一种用于肺癌早期诊断的外周血胞外囊泡microRNA生物标志物及其用途

摘要

本发明公开了一种用于肺癌早期诊断的外周血胞外囊泡miRNA生物标志物，其特征在于，所述外周血胞外囊泡miRNA生物标志物包括hsa‑let‑7b‑3p、hsa‑miR‑125b‑5p、hsa‑miR‑150‑5p、hsa‑miR‑101‑3p、hsa‑miR‑3168。本发明基于临床中LDCT检测出肺结节患者的外周血作为研究样本，具备更高的特异性，也更加可靠，研究结果对于从LDCT检测出肺结节患者中准确识别假阳性的肺癌患者具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及疾病早期检测技术领域，特别涉及一种用于肺癌早期诊断的外周血胞外囊泡microRNA生物标志物。

背景技术

肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌早期病情隐匿，通常无任何症状，但大部分患者在初诊时已处于中晚期，失去了手术切除的机会。晚期肺癌患者的五年生存率不足5%，而早期肺癌患者的五年生存率可达90%以上。因此，早期诊断是肺癌患者获得良好预后的一个重要机会。

肺癌在早期通常以肺结节的形式出现。影像学技术的快速发展提高了肺结节的检出率。然而，肺结节病因复杂，临床表现缺乏特异性，使得肺结节的良、恶性鉴别诊断有一定的难度。一般来说，对于直径>3 cm的结节有40-50%为恶性，直径介于0.5-1 cm的结节有25%-30%为恶性，而直径<0.5 cm的结节仅1%为恶性。研究表明，有相当一部分比例的肺结节患者术后病理显示为良性疾病。对这类良性肺结节患者进行手术切除，会导致过度治疗，增加这部分患者的痛苦。因此，如何从携带不同肺结节患者中准确诊断出携带恶性结节的肺癌患者在临床上具有重要意义。

目前，肺癌的早期诊断方法有胸部影像学、支气管镜检技术以及痰脱落细胞学检测等，但这些方法的检测效果均不理想。痰检诊断中央型肺癌的敏感性约为50%，而对周围型肺癌则不足20%。支气管镜检技术对中央型肺癌的诊断率约为90%，但对周围型肺癌，尤其对癌前病变的诊断率只有不到30%。胸部影像学检查方法包括X线胸片（CxR）、低剂量螺旋CT（LDCT）和PET-CT等。CxR检查的误漏诊率很高达50-90%，LDCT和PET-CT检测肺内结节的特异性差。据报道，在肺癌早期筛查和诊断中广泛应用的LDCT技术，其检测产生的假阳性可高达21%以上。因此，单独利用影像学方法很难准确诊断早期肺癌，尚缺乏有效的生物标志物结合影像学技术（LDCT）来提高早期肺癌诊断的特异性。

胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）是由不同细胞产生并释放到细胞外的囊泡，可分为多种类型。其中，小型胞外囊泡，又名外泌体，是一种直径约30-150 nm的膜性囊泡。它来源于晚期内吞体 (multivesicular bodies, MVB) 的囊泡，是细胞内吞泡膜向内凹陷形成含有多个小囊泡的多囊泡体，这种多囊泡体与细胞膜融合，释放到细胞外基质中。胞外囊泡运载的内容物有蛋白质、脂质、mRNA、rRNA、miRNA等。细胞在正常和病理条件下都能分泌胞外囊泡，其可参与细胞间的信息传递。而胞外囊泡的内容物能够表征一定的生理、病理状况。在多种疾病（如恶性肿瘤、免疫性疾病等）中，外周血中游离的胞外囊泡（外泌体）作为一种重要液体活检形式已得到广泛的关注和深入研究。

微小核酸(microRNA，miRNA)是近年来发现的一类长度为19—25个核苷酸的非编码小分子RNA。它主要通过与靶标基因3 'UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，在肿瘤的发生和发展过程中发挥着类似于致癌基因或抑癌基因的功能。miRNA的表达谱具有明显的组织特异性，在不同肿瘤中具有特定的表达模式。这些特点使得miRNA有可能成为肿瘤诊断新的生物学标记和治疗靶标。近期，有研究提示血液胞外囊泡miRNA在健康人群和肺癌患者、肺癌腺癌和肺鳞癌患者存在一些差异。然而，血液胞外囊泡miRNA作为生物标志物在鉴别良、恶性肺结节中研究较少，也没有发现并验证可用于提高肺癌早诊特异性的生物标志物。

本发明基于的研究采用临床中LDCT检测出肺结节患者的外周血作为研究样本，抽提外周血胞外囊泡，进一步采用二代测序技术small RNA sequencing检测良、恶性患者外周血胞外囊泡miRNA表达，在两个独立的人群中发现并验证可用于肺癌早诊的高特异性外周血外囊泡miRNA生物标志物诊断模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于肺癌早期诊断的外周血胞外囊泡miRNA标志物，基于大量样本验证，明确5个适用于肺癌早期诊断的特异性诊断标志物，相对其他报道的miRNA标志物，本发明的样本是基于临床中LDCT检测出肺结节患者的血液作为研究样本，因此具备有更高的特异性；这5个miRNA作为肺癌早期诊断标志物均为首次提出，相较于其他miRNA分子标志物更可靠。本发明对于从LDCT检测出肺结节患者中进一步识别假阳性患者具有重要意义。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于肺癌早期诊断的外周血胞外囊泡miRNA标志物，所述外周血胞外囊泡miRNA生物标志物包括hsa-let-7b-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-3168。

进一步地，所述的miRNA生物标志物，还包括选自hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-503-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-98-5p的一种或多种miRNA。

优选地，所述miRNA生物标志物可以为hsa-let-7b-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-3168的组合。

优选地，所述miRNA生物标志物可以为hsa-let-7b-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-3168、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-503-5p的组合。

优选地，所述miRNA生物标志物还可以为hsa-let-7b-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-3168、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-98-5p的组合。

进一步地，所述外周血胞外囊泡miRNA标志物在诊断为肺癌患者的外周血胞外囊泡中的表达值与在对照样本中的表达值相比具有统计学上的显著差异。

进一步地，所述对照样本是良性肺结节患者，而非一般的正常人群。

一种用于肺癌早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含前述的外周血胞外囊泡miRNA标志物的检测试剂。

一种外周血胞外囊泡miRNA标志物在制备通过如下方法预测所述受试者具有早期肺癌诊断试剂中的用途，其特征在于，所述方法包括：

- 采集外周血胞外囊泡样本，检测从所述受试者获得的外周血胞外囊泡中miRNA的存在；

- 测量所述外周血液胞外囊泡样品中所述的miRNA生物标志物的表达水平；

- 使用基于先前所测量的miRNA的表达水平的风险评分模型来预测所述受试者患有早期肺癌的可能性。

进一步地，所述miRNA的表达水平是基于small RNA sequencing检测技术的结果通过量化后得到的。

进一步地，所述风险评分模型包括一种数学模型，该数学模型公式如下:

其中，Risk-Score是肺结节良恶性风险预测值，Gi代表第i位miRNA的表达值，βi代表第i位miRNA的风险评分参数取值，i = 1，2 … n，n为预测肺结节良恶性生物标志物的总数，α代表模型校正参数。

附图说明

图1.胞外囊泡电镜结果。

图2.胞外囊泡特征性蛋白表达。

图3.训练队列ROC曲线。

图4.验证队列ROC曲线。

图5. 以3个miRNA为生物标志物构建风险评分模型，在训练队列中ROC曲线分析。

图6. 以8个miRNA为标志物构建风险评分模型，在训练队列中ROC曲线分析。

图7. 以10个miRNA为标志物构建风险评分模型，在训练队列中ROC曲线分析。

具体实施方式

本发明涉及到的所有miRNA都是公开在miRBase数据库中(http://www.mirbase.org/)被注释过的成熟的miRNA。

外周血胞外囊泡miRNA标志物的筛选过程

（1）研究队列及临床信息

本研究共纳入两个研究队列共计109例LDCT检测为肺结节的患者，于术前采集患者的血浆样本。每个入组的患者于术后根据病理检查结果给出准确的诊断。训练队列共纳入47例患者，入组时间为2018年9月至2018年10月，包括17例良性肺结节患者和30例恶性肺结节患者(表1)。验证队列入组62例患者，入组时间为2019年4月至2019年5月，包括24例良性肺结节患者和38例恶性肺结节患者(表1)。良性样本的种类有肉芽肿、炎性结节、错构瘤等。表1展示了患者的临床信息，包括性别、年龄、吸烟史及病理诊断结果等相关临床信息。分析结果表明两组患者间的性别、年龄、吸烟史及良、恶性患者比例并无显著差异。

表1. 109例患者临床信息

（2）外周血胞外囊泡的提取和特征

①外周血的收集和胞外囊泡的提取

外周血样本在手术或药物治疗前采集到抗凝血的真空采血管中(REF367863, BD,USA)，采集后一小时内4°C运送。收到血样后1600g，4°C离心10min，离心后判断血样溶血等级，小于4级的样本用于后续研究，转移上清液到1.5ml离心管中再次离心16000g，4°C离心15min ，分装上清液每管1ml保存在负80度冰箱。取出血浆样本置于37℃金属浴孵育至完全融化，12000g，4°C离心10min，转移500µl上清液到0.45µm tube filter (Costar,CLS8163-100EA, Corning, USA) ， 12000g，4°C离心5min，转移过滤液到0.22µm tubefilter (Costar, CLS8161-100EA, USA) 12000g，4°C离心5min。转移过滤液到1.5ml离心管中并加入1/4体积的胞外囊泡沉淀剂 (货号：REX015S, 3DMed, Shanghai, China)，混匀后4°C孵育30min，4700g，4°C离心30min，弃上清液加入200µl PBS(phosphate buffersaline)悬浮胞外囊泡沉淀。

②外周血胞外囊泡的特征

为了检测外周血胞外囊泡的特征，本专利采用扫描电镜检测胞外囊泡形态，进一步利用免疫杂交实验检测胞外囊泡特征蛋白的表达水平。胞外囊泡形态特征鉴定：沉淀后用PBS重悬，之后用5%戊二醛固定，PBS清洗5min，再用1%锇酸固定，之后用40%、60%、80%、96-98%不同浓度梯度的乙醇脱水，在样本表面镀一层硅金属膜室温干燥24小时之后做扫描电镜(SU8020, Hitachi High-Technologies, Japan)的分析。检测结果可见到胞外囊泡典型的“马蹄状”形态（见图1）。

胞外囊泡特征蛋白检测：胞外囊泡用胞外囊泡沉淀剂 (货号：REX015S, 3DMed,Shanghai, China)沉淀，然后用RIPA裂解液 (P0013B, Beyotime, Shanghai, China)冰上裂解30min。用4%—20% SDS-PAGE gel (#4561095, Bio-Rad, USA) 恒压电泳1h左右，PVDF膜 (Millipore)恒流电转45min，5%脱脂奶粉过夜封闭。一抗信息：TSG101 (1:1000diluted, ab125011, Abcam, England)、CD63(1:1000 diluted, ab216130, Abcam,England)、CD9(1:1000 diluted, ab92726, Abcam, England)、Alix (1:1000 diluted,2171, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)和Syntenin (1:1000 diluted,ab19903, Abcam, England) 抗体室温孵育2h，TBST洗四次每次10min，兔源二抗 (A0208,碧云天)或鼠源二抗 (A0216, 碧云天)室温孵育1h，TBST洗四次每次10min ，用化学发光系统显影 (Tanon-5200Multi, Shanghai, China)。检测结果表明本专利提取的代表性样本中胞外囊泡特征性蛋白TSG101、CD63、CD9、Alix和Syntenin均有表达（见图2）。

（3）胞外囊泡miRNA抽提和表达量

①外周血胞外囊泡miRNA抽提

外周血胞外囊泡miRNA的分离选用miRNeasy Serum/Plasma Kit (217184, QIAGEN,Shanghai, China )，具体的操作流程依照产品说明书。用安捷伦2100分析仪配套相应的芯片 (5067-1548, Agilent, USA )进行miRNA定量和片段分布检测。

②外周血胞外囊泡的表达检测

本专利采用small RNA sequencing检测外周血胞外囊泡miRNA的表达水平。文库的构建选用NEBNext, Multiplex SmallRNA Library Prep Set for Illumina (E7300L, NEB,USA)试剂盒，具体的操作流程依照产品说明书。每个血浆样本miRNA上样量为100ng总体积不超过6µl，连接3’接头、杂交反转录引物、连接5’接头、反转录、加入Illumina indexprimers标记PCR扩增18个循环。选用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (740609. 50,QIAGEN, Shanghai, China) 试剂盒纯化PCR产物，用30µl 无酶的水洗脱DNA。用 LabChip® GX Touch™ HT核酸分析仪及配套的芯片 (CLS138948,PerkinElmer, USA)和试剂(CLS760672, PerkinElmer, USA)对DNA定量和片段分布的检测。一般20-25个文库等摩尔比混合包lane测序，选用Illumina HiSeq PE150 analyzer测序。

（4）测序数据分析流程

基于small RNA sequencing检测技术，获得患者外周血胞外囊泡中miRNA的表达量。测序数据的分析流程如下:

①测序数据比对。去除small RNA sequencing数据测序接头后，使用BWA软件 (版本：0.7.12-r1039)将测序数据比对到人类参考基因组hg19 (基因组下载链接：http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/)，并统计比对到miRNA上的reads数量。

②miRNA注释。利用Gencodev25和miRBasev21数据库对miRNA进行注释，保留注释为已知的成熟miRNA，用于后续分析。

③miRNA过滤。对于训练队列，保留长度小于等于30nt且在训练队列数据中的每个样本至少覆盖2条reads的成熟miRNA，用于后续分析；对于验证队列，保留由训练队列筛选所得的miRNA且在验证队列数据中的每个样本至少覆盖2条reads的成熟miRNA，用于后续分析。

④miRNA表达量标准化。使用R语言中limma分析包中的M值加权截尾均值方法(TMM，trimmed mean of M-values)及limma-voom方法分别对训练队列样本和验证队列样本进行miRNA表达量标准化处理。

（5）生物标志物的发掘

基于训练队列中miRNAs的表达量，根据病理检测结果对样本进行分组，使用统计学方法发掘可用于区分良、恶性肺结节的miRNA作为生物标志物。过程如下:

①训练队列分组。依据肺结节病理检测结果，将训练队列中患者分为两组，良性肺结节组和恶性肺结节组。

②候选生物标志物。使用R语言limma分析包中拟合线性模型 (limma-voom)方法分析表达量在良恶性两组中存在差异的miRNA，表达量大于50每百万映射读取的reads(CPM，Counts Per Million)、两组间变化量在1.5倍以上且检验结果P≤0.01的miRNA，作为候选生物标志物，包括hsa-let-7b-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-3168和has-miR-144-3p，共计6个，用于后续分析。

③生物标志物。在训练队列中，使用最小绝对收缩和选择算子(LASSO，The LeastAbsolute Shrinkage and Selectionator operator)模型计算6个候选生物标志物对预测肺结节良恶性的贡献度，贡献度为0的候选生物标志物has-miR-144-3p被去除。最终选定5个miRNA作为生物标志物，包括hsa-let-7b-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-101-3p和hsa-miR-3168，用于后续构建肺结节良恶性风险评分模型。

实施例1：以5个miRNA为生物标志物的风险评分模型的建立及验证

（1）肺结节良、恶性风险评分模型

利用训练队列miRNA表达量数据，以5个生物标志物为变量，结合病理检测结果，构建肺结节良恶性风险评分模型。模型由参数、模型公式和参比值三部分组成。过程如下:

①模型参数。在训练队列中，以5个生物标志物为变量，使用100次重复10折交叉验证法，获得模型校参数及生物标志物的模型系数(表2)。

表2. 以5个miRNA为生物标志物所构建风险评分模型的参数

②风险评分模型。风险评分模型公式如下:

其中，Risk-Score是肺结节良恶性风险预测值，Gi代表第i位miRNA的表达值，βi代表第i位miRNA的风险评分模型参数，i = 1，2 … n，n为预测肺结节良恶性生物标志物的总数，α代表模型校正值。使用风险评分模型和每个样本生物标志物的表达量，可以获得每个样本的风险值。

③参比值。当风险值小于或等于参比值时，该样本被预测为良性肺结节；否则预测为恶性肺结节。根据训练队列中每个病人的风险值及病理检测结果，绘制训练队列的接受者操作特性曲线 (ROC曲线，receiver operating characteristic curve)。在临床应用中，高特异性风险评估模型可以用于辅助降低LDCT检测的假阳性率，降低临床医生手术空开率，提高早期肺癌诊断的特异性。因此，本模型注重模型的高特异性。参比值是根据ROC曲线中特异性取值大于0.9及敏感性取值大于0.5为条件计算取值。本例中，参比值取值为0.79。

④模型效能评估。以参比值0.79为准，将训练队列样本分为低风险组(即被预测为良性结节)和高风险组(即被预测为恶性结节)。以病理检测结果为真值，评估模型预测效能。模型预测效能评估方法，包括ROC曲线下方面积 (AUC，Area Under Curve，取值范围0~1)、阳性预测值 (PPV，Positive Predictive Value，取值范围0~1)、特异性(取值范围0~1)和敏感性(取值范围0~1)，值越高效果越优。分别为0.920 (图3)，93.8%、94.1%和50.0% (表3)。结果表明：在训练队列中，此风险预测模型具有较高AUC、PPV和特异性，模型对良性肺结节的预测效能较优。

（2）风险评分模型预测效能的验证

在验证队列中，根据训练队列中确定的风险评分模型及参比值，对模型预测肺结节良恶性的效能进行验证。过程如下：

①风险值。在验证队列中，计算每个样本的风险值。

②模型效能验证。以参比值0.79为准，将验证队列患者分为低风险组和高风险组(同训练队列)。以病理检测结果为真值，绘制ROC曲线(图4)，评估模型预测效能，包括AUC、PPV、特异性和敏感性，分别为0.763、91.3%、91.7%和55.3% (表3)。结果表明：在验证队列中，此风险预测模型同样具有较高AUC、PPV和特异性，即模型预测效能在验证队列中被验证。

表3.五个分子标记模型效能评估

实施例2：风险评分模型研究的拓展-以3个miRNA为生物标志物

风险评分模型拓展研究发现，当生物标志物以5个miRNA (hsa-let-7b-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-3168)为核心，减少或增加若干miRNA数量，也能获得较高的预测效能。

以3个miRNA为标志物，hsa-let-7b-3p、hsa-miR-101-3p和hsa-miR-3168为生物标志物，方法同上，构建风险评分模型 (表4)，以0.77为参比值，同样可以获得较高的AUC（0.914）和特异性（94.1%）(图5)。

表4.以3个miRNA为标志物所构建风险评分模型的参数

实施例3风险评分模型研究的拓展-以8个miRNA为标志物

在5个核心生物标志物的基础上新增加hsa-let-7d-3p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-503-5p为8变量生物标志物，构建风险评分模型 (表5)，以0.79为参比值，同样可以获得较高的AUC（0.920）和特异性（94.1%） (图6)。

表5.以8个miRNA为标志物所构建风险评分模型的参数

实施例4风险评分模型研究的拓展-以10个miRNA为标志物

在5个核心生物标志物的基础上新增加hsa-miR-16-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-532-5p和hsa-miR-98-5p为10变量生物标志物，构建风险评分模型 (表6)，以0.68为参比值，同样可以获得较高的AUC（0.961）和特异性（94.1%） (图7)。

表6.以10个miRNA为标志物所构建风险评分模型的参数

本发明可以使用较少的miRNA位点组合建立模型进行风险评价，也可以使用较多的miRNA位点组合来进行风险评价；当使用的miRNA位点增多时，可以从更多的维度来检测并区分良性、恶性肺结节，从而获得更优的检测结果。基于本发明的miRNA位点或位点组合，本领域技术人员可建立其他的风险评价模型并选择相应的参数，并不限于本发明实施例使用的风险评分模型及参数选择。