微生物中分离这种基因。这些方法包括从基因组文库中筛选已知的DHDPS突变体的互补物;运用免疫学方法筛选由基因文库表达的多肽;从基因组文库中筛选与放射性标记的寡核苷酸探针杂交的片段等。

寡核苷酸探针可根据来自其他种的基因的顺序进行合成，或根据分离的DHDPS亚基多肽顺序的反译顺序合成。再者，还可通过化学方法完整或部分地合成这种基因。

分离出这种基因后，采用标准的重组DNA操作和分子分析确定该基因的特征。这些方法在现有技术中是已知的，Maniatis等对这些技术进行了描述（《分子克隆：实验手册》，冷泉港实验室，NY，1982）。有代表性的方法是，将携带DHDPS基因的DNA片段尽可能地分成最小的功能片段。也就是说，通过采用Bal31消化（即去除已知的限制性核酸内切酶片段）等将邻接该基因的无关DNA去掉，得到仍可以与DHDPS突变体互补的最小DNA片段。此片段一般不到3000碱基，更通常的情况下约为1000碱基。这种DNA片段的核苷酸顺序可用任何常规方法测定。然后鉴别出可译框（编码顺序）、推测的RNA聚合酶结合位点（启动子）、核糖体结合位点和转录终止信号顺序等。可以采用S1-核酸酶谱分析或引物修复分析技术确定转录起始位点。对质粒上携有分离基因的细菌（典型的是大肠杆菌）提取物进行测定，以确定是否存在活性DHDPS，并在体外测定该酶活性对于外加L-赖氨酸的相对抗性。

确定了基因的特征后，即对基因进行修饰，使基因产物能在宿主植物细胞内整合、表达和发生作用。优选的修饰方法是：1）将编码氨基末端叶绿体转移肽的DNA顺序结合在DHDPS编码顺序的5′端;2）用可被植物细胞识别并在其中起作用的5′和3′调节顺序取代细菌的5′和3′调节顺序;3）将这种具有植物特异性的表达盒插入适于将DHDPS基因导入宿主植物细胞的载体中，并使其稳定地确立在其中。叶绿体转移肽（CTP）DNA顺序的加入

迄今为止，在研究的所有植物中，赖氨酸生物合成酶类都位于叶绿体内。因此，为了合适地定位外源基因产物，将编码叶绿体转移肽顺序的DNA片段以正确定向结合在编码DHDPS的DNA顺序5′端上，因此可从融合基因转录本中翻译得到完整的转移肽-DHDPS前蛋白。这个有用的转移肽（典型的约长40-70个氨基酸）在翻译后起作用，将前蛋白引入叶绿体内，前蛋白的进入需要消耗能量。在进入过程中或刚刚进入之后，转移肽被切下以形成成熟多肽。

可以从各种植物核基因中获得编码这种转移肽的DNA片段，只要所说的基因产物表达为含有氨端转移肽的前蛋白并被运到叶绿体内就行。已知包括这种转移肽顺序的植物基因产品可以是由核基因编码的核酮糖双磷酸羧化酶小亚基、铁氧还蛋白、叶绿素a/b结合蛋白、叶绿体核糖体蛋白等，以及某些热休克蛋白、氨基酸生物合成酶类如乙酰羟基酚合酶和3-烯醇式丙酮酰磷酸莽草酸合酶等。另外，还可通过化学方法，按照已知转移肽的顺序（如上述转移肽），完全或部分合成编码转移肽的DNA片段。

不管编码这种转移肽的DNA片段来源如何，它应当包括一个翻译起始密码子，并且编码一个能被宿主植物叶绿体识别并在其中正确发挥作用的氨基酸顺序。还要注意转移肽和成熟DHDPS亚基之间结合处的氨基酸顺序，此处正是前蛋白被切割以产生成熟DHDPS的地方。已经鉴别出某些保守的氨基酸顺序并可用它们作为指导原则。要使转移肽编码顺序和DHDPS编码顺序进行准确融合，则需要操作其中之一或二者的DNA顺序，以引进（例如）一个方便的限制位点。这可以通过下列方法完成，包括定位诱变，插入一个化学合成的寡核苷酸人工接头等。

可如下述在体外测定叶绿体转移肽的功能：将转移肽-DHDPS基因表达盒导入若干质粒载体的任一个中，使基因位于合适的方向，并受到噬菌体启动子如SP6、T3、T7等的转录控制。然后使产生的质粒在编码顺序3′端的单一限制位点处消化以形成线性DNA分子。然后利用对上述启动子有特异性的RNA聚合酶，使此DNA分子进行转录反应。这种反应的产物一般是每微克线性DNA模板有10-20微克基本上纯的信使RNA（_mRNA）。在一种或多种放射性标记氨基酸存在的情况下，利用体外翻译系统如小麦胚芽或兔网织红细胞溶解物，对这些_mRNA转录本进行翻译，产生放射性标记的前蛋白。

然后将放射性标记的前蛋白和分离的完整叶绿体在光下一起孵育以测定其输入率。然后，用蛋白酶或蛋白酶组合物如嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等处理叶绿体。这种处理可降解所有未隐蔽在叶绿体内的蛋白。在蛋白酶抑制因子存在的情况下洗涤后，利用旋涡、冻/融处理、降低渗压剂或这些方法的结合使叶绿体溶化。溶解产物可以：（a）直接测定，（b）可首先利用由标准方法产生的DHDPS亚基抗菌抗血清进行免疫沉淀，（c）可从类囊体膜蛋白（沉淀物）中离心分离基质蛋白（上清液），（d）或者将上述方法结合起来应用。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析测定是否存在相当于成熟细菌DHDPS亚基分子量的放射性标记蛋白带。这一蛋白带的存在表明，前蛋白已经输入并加工成正确的大小。

植物识别的调节顺序的加入

细菌基因如DHDPS在植物细胞内的表达，需要一些能被植物细胞识别并在其中起作用的调节顺序。这些顺序包括5′转录起始区和3′翻译和转录始止区。这个5′转录起始区包括RNA聚合酶结合位点（启动子）。它还包括一个转录调节区，通过化学或物理的诱导或抑制产生调节作用。

这种调节的实例包括光诱导的核酮糖双磷酸羧化酶小亚基的表达，热诱导的热休克蛋白的表达，由植物激素或其他代谢产物调节的基因，发育调节的表达，损伤或逆境诱导的表达等等。

5′顺序还包括转录增强子顺序。这个5′区可以是宿主植物天然有的，或者来源于该顺序能在宿主植物中起作用的其他植物。还可从根癌农杆菌的Ti质粒基因中得到合适的顺序，这些基因包括章鱼碱合酶、胭脂碱合酶、甘露碱合酶等，或者从某些病毒基因获得。另外，转录起始区可用化学方法整体或部分合成。

3′区包括转录终止顺序，还可以包括聚腺苷酸化信号顺序。这个区可从与5′顺序来源相同的基因中获得，或者来自不同的基因。也可以通过化学方法合成这种基因。

产生的表达盒包含一个5′转录起始区，一个叶绿体转移肽编码顺序，细菌DHDPS亚基编码顺序，翻译终止密码子和一个3′转录终止区。这个基因盒一般不超过5000碱基，最好在2000-3000碱基之间。

在用于转化植物的载体中插入表达盒

选择向植物细胞内导入细菌DHDPS表达盒的载体时，要根据所选择的转化方法而定，而转化方法要以宿主植物和植物组织来源的选择而定。有大量方法可用来向单子叶和双子叶植物细胞内导入外源DNA，包括利用显微抛物注射、显微注射、电穿孔和Ca⁺⁺沉淀DNA一起孵育、和含有外源DNA的脂质体一起孵育（最好有PVA和Ca²⁺的存在）、病毒系统和农杆菌介导的转化作用等。见M.Fromm等人，PNAS>

前五种方法用“裸露”的DNA进行，即可简单地使表达盒载于任何大肠杆菌的克隆载体中，如质粒_pBR322、_pRK290、_pACYC184等等。如果是病毒载体，则应使这种系统保留复制功能，而且不能诱导疾病。

对于农杆菌介导的转化来说，表达盒结合在农杆菌的Ti或Ri质粒中并邻接质粒的片段，并代表Ti或Ri质粒转移的DNA（T-DNA）的右边缘或左边缘。这可以促进外源基因至宿主植物细胞基因组中的整合作用。此载体还包括促进质粒在农杆菌和大肠杆菌细胞内复制的某些顺序。

所有的DNA操作最好都在大肠杆菌内进行。通过DNA的直接转化，结合等方法将携有DHDPS表达盒的最终质粒转移到农杆菌细胞内。这些农杆菌包括一种也是来自Ti或Ri质粒的第二质粒。此第二质粒携有所有将外源DNA转移到植物细胞内必需的Vir基因。

不管选择怎样的载体及转化方法，通过使其含有编码能在植物细胞内选择的功能的基因，则能促进对于转化的植物细胞的鉴别。优选基因是那些编码植物细胞化学抑制剂抗性的基因，如对潮霉素、卡那霉素、氨甲喋呤和某些除莠剂的抗性。这种可选择标记可载于和携带DHDPS质粒一起转化的另一质粒上，或者载于与DHDPS基因盒相同的质粒上。在农杆菌介导的转化中，这种可选择标记可位于T-DNA边缘区所邻接的质粒区域之内。另一选择是，可用一个可筛选的标记如β-葡糖苷酸酶基因取代这个可选择标记。用这种基因转化的细胞，可通过用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸（X-Gluc）处理后产生的一种蓝色产物所鉴别。

植物的转化和再生

选择何种植物组织源用于转化，需根据宿主植物的性质和转化方法而定。有用的组织源包括愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶片、茎片、雄穗、花粉、胚、胚轴、块茎切片、分生组织区等。这种组织源最好在转化后保留有再生完整可育植株的功能。

转化是在有利于所选植物组织的条件下进行的。将植物细胞或组织以一段有效的时间暴露于带有DHDPS表达盒的DNA。此时间范围包括从对其进行短于1秒的脉冲电穿孔，直至在带有质粒的农杆菌细胞的存在下进行2-3天的共培养。所用缓冲液和培养基对于植物组织源和转化方法可以不同。很多转化方法采用将一个悬浮培养细胞饲养屋（如烟草或黑色墨西哥甜菜）置于固体培养基平板的表面，用一圆形无菌滤纸将它与应转化的植物细胞或组织隔开。

用DNA进行处理后，将植物细胞或组织培养不同时间后进行选择，或者立即将其暴露于选择剂中（如上述）。涉及暴露于农杆菌的方法还包含一种农杆菌细胞生长的抑制剂。一般使用的化合物为头孢氨噻和羧苄青霉素。选择中所用培养基的配制，要保持转化的愈伤组织或是将培养细胞处于未分化状态，或者能够从愈伤组织、叶或茎片、块茎圆片等中发芽。

如发现细胞或愈伤组织能在一般的抑制浓度选择剂中生长时，则可推测它们已被转化，可以使之在同样的培养基中再传代培养好几次，以去除无抗性的部分。然后，可检测细胞或愈伤组织中是否存在有细菌DHDPS基因盒，或可使之进行已知的植物再生过程。在涉及直接发芽的方法中，那些出现于选择培养基中的芽被认为是已经转化，可以将其切下进行种植，种植在适于生根的选择培养基中，或简单地在根诱导化合物中浸泡后直接种植于蛭石中。

再生植株及其后代的特征

为了产生表现出增加游离赖氨酸水平的基因转移植物，必须将细菌基因导入植物细胞并使其整合至植物基因组中。所选择的对抑制剂具有抗性的植物细胞和组织，可能在转化处理过程中获得了编码这种抗性的基因。由于这种标记基因一般与细菌DHDP合酶基因相关联，因而可以推测已经同样获得了细菌的DHDP合酶基因。然后，可用对细菌DHDP合酶基因有特异性的探针进行Southern印迹杂交分析，以证实外源基因已被摄入植物细胞内并整合在基因组中。这种技术也可以测出所掺入的拷贝数。同样，可用全部细胞RNA和/或富含聚腺苷酸区的细胞RNA进行Northern杂交印迹分析，以对外源基因成功地转录为_mRNA进行检测。

转录之后，必须由植物核糖体将_mRNA翻译成多肽，如细菌DHDP合酶亚基，而此亚基必须具有能产生催化活性的三维构型。表现出携有并转录细菌DHDP合酶基因的植物细胞或组织，可通过提取细胞或组织并进一步证实赖氨酸耐性DHDP合酶活性的存在而确定其特征。这种体外赖氨酸耐性最好可比得上微生物提取物中存在的赖氨酸耐性（即作为基因来源的微生物），而且应当易于与对照植物细胞或组织提取物的对赖氨酸具有较高敏感性的天然DHDP合酶活性区别开来。根据构建基因盒所用的转录起始和调节顺序，此活性可从所有植物组织中，从选择的组织中，或仅在选择的诱导条件下检测出。

不管细菌DHDP合酶活性位于植物内什么位置，它必须存在于植物细胞内，以便能参与赖氨酸的生物合成，催化底物转化为产物。可通过测定植物细胞和组织对赖氨酸类似物S-（2-氨基乙基）-半胱氨酸（AEC）的相对耐受性，来评价这种细菌DHDP合酶参与该反应的活性。与赖氨酸相似，AEC是一种植物DHDP合酶的有效抑制因子。使植物细胞或组织暴露于抑制浓度的AEC中，可有效地使其处于赖氨酸饥饿状态。但大肠杆菌内的DHDP合酶对于这种抑制作用的敏感性较小。含有活性细菌DHDP合酶的植物细胞或组织对于一般抑制浓度AEC具有耐受能力，这有利地表明此细菌酶在赖氨酸生物合成中发挥了适当的作用。

如果这种细菌DHDP合酶能促进赖氨酸的生物合成，而且如果不存在其他调节游离赖氨酸含量的机理，那么游离赖氨酸的生成量要高于对照植物细胞或组织的含量。对基因转移植物细胞或组织的三氯乙酸提取物进行逆向HPLC分析，可测定游离氨基酸水平。

使按照这种机理产生大量游离赖氨酸的植物生长到成熟期。使这些植物开花并自交授粉或与合适的亲本系杂交而获得种子。然后分析种子中所需特征的遗传性。

最初筛选种子时，使其在抑制对照种子幼苗生长的AEC浓度中发芽生长。使对AEC表现出耐性的幼苗成长，并如上述确定最初的再生植株的全部特性。

通过这种转化作用能够改良的植物包括下列植物，但不只限于这些：加工植物（大豆、Canola、土豆、西红柿、羽扁豆、向日葵和棉子）、饲料植物（紫花苜蓿、丁香和酥油草）和谷类（谷、小麦、大麦、燕麦、大米、高梁、小米和黑麦）。这种植物或其部分可以直接食用或做成食品，也可以将提取的赖氨酸用作食品添加剂。

尽管本文所说的游离赖氨酸含量在转化植物的叶子中被提高，但可以期望，本方法也能增加植物其他器官包括块茎和种子内的游离赖氨酸含量。

本发明可从下述实例中得到进一步的详细描述。

实例1

A.材料及方法

根据生产厂家推荐的方法使用限制性核酸内切酶、T4连接酶、多核苷酸激酶以及牛小肠磷酸酯酶。使用由Maniatis等人提供的标准DNA重组技术、大肠杆菌细胞的转化及分子分析方法（《分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室，New        YorK，1982）。

所有体外的转录（SP6）与转译（兔网织红细胞溶解物）使用得自Promega        Biotec（Madison，WI）的试剂并根据厂家的说明进行。

寡核苷酸用氨基磷酸酯法经化学方法合成（Caruthers，Science        230：281-285，1985）。

在所有的植物细胞转化中使用根癌农杆菌LBA4404（_pAL4404）（Hoekema等人，Nature>

dap        A基因的分离与特性已在Glassman的“大肠杆菌dapA基因的克隆与特性”[M.S.Thesis，u        niv.of        Minnesota，Minneapolis，MN（1988）]中描述，在此引用为参考文献。

这种基因是从大肠杆菌基因组文库中分离出来（Clarke and Carbon Collection of hybrid Plasmids，Yale University School of Medicine，New Haven，CT）。携带dap A基因的质粒（_pLC1730）片段被亚克隆在克隆载体_pBR322上。携带dap>

特别有趣的是_pDAP1763及_pDAP1205质粒。_pDAP1763在1564bp>pDAP1205携有1375bp的NdeⅠ-SphⅠ片段，它没有编码顺序的最后13个碱基和全部非转译的3′顺序。两种质粒都是_pBR322的衍生物。

B.叶绿体转移肽顺序

一种豌豆叶绿体转移肽的DNA编码顺序可以通过首先合成这种顺序的亚片段，然后将其连接而构建。

根据公开的豌豆核酮糖双磷酸羧化酶小亚基基因的叶绿体转移肽顺序（Cashmore，《植物遗传工程》，A.Hollaender编，Plenum Press，1983），通过化学方法合成8个寡核苷酸（每链4个）。6个内部的5′端碱基用T4多核苷酸激酶磷酸化，然后将100微微摩尔的所有8个寡核苷酸混合于70μl的总体积中。将10μl此混合物与100ngHindⅢ-SphⅠ消化的_pPol26一起（Robbins等人，J.Virol.58：339-347，1986）在95℃下变性5分钟，室温放置2小时退火，然后将其连接得到_pSTP31。这个合成的顺序由一个HindⅢ5′伸出端、30bp非转译的前导顺序、编码57氨基酸转移肽（tp）的171bp，以及代表转移肽进化上保守的分裂位点的3′SphⅠ伸出端。

C.修饰用于植物细胞中的dap        A基因

将dap        A基因编码区以外的细菌DNA除去，或用植物细胞可识别和加工的顺序取代。

为加入上述的转移肽顺序，修饰dap A编码顺序的5′端使之产生一个SphⅠ位点。这种修饰通过一个29bp合成的人工接头取代_pDAP1763中108bp>pDAP1900。

将包括dap A编码顺序（少于最后13个碱基对）的_pDAP1900的865bp>pSTP31连接，从而使dapA编码顺序的5′端与合成的转移肽顺序的3′端相连，并恢复了豌豆小亚基前蛋白的天然断裂位点。所生成的质粒称为pDAP4001。这种质粒中的多人工接头在编码顺序3′端提供了一个SacⅠ位点。用这个位点将1070bp        HindⅢ-SacⅠ片段的转移肽（tp）：：dapA盒送入HindⅢ-SacⅠ切割的pGEM3中（Promega        Biotec，Madison，WI），生成pDAP4104质粒。

同样修饰dapA基因编码顺序的3′端以完成下面四件事情：（1）破坏SphⅠ位点（使5′端产生的此位点成为单一的），（2）恢复在最初构建_pDAP1205时失去的最后4个氨基酸，（3）加入2个终止密码子，和（4）在邻接编码顺序末端的地方产生一个BamHI位点。

这是通过用SphⅠ和BamHⅠ消化质粒_pDAP1205，并在_pBR322DNA的147bp处连接一个25bp合成的人工接头而完成的，并产生质粒_pDAP1252。这种SphⅠ位点的破坏，使所推测氨基酸顺序第289位密码子由丙氨酸变成甘氨酸。

新产生的BamHⅠ位点用来加入能被植物细胞识别的转录终止信号。用BamHⅠ和HindⅢ消化_pDAP1252，并与_pRL101的260bp>pTic58胭脂碱合酶（nos）基因的转录终止信号及多腺苷酸信号顺序（核苷酸673-422，Beven等人，NAR.11：369-385，1983）。此构建体称为_pDAP1264。

最后，将修饰的dapA末端连接以重组基因。用BstEⅡ（位于dapA编码顺序的中间）和EcoRⅠ（紧靠nos polyA顺序的3′端）消化_pDAP1264，并连接于BstEⅡ-EcoRⅠ消化的_pDAP4104中。此质粒称为_pDAP4201，它携有合成的叶绿体转移肽（STP）顺序，和与之相连的dapA编码顺序及nos>pGEM3中SP6启动子的转录控制下。如下面第4段所述，用这种结构分析转移肽的体外功能。

为了对植物细胞内的基因功能进行活体研究，将上述的STP：：dapA：：nos3′盒如下述置于CaMV的35S启动子的控制下。在_pPol26的多人工接头的Bam>pCaMVPRO（V.Walbot惠赠;参见Fromm等人，PNAS，82：5824-5828，1985）的携有35S启动子顺序的450bp>pPol26产生质粒_p35-227。此构建体中的HindⅢ位点位于紧靠启动子的3′端。携带全部dapA基因盒的_pDAP4201的1340bp>pDAP4307）。

D.转移肽的体外功能

应用体外叶绿体输入分析法（della-Cioppa等人，Bio/technology 5：579-584，1987），测定合成的转移肽顺序将dapA基因的产物输入完整叶绿体并由其加工的能力。按下述制备用于检测的³⁵S-甲硫氨酸标记的前蛋白。

用EcoRⅠ消化_pDAP4201，并用SP6聚合酶进行转录（Melton等人，NAR12：7035-7056，1984）。用不含RNA酶的DNA酶Ⅰ消化除去质粒DNA后，用乙醇沉淀_mRNA，再悬浮于25μl无菌去离子蒸馏水中进行分光光度法测定。用8μg这种_mRNA进行体外转译（兔网织红细胞溶解物），其中，在145μl总体积中包括2.5μCi/μl的³⁵S-甲硫氨酸（New>

用对豌豆籽苗描述的方法（Bartlett等人《叶绿体分子生物学方法》，Edelman等人编，Elsevier        Biomedical        Press，1982），从长叶莴苣（Latuca        sativa）的去脉叶片中分离有活性的完整叶绿体。分离出的叶绿体再悬浮于输入缓冲液中（50mM        HEPES，PH7.6，0.3M山梨醇），调至2mg/ml叶绿素，使用前置于冰上。

将50μl体外转译产物（主要是tp：：DHDPS亚基前蛋白）在冰上与110μl输入缓冲液、25μl0.1ML-甲硫氨酸、15μl0.1M ATP及100μl叶绿体混合。将输入反应混合物放在一定角度，在室温下和150W白炽灯前轻轻旋转。在5、10和15分钟时用吸管取70μl样品，转入置于冰上的盛有7μl在10mM CaCl₂中的1mg/ml嗜热菌蛋白酶的艾氏试管中（Cline等人，Plant>2的试管中作为对照。所有试管中于冰中保温20分钟，然后用含50mM>

使基质蛋白质样品通过12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Laemmli，Nature        227：680，1970）。将凝胶染色、干燥并进行放射自显影。对照样品（不含蛋白酶）显示出相应于tp：：DHDPS亚基前蛋白的42千道尔顿带。所有三个用嗜热菌蛋白酶处理的样品都没有42千道尔顿的带，而代之以泳动至大约32千道尔顿处的带，它没有受到蛋白消化作用，由此可断定它被输入叶绿体中了。32千道尔顿的蛋白质相应于成熟的细菌二氢吡啶二羧酸合酶亚基的分子量。

E.双载体_pBVI的构建

下面一段描述如何构建用于将修饰的dapA导入植物细胞中的载体。此载体含有_pTiAch5的T-DNA左和右边缘（它们可以促进基因与植物基因组的整合）、大肠杆菌的可选择标记（氨苄青霉素抗性）、根癌农杆菌与烟草（卡那霉素抗性）的可选择标记及可使之在大肠杆菌和根癌农杆菌中进行质粒复制原点顺序。

1.T-DNA边缘的亚克隆

用BamHⅠ和ClaⅠ消化_pOTY8（Hoekema，同上）并分离1206bp片段（核苷酸1-1206，参见Barker等人，Plant>pTiAch5>LDNA左侧边缘。将此片段与BglⅡ-ClaⅠ消化的_pP0126中连接，从而产生质粒_pOTBLI。

同样可以从_pOTY8得到右侧边缘，将其作为5766bp>pPol>pTB11828。

2._pS_a复制原点的亚克隆

用HincⅡ及BamHⅠ消化_pUCD2（Closc等人，Plasmid>pS_a复制原点。将2900bp>pPol>pPolS_a。

3.含有T-DNA左右边缘及_pS_a复制原点的质粒（_pBR322LRS_a）的构建

按下述将T-DNA左右边缘及_pS_aori插入_pBR322中。用ClaⅠ及HindⅢ（核苷酸602，Barker，同上）消化_pOTBLI产生604bp片段，然后用DNA聚合酶的Klenow片段平整其末端。将此DNA片段插入_pBR322的PvuⅡ位点产生_pBR322L。使右边缘载于_pTB11828的912bp>pBR322L中而产生_pBR322LR。

_pBR322LR的杂交ClaⅠ位点对大肠杆菌MC1000的甲基化作用敏感，因此能抵制ClaⅠ消化。将质粒转入大肠杆菌GM272（dam^-，dcm^-）（Marinus等人，J.Bacteriol.114：1143-1150，1973）中，可将_pPolS_a的2900bp>pS_a片段插入用EcoRⅠ-ClaⅠ消化的_pBR322LR中。所得到的质粒称为_pBR>a。

4.卡那霉素抗性标记的构建

可赋予根癌农杆菌和植物卡那霉素抗性的选择标记用来自_pTiAch5>RDNA转录本24的启动与构建。此启动子是作为1503bp>pRK290-Eco△Cla（Gelvin等人，Mol.Gon.Genet.199：240-248，1985）中分离出来，代表核苷酸21631-20128（Barker，同上）。将此片段连接于用EcoRⅠ和ClaⅠ消化的_pPol>pPolPTR。用紧靠转录本24启动子3′端的多人工接头中的BamHⅠ位点用来插入Tn5的1500bp>

707bp PvuⅡ片段的_pTiAch5章鱼碱合酶（ocs）的多腺苷酸信号顺序从_pTB11828（核苷酸125541-11834，Barker，同上）中分离出来。将此片段连接在用SmaⅠ消化的_pPolNPTⅡ中，取代NPTⅡ编码顺序3′端的无关的500bp>pPolNPTⅡ-A。

5.在_pBR322LRS_a中插入选择标记

将3100bp XhoⅠ片段的_pTR：：NPTⅡ：：ocs3′基因盒从_pPolNPTⅡ-A转入用SalⅠ消化的_pBR322LRS_a中，从而产生_pBVI。这种11.5Kb的质粒含有（从单一的EcoRⅠ位点开始按顺时针方向）下述成分：宿主范围较广的pSa>pBR322的1415bp（SalⅠ至PvuⅡ）、左边缘、以及包括复制起点和氨苄青霉素抗性基因的_pBR322的PvuⅡ-EcoRⅠ片段。

F.含有修饰的dapA基因的转化载体的构建（_pDPZ4474和_pDAP4511）

位于_pBVI右边缘中单一的HpaⅠ和BamHⅠ位点用来插入CaMV_p35S：：STP31：：dapA：：nos>pDAP4307中邻接此基因盒的多人工接头中的位点，将1830bp>pBVI中，从而产生_pDPZ4474。在此构建体中，dapA基因位于NPTⅡ基因前，并按照与NPTⅡ相同的方向转录。

同样，将_pDAP4307的1830bp>pBVI中，从而产生_pDAP4511。在此构建体中，dapA基因也是位于NPTⅡ的可选择标记前，但是方向相反，因此它相对于NPTⅡ是反方向转录的。

利用VanVliet等人描述的方法（Plasmid 1：446-455，1978），将_pDPZ4474（ATCC67721）和_pDAP4511转化至根癌农杆菌LBA4404（_pAL4404中。在含有卡那霉素（50μg/ml）的平板上选择转化体，并划出来进行单菌落纯化。

G.烟草（Nicotian        tabacum）SRI的转化与植物再生

载有_pDPZ4474、_pDAP4511或_pBV1的根癌农杆菌LBA4404（_pAL4404）的培养物用来与烟草叶圆片进行共培养转化。用无菌水处理的一组叶圆片作为对照。

基本上根据Horsch等人的方法（Science227：1229-1231，1989），转化烟草SRI植物叶片，但有下述不同：农杆菌培养在523培养基中（Kado等人，Physiol.Plant        Pathol.2：47-59，1972），其中加入有利福平（20μg/ml）、链霉素（100μg/ml）及卡那霉素（50μg/ml），培养在28℃进行48小时。用于叶片前冲洗并浸泡在无菌水中;用黑色墨西哥甜菜悬浮培养物作为营养盘上的饲喂培养物;所有固体培养基都含有2.5g/l        Gelrite（Scott        Laboratories，Omaha，NE）以代替琼脂。

在营养盘中两天后，将叶片放入生芽培养基中（与营养培养基相同，但含有500μg/ml羧苄青霉素及0，100或200μg/ml的卡那霉素，不含饲喂培养物及滤纸）。用石腊密封营养盘，并在26℃以12小时光周期保温。当芽长到1cm时将其切下，转入生根培养基中（不含激素），其中含有与发芽时同样浓度的羧苄青霉素及卡那霉素。根长出时，将小植株放入蛭石中，然后转入土壤中。

H.在再生的烟草植株中筛选dapA基因的表达

首先通过评价植物组织对于赖氨酸类似物S-（2-氨乙基）半胱氨酸（AEC）的抗性来筛选导入的dapA基因的表达。AEC是植物二氢吡啶二羧酸合酶的有效抑制剂，但是细菌DHDPS对它的敏感性小得多。如转化方法中所述由表面消毒的叶子制备圆片。将叶片放入发芽培养基中（每盘4片，每种处理两盘），培养基中加有1mM        L-赖氨酸和0、0.1、0.2或0.4mM        AEC。在每种植物试验中，营养盘都含有75μg/ml卡那霉素的发芽培养基，以进行可选择标记的检查。在26℃光下放置一周后，每一叶片都称重，确定每一处理的平均鲜重及标准误差。

AEC不存在时，所有植物叶片保持绿色并展开。每块叶片的鲜重在1周内从9mg增至60mg。在有AEC的对照组中，叶片生长被强烈抑制。放在至少含0.2mM AEC的培养基中的叶片呈棕色并且枯萎。与此相反，假设的dapA⁺植物叶片可以很容易地通过其保持绿色以及在AEC存在下生长的能力进行识别。许多AEC耐性植物可用这种筛选过程识别。下面详细描述了这类植物之一的特性。

I.dapA⁺烟草植物327的特性

1.AEC耐性

将植物327叶片与水对照植物101叶片对AEC存在的反应进行比较。结果列于表1。

表1.叶圆片AEC筛选^＊

鲜重（对照的重量百分比）

AEC（mM）        327        101

0        100        100

0.1        88        32

0.2        81        15

0.4        71        10

^＊一周后对叶片鲜重进行测量（每盘4片，每个AEC浓度两盘）。测定每种AEC处理的叶片的平均鲜重，并表示为不含AEC对照盘叶片平均鲜重的百分数。

2.叶提取物中赖氨酸耐性DHDP合酶的活性

按下列方法对327幼叶及由种籽长出的NT-SRI植株进行提取。在每克组织0.14g聚乙烯吡咯烷酮的存在下，在4℃下和2ml提取缓冲液（0.1M磷酸钾pH7.5，4℃，2mM        EDTA，1mMβ-硫基乙醇，10mM丙酮酸钠）中将1-2克去掉主脉的叶子磨碎。提取液经Miracloth（Calbiochem）过滤，然后以8000g（4℃）离心10分钟。在4℃和轻轻搅动下，在上清液中缓缓加入磨细的固体硫酸钠，使之达到40%的饱和度。离心去除沉淀。在上清液中加入66%饱和度的硫酸钠，按上述方法离心收集40-66%之间的沉淀。沉淀再次悬浮于柱缓冲液中（50mM        Tris-HCl        pH        7.5，4℃，1mM        EDTA，10mM丙酮酸钠，10%甘油），并通过Sephadex        G-25柱（Sigma）脱盐。

蛋白质浓度通过Bradford的染料结合法（RET）测定，用蒸馏水中的牛血清蛋白组分V粉末作为标准。

用O-氨基苯甲醛（ABA）检测法（Yugari等人，J.Biol.Chem.240：4710-4716，1965）对二氢吡啶二羧酸合酶的活性进行监测。用蒸馏水配制L-赖氨酸盐酸的母液，无菌过滤，在酶反应开始时加至所指出的浓度。在一系列时间点，取出200μl等分液，并在800μl终止缓冲液中停止反应（0.21M柠檬酸，0.53M磷酸钠pH5，25℃，使用前加入0.24mg用无水乙醇以10mg/ml新配制的O-ABA）。在25℃放置1小时后呈现粉红色，然后在520nm测定光密度。

327叶中DHDP合酶的活性比NT-SRI种籽长出的叶中DHDP合酶的活性高出约30倍。更有意义的是，加入100μML-赖氨酸时，327叶中酶活性具有完全的抗性，而500μML-赖氨酸存在时只有14%被抑制。与此相反，100μML-赖氨酸存在时，NT-SRI中DHDP合酶的活性有87%被抑制，而500μML-赖氨酸存在时，检测不出酶活性。

3.Southern/Northern杂交分析

根据Shure等人的方法（Cell 35：225-233，1983），从转化植物及101叶中分离基因组DNA。将每种植物的10μg DNA分别用BamHⅠ和BstEⅡ消化，通过0.7%琼脂糖电泳。用BamHⅠ消化产生一个具特征的1540bp内部片段，而BstEⅡ在dapA编码顺序中只有一个切口。凝胶在尼龙膜上吸印杂交（Southern，J.Mol.Biol.98：503-517，1975），使用³²P标记的_pDAP4307的1540bp>

同样进行Northern印迹分析，结果表明dapA基因有转录活性。利用从转化植物叶中分离的总RNA及寡聚dT选择的polyARNA表明，上述的同样的探针与一种含有约1100个核苷酸的RNA分子发生杂交。而101的DNA没有观察到杂交现象。

4.叶中游离赖氨酸的水平

制备327及101叶的三氯乙酸（TCA）提取液，进行游离赖氨酸水平的分析。将幼叶（1-2g）切成小片放在冰冷却的研缽中，以液氮覆盖磨成粉末。将磨碎的叶片冷冻干燥过夜，并测其干重。将每份冷冻干燥的样品放入冷却的研缽中，在2ml10%TCA存在下再次研磨。加入2mlTCA冲洗研缽。将TCA提取液合并，并在冰中保温30分钟，间或搅拌。将提取混合物在4℃离心20分钟，取出上清液放在冰上。同前述将沉淀物用2ml10%TCA再次提取，将上清液合并。将2ml合并的提取液用5ml乙醚提取3次。在分析前，将醚提取液在-70℃贮存。

使用Jones等人的邻苯二醛衍生法，经反相高效液相色谱测定游离氨基酸的水平（J.Chromatog.266：471-482，1983）。在NT-SR1的3份样品中，每克冷冻干燥组织平均有75μg游离赖氨酸。327叶的两份样品，每克冷冻干燥组织中分别含有15450μg和14630μg游离赖氨酸，或者说游离赖氨酸增加约200倍。

5.dapA基因的遗传性

烟草植物327开花后使其自花授粉并产籽。收集成熟干燥的种籽，用10%漂白剂对表面灭菌，然后用灭菌水冲洗。将种籽放入含有0、1、10、30、100和300μM        AEC的分格萌芽盘中（1/4MS盐，2.5g/l        Gelrite）（每盘50粒种籽，每种处理2盘）。用同样方法处理自花授粉的101种籽作为对照。所有种籽在3-4天后萌发。10天后，计算各盘中绿色籽苗的数目。2周后，从Gelrite中轻轻拔出籽苗，测量根的长度。结果列于表2，结果清楚地表明AEC耐性特征可以通过327的子代遗传。

表2        籽苗的AEC抗性

平均根长（对照的百分比）

AEC（μM）        327        101

0        100        100

1        111        46

3        87        33

10        51        27

30        46        18

100        21        0

注：2周后测量根的长度。对每份AEC处理样品的平均根长进行测定，结果表示为不含AEC培养基中样品平均根长的百分数。

本发明已进行了具体描述并提出了实施方案和技术。然而，应当理解，在不超出本发明的实质及范围内，可以对本发明进行改变。