用于DMD的植入前胚胎遗传学诊断和产前诊断的试剂盒

摘要

本发明公开了用于DMD的植入前胚胎遗传学诊断和产前诊断的试剂盒，所述试剂盒包含DMD基因连锁SNP位点捕获探针组，所述DMD基因连锁SNP位点是指DMD基因上下游各2M以内的在人群中的变异频率高的199个以上的SNPs位点。本发明试剂盒中的探针组可同时对DMD基因以及DMD基因连锁SNP进行快速准确的捕获，能够提高对DMD的胚胎植入前遗传学诊断的检测特异性和准确性。

说明书

技术领域

本发明属于基因检测与分子遗传学领域，具体涉及一种用于DMD的植入前胚胎遗传学诊断和产前诊断的试剂盒。

背景技术

假肥大型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)，或称杜氏进行性肌营养不良症是最常见的一种致死性X连锁隐性神经肌肉遗传病。DMD的发病率为活产男婴的1/3500，约有65％左右与遗传有关。其临床表现主要为四肢近端进行性骨骼肌萎缩无力、活动能力逐渐丧失，90%患儿的肌肉呈现假性肥大，以腓肠肌最明显；大多数患儿伴有心肌损害，部分患者还伴有智力障碍。患者从3～5岁起病，12岁左右失去行走能力，20岁-30岁多因呼吸道感染，心力衰竭而死亡；贝氏肌肉营养不良(Becker Muscular Dystrophy，BMD)是DMD的良性亚型，发病率为1/30000，临床表现与DMD类似但病情较轻，发病年龄较晚，进展速度慢，智力正常，存活期常可达50岁以上。DMD/BMD患者在出生时多无明显异常且目前尚缺乏有效的治疗手段，所以对先证者和携带者进行遗传学诊断，在此基础上进行胚胎移植前遗传诊断（PGD）或者产前诊断，杜绝患儿出生是避免和减少后代中假肥大型肌营养不良症的发生，减轻由此带来的家庭和社会负担的关键措施。

DMD/BMD由位于X染色体Xp21.2区域DMD基因突变所致，DMD基因编码的抗肌萎缩蛋白 (Dystrophin蛋白)可以保护和稳定肌纤维。DMD基因是目前已知的最大的人类基因，含有79个外显子。其突变发生率高而且突变类型多样，各式突变据统计可达到4000种以上。其中以外显子缺失突变约占DMD所有突变60～70％，外显子重复扩增突变约占5～10％，另外25％～35％则涉及DMD基因的微小突变。

对于DMD不同的突变类型的检测常采用包括了qPCR法联合Sanger测序，多重连接探针扩增（MLPA），多重PCR或者微阵列比较基因组杂交技术(a-CGH)等技术进行检测。但是qPCR法只能验证已知的缺失突变，不能对未知区域的缺失进行检测；MLPA技术通量较低，对于单个外显子缺失仍需利用PCR的方法作进一步的验证实验；a-CGH的检测精度也相对有限，不能确定外显子缺失重复的精确位点与片段大小；利用DMD基因探针捕获技术联合低深度NGS在提高通量的同时能准确检测DMD多种突变类型以及确定突变位置。但是由于在少量细胞基因组检测中等位基因脱扣现象（ADO）的存在，在进行植入前胚胎遗传学诊断时单一检测DMD基因本身的突变仍易导致误诊。在临床上除了对目的基因进行检测外，往往还需额外检测目的基因周围的SNP或者STR遗传标记，并结合家系遗传连锁关系进行连锁分析以提高对待植入胚胎突变携带诊断的准确性。另外，染色体倍性变异（Copy Number Variation,CNV）评估是进行胚胎植入前遗传诊断中的重要组成部分，只有染色体倍性正常的胚胎才能够用于后续移植。

由此可见现有的检测技术在进行DMD突变检测以及DMD基因的胚胎植入前遗传学诊断仍存在一定的不足之处，本领域需要能同时准确检测基因组CNV、DMD多种突变类型以及其连锁遗传标记的方法，在使其能够同时满足基因诊断、产前诊断、植入前遗传学诊断的需要也便于临床运用推广。

没有现成的试剂盒可以在一次检测中同时满足基因诊断、产前诊断、植入前遗传学诊断的检测；且还满足低费用的要求。因此，业界存在需求：有一个试剂盒同时适用于家系验证，PGD以及羊水检测三方面。

现有技术CN110541025A（公开2019年12月06日）虽然也公开了一种DMD基因缺陷检测方法，但是，其用到的1246组引物。由于PCR过程中引物之间存在潜在的相互干扰，往往导致检测精度的降低。其次，由于该专利文献提供的是基于PCR扩增再建库的方式，扩增产物不适用于胚胎样本中CNV的检测。此外，该专利文献DMD基因周围连锁SNP的确定仅仅基于公共数据库本领域公知的筛选标准，然而未考虑少量细胞基因组扩增过程中基因组区域的扩增偏好性，将导致位于低扩增区域的SNP难以检出或者检出不足，并增加下游分析中误读的可能性。因此，如何对DMD基因及其连锁SNP位点的捕获探针组进行精选以提高检测精度以及提供一种能够适合于胚胎样本检测的试剂盒，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于DMD的植入前胚胎遗传学诊断和产前诊断的捕获探针组及试剂盒，能够同时满足基因诊断、产前诊断、植入前遗传学诊断的检测，所述探针组包含了能够特异性捕获DMD全基因的探针以及DMD上下游连锁SNP捕获探针。本发明结合DMD基因捕获测序技术，可以同时对多样本的基因组倍性、DMD基因本身以及其临近SNP位点进行检测。借由对连锁SNP捕获探针的优化，提高了胚胎样本扩增产物捕获的效率以及稳定性。其既适用于产前诊断也能够满足对植入前胚胎遗传学诊断中微量样本的检测要求，在临床上具有较强的普适性。

为了实现上述目的，本发明首先涉及用于DMD的植入前胚胎遗传学诊断和产前诊断的试剂盒，所述试剂盒包含DMD基因连锁SNP位点捕获探针组，所述DMD基因连锁SNP位点捕获探针组包含碱基序列如SEQ ID No .1-199所示的寡核苷酸探针，并且不包含其它寡核苷酸探针。

在本发明的一个优选实施方式中，所述DMD基因连锁SNP位点捕获探针组包含有199个寡核苷酸探针，所述199个寡核苷酸探针的序列如SEQ ID No .1-199所示。

在本发明的一个优选实施方式中，所述寡核苷酸探针均为单链DNA。

在本发明的一个优选实施方式中，所述寡核苷酸探针均用生物素标记。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括所述的DMD基因上下游2M以内区域的位于少量细胞基因组扩增偏好性区域的连锁SNP位点捕获探针，富集缓冲液BL、富集缓冲液HY、文库富集结合缓冲液、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB3、文库富集洗脱液、缓冲液NE、PCR反应液、产物纯化洗脱液。

本发明另一方面还涉及上述试剂盒在制备用于DMD的植入前胚胎遗传学诊断和产前诊断的试剂盒中的应用。优选地，所述试剂盒同时应用于家系验证，植入前胚胎遗传学诊断以及羊水检测。

本发明所提供的用于DMD基因的产前诊断的操作过程，包括以下几个步骤：

1) 对DMD基因以及DMD基因连锁SNP设计捕获探针组

2）基因组DNA的提取，片段化以及文库构建

3) 含目标区域的片段的捕获富集

4) 基因测序：对捕获后文库片段进行高通量测序

5) 生物信息分析。

其具体为：首先在从羊水，外周血或者肌肉等组织细胞中提取3~5ug DNA后，将其随机打断成200-300bp大小的片段后构建全基因组DNA文库；之后用我们开发的携带生物素标记的DMD基因以及含DMD连锁SNP位点的捕获探针和构建的待测样品文库进行杂交孵育，含有DMD基因以及含DMD连锁SNP位点的文库片段可以和捕获探针特异性杂交。之后通过探针上生物素与磁珠上的streptavidin的结合，进一步洗涤除去不含DMD连锁SNP位点的文库片段后利用富集洗脱液进行洗脱即可实现对目的片段的富集。利用不同序列标签对不同个体样本文库进行区分，因此可以同时对多个样本进行捕获。富集前后的文库则利用Illumina HiseqX Ten,NovaSeq6000等二代测序平台测序仪进行高通量测序，每个标本测序平均深度最低为基因组的1X倍，每一个样本两个文库总的测序数据量为3G base。对获得的下机的数据经质控后比对到参考基因组上，进行DMD基因突变，缺失，扩增分析流程以及SNPs分析。

本发明提供了对一种对携带DMD缺陷基因的家系样本的DMD基因以及DMD基因连锁SNP同时进行捕获后高通量测序，结合单倍型SNP连锁分析，进行DMD基因的胚胎植入前遗传诊断的方法，包括以下几个步骤：

(1)胚胎细胞样本的获得：通过单精子注射获得受精卵，培养至囊胚期在外滋养层细胞分离获得包含3-10个细胞的样本；

(2)全基因组扩增：在样本中加入裂解液放入PCR仪中进行裂解、失活蛋白酶，对获得的细胞裂解样本进行全基因组扩增，采用多重退火环状扩增技术(MALBAC)实现；具体而言，在细胞裂解样本中加入预扩增混合液进行第一轮线性扩增，之后再加入扩增混合液进行第二轮指数扩增，将扩增产物进行纯化；MALBAC扩增后的产物在300-2000bp之间。

其中，第一轮线性扩增的条件为：

(1)94℃ 反应3min；

(2)20℃ 反应40s；

(3)30℃ 反应40s；

(4)40℃ 反应30s；

(5)50℃ 反应30s；

(6)60℃ 反应30s；

(7)70℃ 反应4min；

(8)95℃ 反应20s；

(9)58℃ 反应10s；

(10)重复步骤(2)到步骤(9)8个循环。

第二轮指数扩增的条件为：

(1)94℃ 反应30s；

(2)94℃ 反应20s；

(3)58℃ 反应30s；

(4)72℃ 反应3min；

(5)重复步骤(2)到步骤(4)17个循环；

(6)将扩增后的产物在4℃ 保存。

（3）家系基因组样本获取：抽取入组家系成员外周血，提取其基因组DNA；提取先症儿（如果有）相关组织的基因组DNA样本；

（4）富集前文库构建：全基因组扩增产物或者家系成员基因组DNA均取2ug为起始量进行NGS文库构建，此为富集前文库；

（5）含有DMD基因以及含DMD连锁SNP位点片段的杂交富集：捕获探针与文库在杂交孵育之后，捕获探针能特异性杂交DMD基因以及含DMD连锁SNP位点的相关序列，探针上生物素可以与磁珠上的streptavidin的结合，进一步洗涤则可以除去不含DMD连锁SNP位点的文库片段，从而富集含有DMD基因以及DMD连锁SNP位点的文库片段。富集后文库一般进行再次扩增以满足后序上机要求；

(6) 采用高通量测序平台，对样本富集前后的文库进行测序，测序平台可以选用Illumina HiseqX Ten,NovaSeq6000等二代测序平台测序仪；

（7）生物信息学分析：下机后数据经质控后比对到参考基因组上，进行DMD基因突变、缺失、扩增分析流程以及SNPs分析。为了准确进行单基因致病位点，SNP连锁信息分析，每个标本测序平均深度最低为基因组的1X，即每一个样本的两个文库总测序数据量为3G base。

其中结合家系遗传信息对胚胎样本进行单倍型SNP连锁分析的具体操作如下：

(1)用软件获得目标区域的SNP，所述软件包括但不限于samtools mpileup，GATK，FreeBayes，VarScan中的至少一种；

(2)SNP过滤：单一样本中具体SNP位点的覆盖度最低为20，判定该位点纯合时杂合度为0~5%以及95%~100%，判定该位点为杂合子时杂合度为30%~70%，除去潜在错误的SNP；

(3)筛选区分型SNP，并构建父本和母本SNP-单体型：同一SNP位点，在父本和母本的4个等位基因碱基中，有1个碱基不同于其他3个即可区分；

(4)分析SNP-单体型：胚胎SNP-单体型有2个，分别遗传自父本和母本各1条，根据区分型SNP和孟德尔遗传原理，判断其SNP-单体型具体哪个是父源遗传，哪个是母源遗传；区分型SNP最低为10个，若有3个以上SNP错误，此胚胎SNP-单体型数据视为数据量不足，难以进行分析；

(5)结果分析：根据步骤(4)确定父本和母本SNP-单体型，区分出与致病位点连锁的单体型，将胚胎所在SNP的具体等位基因对比，根据孟德尔遗传原理，判断胚胎是否携带致病基因位点。

本发明具有以下有益效果：

本发明灵敏度高，并由于该方法是以DNA文库的方式进行捕获测序，因此，样品DNA的部分降解对最后的结果几乎不会产生影响。而过量的探针，保证了对目标片段的完全捕获，使得某些丰度较低的变异DNA也能被捕获并检测出来，其灵敏度相对于传统的Sanger测序要高出许多。这为全面检测准确的进行DMD基因的产前诊断或者是胚胎植入前遗传诊断提供了更好的平台。

本发明中的探针组可同时对DMD基因以及DMD基因连锁SNP进行快速准确的捕获，能够提高对DMD的胚胎植入前遗传学诊断的检测特异性和准确性。

本发明利用少量细胞基因组扩增偏好性特点对DMD基因连锁SNP捕获探针的选择进行了优化，提高了连锁SNP捕获探针对胚胎样本扩增产物捕获的效率以及稳定性。

本发明通过在文库构建时候对不同样本引入不同的barcode进行区分，实现了在一个捕获周期对多样本同时进行DMD基因变异以及SNP位点连锁分析。本发明所需测序深度低，检测通量高，对于DMD基因的不同突变也无需额外进行专门引物或者探针设计，操作简单，在满足PGD中微量样本的检测要求外也适用于产前诊断，在临床上具有较强的普适性。

附图说明

下面结合附图附表和具体实施案例对本发明作进一步阐述。

图1为本发明所涉及实施例3中家系1的遗传图谱。

图2 为本发明所涉及实施例3中家系1的DMD 外显子缺失区域 PCR产物电泳图。

图3为本发明所涉及实施例3中各个胚胎样本的基因组CNV图。

图4 为本发明实施例3中目的基因全基因捕获测序对DMD基因突变的分析结果。

图5（A）至（C）为本发明实施例3中各胚胎 DMD 基因外显子缺失区域PCR产物电泳图。

图6为本发明所涉及实施例4中家系2的遗传图谱。

图7为本发明所涉及实施例4中家系2的DMD 外显子缺失区域 PCR产物电泳图。

图8 为本发明所涉及实施例4中各个胚胎样本的基因组CNV图。

图9为本发明实施例4中家系2以及羊水样本的DMD 外显子缺失区域 PCR产物电泳图。

图10为本发明实施例4中各胚胎 DMD 基因外显子缺失区域PCR产物电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定，本发明中所用的方法及其相关的试剂，可以有其他可选择和替代方案，能够达到相同技术结果即可。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照所属领域的常规操作进行，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1：本发明探针组的设计和制备

1. DMD基因连锁SNP位点的筛选

以已经测序完成的健康胚胎细胞以及遗传异常胚胎的MALBAC扩增产物的低深度测序数据为基础，按照下列步骤筛选出了199个DMD基因上下游2M区域内少量细胞基因组扩增偏好性区域内的连锁SNP位点。具体筛选过程以及标准为：

1） 对于每个已有的测序样本，将覆盖位点的reads覆盖度根据样本测序深度进行均一化处理后，选择覆盖度超过理想阈值（即覆盖次数至少在3次以上）的位点；

2） 选取在所有样本（本例共选取24个胚胎的MALBAC扩增后前测序数据）中出现次数超过80%的位点，对临近位点进行合并，由此得到的区域确定为少量细胞基因组扩增偏好性区域；

3）选取1000 genome 项目提供的SNV信息记录文件（dbSNP144）（参考文献：1. Auton,A., Abecasis, G., Altshuler, D. et al. A global reference for human geneticvariation. Nature 526, 68–74 (2015). https://doi.org/10.1038/nature15393 orDatabase of Single Nucleotide Polymorphisms (dbSNP). Bethesda (MD): NationalCenter for Biotechnology Information, National Library of Medicine. (dbSNPBuild ID: {build 144}).Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/），确定位于少量细胞基因组扩增偏好性区域中的SNPs作为扩增偏好性区域SNPs；

4）选取1000 genome 项目提供的SNV信息记录文件，确定位于基因组repeat区域以及repeat区域上下游各100bp区域的SNPs，将这些位点从扩增偏好性区域SNPs中过滤去除后的SNPs确定为潜在的探针SNPs位点；

5）选取位于DMD基因上下游各2M以内的在人群中的变异频率最高的199个潜在的探针SNPs位点确定为DMD基因连锁SNP位点。

6）根据上述选定的位于DMD基因上下游2M以内的少量细胞基因组扩增偏好性区域SNP位点，本领域技术人员可以通过公知、通用的方法设计并合成探针序列，探针序列长度为120bp。本实施例中对合成的探针序列进行生物素标记，具体操作为(也可参考专利WO2013/003585中的方法)：采用原位合成技术大量合成设计的探针(MyGenostics.US)，并利用PCR的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，成为DMD基因连锁SNP捕获探针组。

所述PCR方法具体为：

将上述合成的探针均匀混合在总体积1.2ml的dH₂O中，取其中15μl利用通用的PCR引物(5’端序列为GACTACATGGGACAT、3’端的序列为GGAACCTACGACGTA，分三管进行PCR扩增，其中引物GACTACATGGGACAT为带有生物素标记的引物。

PCR扩增体系：底物DNA，5μl；正向引物(25μM)，2μl；反向引物(25μM)，2μl；MgCl2(50mM)，4μl；10x Platinum Taq缓冲液(购自Life Technologies)，5μl；dNTPs(每种10mM)，4μl；Platinum Taq(5U/μl,购自Life Technologies)，1μl；H2O，27μl；总体积50μl。

扩增条件：98℃，30s；(98℃，30s，60℃，25s，72℃，45s)35个循环；72℃，5min。

将PCR产物用MinElute PCR纯化试剂盒(购自Life Technologies)纯化后，取500ng，用MyOne亲和素磁珠(购自Invitrogen)将PCR产物结合下来。然后加入碱性NaOH将没有生物素的互补链变性、洗脱下来；然后将整个磁珠用100℃的甲酰胺液体洗涤，使探针从磁珠上分离下来。用乙醇沉淀后即得到生物素标记的本实施例的探针组，所述探针组的碱基序列如SEQ ID No.1-199所示。

二．实施例2：本发明试剂盒组成、制备及使用

本实施例所述的用于DMD基因的胚胎植入前遗传诊断以及产前诊断的检测试剂盒，是通过同时检测DMD基因的突变以及其连锁SNP位点来进行分子遗传学检测的试剂盒。

所述试剂盒包含的成分为：实施例1所获得的探针组、DMD全基因捕获探针组（参考CN 106834507 A），缓冲液HY、缓冲液BL、文库富集结合缓冲液、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB3、缓冲液NE、PCR反应液、产物纯化洗脱液。具体组成如表1所示。表1

所述试剂盒的使用方法为：

样本文库制备：

a)超声片段化：起始量（细胞基因组DNA经过MALBAC扩增后产物）为3μg，用1× low TEBuffer稀释到30ng/μL。采用Covaris S2超声仪进行超声片段化，按标准设定Covaris系统的值，6次循环× 60s，水浴温度:5℃，占空比:20％，强度:5，模式:Frequency sweeping。

b) 末端补平：分别取100μL片段化的DNA、8μL dNTPs、2μL End Polishing酶Ⅰ(10U/μL，Agilent)、16μL End Polishing酶Ⅱ (5U/μL，Agilent)，加水到总体积200μL。25℃孵育30min。用PureLink PCR纯化试剂盒(Invitrogen)纯化DNA。

c) 连接P1和P2接头：Illumina接头1(P1eA)50μmol/L和接头2(P2eA)50μmol/L各26μL(Illumina)，末端补平的DNA 48μL，T4 DNA连接酶10μL(50U)，加水到总体积200μL，室温孵育15min。

d) DNA片段回收：采用预制的2％SizeSelect Gel(Applied Biosystems)，放到E-Gel iBase上。连接纯化后的DNA片段分3份各20μL加入上样孔，分子量对照用0.2μg的50bpladder，无样品孔及回收孔分别用20μL、25μL水填满，电泳约12min，吸出进入样品回收孔的150～200bp之间的DNA片段。

e)缺口平移：回收的纯化片段需要采用切口平移法进行文库模板量的平衡的线性扩增。每100μL回收样品加400μL的master mix(Agilent)，按程序进行反应：72℃20min，95℃5min；然后95℃15s，54℃15s，70℃1min进行10到12个循环；70℃再延伸5min；4℃保存。纯化产物并定量，取1μL样本产物进行Flash Gel(2.2％，Lonza公司)电泳，约10min。

2. 样本富集杂交：

(1)杂交液制备：1μg 已经建好的DNA基因文库、13ul缓冲液BL，5μl GenCapTM制备好的探针混匀并放置在95℃7分钟，65℃2分钟，再加入23μl预热的杂交缓冲液HY(65℃预热，使用前充分震荡重悬沉淀)。于PCR仪上面65℃杂交22小时。

缓冲液HY的体积根据所制备文库体积调整而调整，调整比例为HY缓冲液体积＝总体积/1.8

(2)纯化：此步骤所用的缓冲液除了洗涤缓冲液WB3外，均室温放置。

1)取1.5ml离心管，加入50ul MyOne磁珠，剧烈震荡至少5秒，短暂离心收集管壁的液体，将离心管放置在磁力架(例如：DynaMag)上1分钟；

2)保持离心管在磁力架上不动，弃清液；

3)取下离心管，加入50ul 1X Binding缓冲液，剧烈震荡至少5秒，短暂离心收集管壁的液体，将离心管放置在磁力架上1分钟，保持离心管在磁力架上不动，弃清液；重复三次(共三次洗涤)；

4)用50ul 1X Binding缓冲液重悬沉淀，剧烈震荡至少5秒，轻旋收集管壁的液体；

5)向杂交液中加入等体积Binding缓冲液，并转移进第4）步所得的液体中。(最后总体积约200ul)；

6)剧烈震荡混合液至少5秒钟，室温放置于旋转混匀仪上一小时；

7)剧烈震荡混合液至少5秒钟，短暂离心，并放置于磁力架上1分钟；

8)保持离心管于磁力架上，弃清液；

9)加入0.5ml洗涤缓冲液WB1，剧烈震荡混匀至少5秒，室温放置在旋转混匀仪上15分钟；

10)取下离心管，剧烈震荡至少5秒，短暂离心，放置于磁力架上一分钟；

11)保持离心管在磁力架上，弃清液；

12)加入0.5ml洗涤缓冲液WB3，剧烈震荡至少5秒；

13)将离心管至于恒温混匀仪(65℃，850rpm)15分钟；

14)重复步骤10-13四次(共5次洗涤缓冲液WB3洗涤)；

15)剧烈震荡5秒，短暂离心，放置于磁力架上一分钟；

16)保持离心管至于磁力架上，彻底弃清液；

18)加入50μl Elute缓冲液重悬沉淀，剧烈震荡至少5秒，置于旋转混匀仪上至少10分钟；

19)取下离心管，震荡混匀5秒，短暂离心，置离心管于磁力架上1分钟；

20)将清液转移至加有70ul NE缓冲液的1.5ml离心管中；

21)用QIAquick MinElute试剂盒纯化所得溶液，最后得体积20μl模板DNA。

3、样本富集

(1)PCR反应体系：引物A为Illumina forward primer PCR PE 1.0，引物B为lluminareverse primer PCR PE 2.0，酶为Hotstart Phusion enzyme(New England Biolabs)；

(2)PCR循环条件：98℃预变性30秒；15个循环：98℃25秒,65℃30秒72℃30秒；72℃ 5分钟；4℃～1h；

(3)PCR产物经由NucleoSpin纯化试剂盒纯化，最终产物由65℃预热的Elute缓冲液17.5μl分两次洗脱，最终得35ul富集DNA；

(4)产物经毛细管电泳及Qubit测浓度后做定量PCR。

4、以上得到的DNA通过Illumina HiSeq X Ten等二代高通量测序平台进行测序，得到测序的数据。

实施例3：本发明试剂盒的使用效果验证

下面通过具体实施方式，对本发明进行更加全面的描述。本发明的示例性实施例及其说明用于解释本发明，但并不构成对本发明的不当限定。

家系1中孩子患杜氏肌营养不良（DMD, Exon31-43缺失），X-连锁隐性遗传。女方为携带者（DMD, Exon31-43杂合缺失），男方正常。具体遗传图谱见图1

图2为示例家系DMD基因外显子缺失电泳图。外显子加样顺序为：MALBAC1、MALBAC2、MALBAC3、母亲（携带者）、父亲、先症者（DMD Exon31-43缺失），结果显示先症者携带DMD基因exon31-43纯合缺失突变。

1.取人胚胎单细胞：

1.1精卵受精

对MII期的卵子显微注射单精子(ICSI)，将卵子放到(G-MOPS)操作液中，转移到显微操作仪平台上，进行显微操作。

1.2胚胎体外培养

将受精胚在G1培养液(Vitrolife)或Gm培养液中(Global)中培养72小时左右至5-8细胞期，在透明带上进行激光打孔，转移至已经平衡过的G2培养液(Vitrolife)或Gm培养液中(Global)继续培养至囊胚，借助激光将孵化的囊胚外滋养层细胞分离一小团，包含3-10个细胞。

2. MALBAC扩增以及产物纯化

利用单细胞全基因组扩增试剂盒（亿康公司出品的MALBAC®单细胞全基因组扩增试剂盒（KT110700150/YK001B））进行少量胚胎细胞的全基因组DNA扩增。

2.1裂解细胞

将胚胎细胞转移至含有5ul裂解液的PCR管中，放入PCR仪中进行裂解，50℃ 50分钟。

2.2失活蛋白酶

将PCR管放入PCR仪中失活，80℃ 10分钟。

2.3第一轮线性扩增

在5μl的细胞裂解样品中加入30μL预扩增混合液。

温度流程：94℃ 3分钟，8× (20℃ ---40秒，30℃ ---40秒，40℃ ---30秒，50℃---30秒，60℃ ---30秒，70℃ ---4分钟，95℃ ---20秒，58℃ ---10秒)。

2.4第二轮指数扩增

在35μl的预扩增混合液中加入30μl扩增混合液。

温度流程：94℃ ---30秒，17× (94℃ ---20秒，58℃ ---30秒，72℃ ---3分钟)，4℃ 保存。

2.5胚胎样本基因组DNA扩增产物的纯化

单细胞或等量DNA可通过单细胞扩增反应，从每65μL的反应体系中，获得范围在250-2000bp之间的扩增产物2-4μg，利用商业纯化试剂盒如DNA Clean & Concentrator-5（VISTECH cat.no.DC2005）进行MALBAC产物的纯化。

3.家系成员基因组DNA提取

利用商业化基因组DNA提取试剂盒如QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) （Cat No.51106）对家系成员的外周血或者先症儿的组织中的基因组DNA进行提取。

4.按照实施例2所示，利用本发明中试剂盒：DMD基因的胚胎植入前遗传诊断以及产前诊断的检测试剂盒对MALBAC扩增纯化后胚胎基因组产物以及家系成员基因组DNA进行建库，杂交捕获以及富集。

5.高通量测序

采用高通量测序平台，对样本进行测序。测序平台不受特别限制，第二代测序平台包括但不限于Illumina公司的GA、GAII、GAIIx、HiSeq1000/2000/2500/3000/4000、X Ten、XFive、NextSeq500/550、MiSeq，Applied Biosystems的SOLiD，Roche的454FLX，ThermoFisher Scientific(Life Technologies)的Ion Torrent、Ion PGM、Ion Proton I/II；第三代单分子测序平台：包括但不限于Helicos BioSciences公司的HeliScope系统，PacificBioscience的SMRT系统，Oxford Nanopore Technologies的GridION、MinION。测序类型可为单端(Single End)测序或双端(Paired End)测序。每个标本需测序平均深度为1X。

6.数据分析

6.1参考序列比对

将测序结果去掉接头及低质量数据，比对到参考基因组。参考基因组可为全基因组、任意染色体、染色体的一部分、基因。参考基因组通常选择已被公认确定的序列可为NCBI或UCSC的基因序列为参考序列(如人类Hg38)，或任意一条染色体。比对软件可用任何一种免费或商业软件，如BWA(Burrows-Wheeler Alignment tool)、SOAPaligner/soap2(ShortOligonucleotide Analysis Package)、Bowtie/Bowtie2。

6.2 基因组CNV分析

下机的数据，经质控后比对到参考序列(如人类Hg38)上，根据覆盖度将同一批次胚胎数据一同分析，确定每个胚胎的基因组CNV情况。

图3为示例家系各个胚胎样本的基因组CNV图（单点为10Mb分辨率）。结果显示胚胎1染色体组异常，47-XX(7号染色体为三倍体)；胚胎2染色体组正常，46-XY；胚胎3染色体组异常，45-XX（15号染色体缺失1条)；胚胎4染色体组正常，46-XX; 胚胎5染色体组异常,45-XX（15号染色体缺失1条); 胚胎6染色体组异常，47-XX(8号染色体为三倍体);胚胎7染色体组异常,45-XX,+8(×3,mos*),-9q(q21.11→qter,~67M,×1,mos*),-16(×1); 胚胎8染色体组正常-46,XX。

6.3 SNP-单体型连锁分析

6.3.1 SNP calling和SNP过滤

用软件获得目标区域的SNP，软件包括但不限于GATK，samtools mpileup，FreeBayes，VarScan中的至少之一。

SNP过滤：SNP位点的reads覆盖度至少为20，等位基因纯合子杂合度为0~5%与95%~100%，等位基因杂合子的杂合度为30％~70%，其余位点视为无法判断位点，以此除去潜在错误的SNP。

6.3.2筛选区分型SNP，并构建父本和母本SNP-单体型

区分型SNP，由于DMD基因缺失突变为X连锁单基因隐性遗传，同一SNP位点根据男性先症儿的基因型可以推出杂合母本基因型的SNP-单体型。如表2，SNP位点rs4829199，先症儿基因型为AA，母本等位基因型为GA。说明母本中此位点碱基A与致病位点连锁在同一单体型中；母本此位点碱基G与正常等位基因连锁在同一单体型中。这个SNP位点即为区分型SNP，其他位点以此类推，详见表2。

表2 DMD基因上下游2M以内区分型SNP基因型

根据199个SNP位点在胚胎中的杂合位点数目对胚胎性别做出判断

1.表2中 “-”表示无法得到相应SNP数据(无数据覆盖或深度较低)；

2.本例中199个SNP位点中共19个区分型SNP；其中位点数目：胚胎1：19个；胚胎：18个；胚胎3:19个；胚胎4:19个，胚胎5:18个；胚胎6:15个；胚胎7:7个；胚胎8:18个

3.加粗标识的SNP位点位于SMN1基因上下游1M以内

4.“*”标识为可能存在等位基因脱扣现象（ADO）的位点；“**”标识为存在等位基因脱扣现象（ADO）的位点

5.浅灰色表示未携带突变基因，灰色表示携带单个突变基因，深灰色表示患病胚胎

6.表2中“突变”一栏表示致病突变的携带情况。

6.3.3分析胚胎SNP-单体型

胚胎SNP-单体型有2个，分别遗传自父本和母本各1条，根据区分型SNP和孟德尔遗传原理，判断其SNP-单体型具体哪个是父源遗传，哪个是母源遗传。胚胎SNP-单体型分析中，区分型SNP最低为6个，若有3个以上SNP错误，则不对此胚胎SNP-单体型的分析进行判读。

6.3.4结果分析

根据6.3.2确定父本的SNP-单体型，区分出与致病位点连锁的单体型，将胚胎所在SNP的具体等位基因进行对比。根据孟德尔遗传原理，判断胚胎是否携带致病基因位点。例如，SNP位点rs4829199，胚胎2,3,4,5,6的等位基因中均有碱基A，说明这5个胚胎携带母源的致病基因突变；胚胎1，7，8的等位基因中含有碱基G，说明这个胚胎不携带母源的致病基因突变。

6.4 DMD基因突变分析

下机的数据，经质控后比对到参考序列(如人类Hg38)上，分析DMD基因区域的突变携带信息，图4显示了父母，先症儿，移植胚胎(E8)，羊水中DMD基因上的突变情况，表明本试剂盒能够准确检测家系，羊水以及移植胚胎中的DMD基因的突变。

7.方法可行性验证

7.1 基于多重PCR的SNP位点连锁分析结果再验证

对目的基因连锁SNP位点设计特异性引物，利用多重PCR进行SNP位点连锁分析，用于验证本发明中高通量测序SNP-单体型分析方法的准确性，具体见表3。从表3中可以得知，除了胚胎7检测异常难以下结论外，其余7个胚胎的SNP位点连锁分析结果与表2中SNP-单体型分析结果一致。

表3

7.2 胚胎 DMD 基因外显子缺失电泳图验证

对目的基因外显子区域设计特异性引物，进行普通PCR扩增和凝胶电泳，与高通量测序结果进行比较，用于验证本专利中目的基因突变区域检测方法的可行性，具体结果见图5（A）至图5（C）：每一外显子加样顺序为：图5（A）：MALBAC 正常对照、MALBAC-1、胚胎1、胚胎2、胚胎3、X(扩增阴性对照)、Y(扩增阳性对照)、空白对照；图5（B）：正常 gDNA、胚胎4、胚胎4-第一极体、胚胎4-第二极体、胚胎5、胚胎5-第一极体、胚胎5-第二极体、胚胎6、胚胎6-第一极体、胚胎6-第二极体、胚胎7、胚胎7-第一极体、胚胎7-第二极体、MALBAC 扩增阴性对照、MALBAC 扩增阳性对照、空白对照；图5（C）：正常gDNA、MALBAC-1、MALBAC-1-极体、胚胎8、胚胎8-第一极体。个别未出条带的样本可能是扩增失败所致，不一定是缺失导致。从图5（A）至图5（C）中可以得知，除了胚胎2和胚胎3外，外显子缺失凝胶电泳结果中与表2中高通量测序结果一致。电泳结果显示胚胎2，胚胎3为不携带纯和缺失突变，与SNP连锁分析结果不同。

实施例4：

家系2中孩子患杜氏肌营养不良（DMD, Exon 49-52缺失），X-连锁隐性遗传。女方为携带者（DMD, Exon 49-52杂合缺失），男方正常。具体遗传图谱见图6

图7为示例家系 DMD 基因外显子缺失电泳图。外显子加样顺序为：母亲（携带者）、父亲、先症者（DMD Exon 49-52缺失）、MALBAC1~ MALBAC3（先症者口腔黏膜细胞基因组扩增样品），MALBAC 阴性对照、MALBAC阳性对照、空白对照。结果显示先症者携带DMD基因Exon 49-52纯合缺失突变。

1.取人胚胎单细胞：

1.1精卵受精

对MII期的卵子显微注射单精子(ICSI)，将卵子放到(G-MOPS)操作液中，转移到显微操作仪平台上，进行显微操作。

1.2胚胎体外培养

将受精胚在G1培养液(Vitrolife)或Gm培养液中(Global)中培养72小时左右至5-8细胞期，在透明带上进行激光打孔，转移至已经平衡过的G2培养液(Vitrolife)或Gm培养液中(Global)继续培养至囊胚，借助激光将孵化的囊胚外滋养层细胞分离一小团，包含3-10个细胞。

2. MALBAC扩增以及产物纯化

利用单细胞全基因组扩增试剂盒（亿康公司出品的MALBAC®单细胞全基因组扩增试剂盒（KT110700150/YK001B））进行少量胚胎细胞的全基因组DNA扩增。

2.1裂解细胞

将胚胎细胞转移至含有5ul裂解液的PCR管中，放入PCR仪中进行裂解，50℃ 50分钟。

2.2失活蛋白酶

将PCR管放入PCR仪中失活，80℃ 10分钟。

2.3第一轮线性扩增

在5μl的细胞裂解样品中加入30μL预扩增混合液。

温度流程：94℃ 3分钟，8× (20℃ ---40秒，30℃ ---40秒，40℃ ---30秒，50℃---30秒，60℃ ---30秒，70℃ ---4分钟，95℃ ---20秒，58℃ ---10秒)。

2.4第二轮指数扩增

在35μl的预扩增混合液中加入30μl扩增混合液。

温度流程：94℃ ---30秒，17× (94℃ ---20秒，58℃ ---30秒，72℃ ---3分钟)，4℃ 保存。

2.5胚胎样本基因组DNA扩增产物的纯化

单细胞或等量DNA可通过单细胞扩增反应，从每65μL的反应体系中，获得范围在250-2000bp之间的扩增产物2-4μg，利用商业纯化试剂盒如DNA Clean & Concentrator-5（VISTECH cat.no.DC2005）进行MALBAC产物的纯化。

5.家系成员基因组DNA提取

利用商业化基因组DNA提取试剂盒如QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) （Cat No.51106）对家系成员的外周血或者先症儿的组织中的基因组DNA进行提取。

6. 按照实施例2所示，利用本发明中试剂盒：DMD基因的胚胎植入前遗传诊断以及产前诊断的检测试剂盒对MALBAC扩增纯化后胚胎基因组产物以及家系成员基因组DNA进行建库，杂交捕获以及富集。

5.高通量测序

采用高通量测序平台，对样本进行测序。测序平台不受特别限制，第二代测序平台包括但不限于Illumina公司的GA、GAII、GAIIx、HiSeq1000/2000/2500/3000/4000、X Ten、NextSeq500/550、MiSeq，Applied Biosystems的SOLiD，Roche的454FLX，ThermoFisherScientific(Life Technologies)的Ion Torrent、Ion PGM、Ion Proton I/II；第三代单分子测序平台：包括但不限于Helicos BioSciences公司的HeliScope系统，PacificBioscience的SMRT系统，Oxford Nanopore Technologies的GridION、MinION。测序类型可为单端(Single End)测序或双端(Paired End)测序。每个标本需测序平均深度为1X。

6.数据分析

6.1参考序列比对

将测序结果去掉接头及低质量数据，比对到参考基因组。参考基因组可为全基因组、任意染色体、染色体的一部分、基因。参考基因组通常选择已被公认确定的序列可为NCBI或UCSC的基因序列为参考序列(如人类Hg38)，或任意一条染色体。比对软件可用任何一种免费或商业软件，如BWA(Burrows-Wheeler Alignment tool)、SOAPaligner/soap2(ShortOligonucleotide Analysis Package)、Bowtie/Bowtie2。

6.2 基因组CNV分析

下机的数据，经质控后比对到参考序列(如人类Hg38)上，根据覆盖度将同一批次胚胎数据一同分析，确定每个胚胎的基因组CNV情况图8为示例家系中各个胚胎样本的基因组CNV图（单点为10Mb分辨率）。结果显示胚胎4染色体组异常，其余胚胎染色体组均正常。

6.3 SNP-单体型连锁分析

6.3.1 SNP calling和SNP过滤

用软件获得目标区域的SNP，软件包括但不限于GATK，samtools mpileup，FreeBayes，VarScan中的至少之一。

SNP过滤：SNP位点的reads覆盖度至少为20，等位基因纯合子杂合度为0~5%与95%~100%，等位基因杂合子的杂合度为30％~70%，其余位点视为无法判断位点，以此除去潜在错误的SNP。

6.3.2筛选区分型SNP，并构建父本和母本SNP-单体型

区分型SNP，由于DMD基因缺失突变为X连锁单基因隐性遗传，同一SNP位点根据男性先症儿的基因型可以推出杂合母本基因型的SNP-单体型。如表4，SNP位点rs5928818，先症儿基因型为TT，母本等位基因型为CT。说明母本中此位点碱基T与存在缺失的等位基因连锁在同一单体型中；母本此位点碱基G与正常等位基因连锁在同一单体型中。这个SNP位点即为区分型SNP，其他位点以此类推，详见表4。

表4 DMD基因相关区分型SNP基因型

根据199个SNP位点在胚胎中的杂合位点数目对胚胎性别做出判断

7.表2中 “-”表示无法得到相应SNP数据(无数据覆盖或深度较低)；

8.本例中199个SNP位点中共16个区分型SNP；其中位点数目：胚胎1：13个；胚胎2：8个；胚胎3:16个；胚胎4:16个；胚胎5：9个

9.加粗标识的SNP位点位于DMD基因上下游1M以内

10. “*”标识为可能存在等位基因脱扣现象（ADO）的位点；“**”标识为存在等位基因脱扣现象（ADO）的位点

11. 浅灰色表示未携带突变基因，灰色表示携带单个突变基因

12.表2中“突变类型”一栏表示致病突变的携带情况。

6.3.3分析胚胎SNP-单体型

胚胎SNP-单体型有2个，分别遗传自父本和母本各1条，根据区分型SNP和孟德尔遗传原理，判断其SNP-单体型具体哪个是父源遗传，哪个是母源遗传。胚胎SNP-单体型分析中，区分型SNP最低为6个，若有3个以上SNP错误，则不对此胚胎SNP-单体型的分析进行判读。

6.3.4结果分析

根据6.3.2确定父本的SNP-单体型，区分出与致病位点连锁的单体型，将胚胎所在SNP的具体等位基因进行对比。根据孟德尔遗传原理，判断胚胎是否携带致病基因位点。例如，SNP位点rs17329762，胚胎4,5的等位基因中均有碱基A，指示这2个胚胎携带母源的致病基因突变；胚胎1,2,3的等位基因中均为碱基G，指示这3个胚胎不携带母源的致病基因突变，其余位点依次类推进行判断。

7.方法可行性验证

7.1基于PCR电泳的DMD基因突变分析：图9显示了女方；男方；先证者和胎儿羊水(从左往右)中DMD基因上的突变情况，进一步表明利用本试剂盒对移植胚胎是否携带纯和缺失的DMD基因的突变预测准确。

7.2 基于多重PCR的SNP位点连锁分析结果再验证

对目的基因连锁SNP位点设计特异性引物，利用多重PCR进行SNP位点连锁分析，用于验证本发明中高通量测序SNP-单体型分析方法的准确性，具体见表5。从表5中可以得知，胚胎1，2，3的SNP位点连锁分析结果与表2中SNP-单体型分析结果一致，前文指出胚胎4和5不携带纯和突变，且胚胎4前文指出可能由于扩增异常导致CNV异常不做判断，此处显示SNP检测异常，难以下结论；胚胎5前文发现可能存在重组而对胚胎是否携带突变基因不做判断，此处SNP指向胚胎携带突变。

表5

7.3 胚胎 DMD 基因外显子缺失电泳图

对目的基因外显子区域设计特异性引物，进行普通PCR扩增和凝胶电泳，与高通量测序结果进行比较，用于验证本专利中目的基因突变区域检测方法的可行性，具体结果见图10：每一外显子加样顺序为：正常gDNA，胚胎1，胚胎2，胚胎3，胚胎4，胚胎5，MALBAC 阴性对照，MALBAC阳性对照，空白对照。个别未出条带的样本可能是扩增失败所致，不一定是缺失导致。从图10中可以得知，凝胶电泳结果显示所有的5个胚胎都不携带纯合缺失，这与表4的高通量测序结果预测以及常规SNP多重PCR的预测结果相一致。

综上，利用本发明的方法及试剂盒，对两个家系样本DMD基因以及位于少量细胞基因组扩增偏好性区域连锁SNP同时进行捕获测序后分析。同时利用常规采用的SNP位点PCR捕获方法进行验证，两组分析结果相一致，显示本发明的方法具有较强的可行性和准确性。利用缺失外显子PCR后电泳进行了验证显示，实施例4中的SNP连锁分析结果与基因体本身突变区域的检测结果完全相符；而尽管实施例3中的家系的胚胎2与胚胎3的扩增结果与SNP结果不同，但是其余6个胚胎的结果均得到了准确判断。最终选择的胚胎8的羊水验证也反映出我们判读的准确性，也再次表明本试剂盒在的SNP连锁分析结果与基因体本身突变区域的检测判断能够互为补充，可以减少单一利用SNP连锁分析或者位点检测导致的判断失误，使PGD诊断更加准确。以上示例表明本发明提供的用于DMD基因与连锁SNPs检测的探针组及试剂盒能够对实际样本进行快速准确的检测，而且操作简便，具有较强的普适性。

以上具体实施方式仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神及原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院）

<120> 用于DMD的植入前胚胎遗传学诊断和产前诊断的试剂盒

<130> CP19556

<160> 199

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 1

ttttgccata cacgacattg acagagttct aagtcttagg gaaagataaa tgtttgtagt 60

cattctctcc ttgaattttg ttttttttga tgcatactta gcatcttagt gcaatactct 120

gtttaggaag caaccccctt cacattgtta aatagtgata 160

<210> 2

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 2

tctgggtccc agaaaactaa agagtcaatt tcacaacacc aatagaggga ggctcaggcc 60

ctgccaagag ctgacatgac aattctaaag gtaatcagag tggatcctct ccaagccaga 120

acacagaaag ccccactgcg agccttgttg tcacccagtc 160

<210> 3

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 3

gatctgattc acagatgatt cacattactt tatttcagtg cctttgaaat ctagtgttcc 60

ttccaaagct gatcatgagg gtgtcagtgg ggagacctag acagaggagg aacaggggag 120

gtaggacaat tttcctacta tgtttttgtg tagcatttgg 160

<210> 4

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 4

ttctggccaa tgaagaagga agacttcctt tccaactgca atccagaaag gtctggggaa 60

gaactttggc ccaaccggag ccatgtgccc acccctcaga cttagtgtga caatgggatg 120

aagagactac agttagcagt tccagaagca catggatgaa 160

<210> 5

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 5

taacttgggg actcatgatt ctacagccat aaaaacacta gtctaaatag ttataaaaca 60

tacaataatt acctacagga tttccactct cattggaata cataatctgc ctttcctcct 120

ttagaaaaat ataatttcag tagaattaac aggagaaata 160

<210> 6

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 6

gatgtggctc atcctcattt cccttttgaa ggcgaggacc cgagcgagct taaggagtgg 60

ggtgcagcgt ctggtcagcg gagggtgaat tctcaggact ggtcgggagt caaggtgagg 120

accctgagtg taaattgaag agaccacccc cacccgtaac 160

<210> 7

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 7

tgggggatcc agagcctgtt ccattaaaag cgcattcaat taggttacct catttgtgat 60

ttggcaaact ctaggcaagg tctagatttt gagaggtggt taaatgaatc aaaataaaag 120

tggtttagat ggaaggatag ctgagagaga gggaagtttt 160

<210> 8

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 8

tcttcatttc cagatctact tttttttttc ccaacaagtt ttccttacca aaaatcacaa 60

aaaagctggt tttcatcaag tcatgcactg atttgcatct attctaaatg cttattcccc 120

tgcctccccc cgtcaccacc gaaaaaggtt tagattcctt 160

<210> 9

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 9

cattcactca catcagcgct aactgacatg aataatcatt tagtatttca cagtaatata 60

taacactctc aaacttaatt ttttgataac tatatcatgt taaaatactt taaaaaagca 120

acttccattt tgttcactgg gaggctttct gtttacaaac 160

<210> 10

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 10

gggtcctaac tggagtcaag gtgagggccc tgagtgctaa tgaagcaatc tctctgcaat 60

agaggtgtca acacaaacaa tgtccttgca ctcattttgc aacctccagg caaaggtatt 120

cataggtgag gggtccctga cttccctgtc tagggtcttg 160

<210> 11

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 11

tgagagaaaa ctaaagggaa cactctctct aaaaagtaga gtcccacaaa ttgtgcctct 60

tctctcagct ccaggaagcc ttggaataac gtcagccccc cttactgcct agagagtgcc 120

agaaaggttg aactaattac atgccccagt tctgcagagg 160

<210> 12

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 12

ctttgccctg ggctggggga tccagagcct gttccattaa aagcgcattc aattaggtta 60

cctcatttgt gatttggcaa actctaggca aggtctagat tttgagaggt ggttaaatga 120

atcaaaataa aagtggttta gatggaagga tagctgagag 160

<210> 13

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 13

gactctgctc tggtcccagc acataagtct agtccagtgc tttccaacat tacagtgccc 60

ttccctgggg tcttccccag tgtgcccccc tgtccacact ggaactgacc tactggtcaa 120

cttcactgca tctttctctg gagcctgcac ctgctcccag 160

<210> 14

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 14

ctgctcggcg gtcccacggg tctgtctctt gcttcaacag tgtttggacg gaacagttcc 60

ggggactctt tcttccagct tccgaccgcc ctcctatttc ctctccactt gcaacctcca 120

ggaccatctt cttggccatc tcctgcttct gggacctgcc 160

<210> 15

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 15

ttgatgagcc tctcctttta ttgccttcct gtataagaaa atgttaacaa atcagagatc 60

tagattcaat accagactaa ggtggttgta taaatgatac ataattactg gtgaaatgcc 120

catattctta ccattaaaaa tagtggagtg gacacattta 160

<210> 16

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 16

cattcagtca aaaatccaga aataggcaga ccagaaattt taaatatatt gcattcccca 60

aatcccattc ctagctaata actcactaga aatgggattt gaggaatgct atatatttaa 120

aatttcaggt ctgcctattt gcgtttgccc atagaagtag 160

<210> 17

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 17

tcccattcct agctaataac tcactagaaa tgggatttga ggaatgctat atatttaaaa 60

tttcaggtct gcctatttgc gtttgcccat agaagtagtg ttataaaagg cagaaaaagt 120

gccaggaaca tgtctcaagt gcatttggcc cgtggtctgt 160

<210> 18

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 18

tgtcttaatg tagatggcca caacacagac tgtagcatgc tccttgccat tcctttctaa 60

catcctctag gattgtgctc cctcagtaca tcatccatca tttcaattta gtggttgaat 120

gagtagtcag ttaccacctg agccactttt ctaattagga 160

<210> 19

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 19

ctagagctta ctgaaattaa gaagctgtgt tttgcacaat aaatagtagg gactcagtac 60

aaattgtcat caccattttg aagtctgtct tctcctatgt tccttgtcta cagtatctta 120

cacactaaac cagttctcca ccatcgttgt gcgtgctatc 160

<210> 20

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 20

tctcctcaaa ctttcccact cttgagtggc taaaatctta atctctttct ctgtctctct 60

caacaagagt gaacccgatg cactgctttt ccttttaaca tcttctttgg catttaaggg 120

cacctgagtg tagtcccttg ggaaagtaga ttttcttctt 160

<210> 21

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 21

ccaaggatgg aggaaggtct gtggatgcca aatactagta tggagaaaca tctgttctat 60

aaagctttgc atccaacgtc taagcaatgt atactaccag gataaatagc tctttgtagg 120

aagaatgtga aagaaaagcc caaatagaaa gaatggactg 160

<210> 22

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 22

gggggtggga tgggtgttaa gtggaccaag gatggaggaa ggtctgtgga tgccaaatac 60

tagtatggag aaacatctgt tctataaagc tttgcatcca acgtctaagc aatgtatact 120

accaggataa atagctcttt gtaggaagaa tgtgaaagaa 160

<210> 23

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 23

agtccaatct atagcagagg aatcagcagc agtagagaga gtataaagct aggataaaat 60

aataaatgtg tctgcgaaat agatttggga gataacaaag tagaattagt gtttggggac 120

tttcaaagta catttttaac aaattaaact catttgtgca 160

<210> 24

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 24

tattgttggc tcctatatat caagtaatac tacttatggc tcctgaggga gcaacatttc 60

ttgatgaccc tgggacccaa tgcattcttg ccaatgtacc tgagctgaag gctatcttta 120

tgtctcctga acagaggcat ttcttcccct atgaacagtg 160

<210> 25

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 25

aaagaattga ctctttccaa tttactcaaa cccctagcaa gcgttctcag tacaggctga 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 26

gggcagcttt ggagtattag ctctagtttt ctctgtctaa ccactccatc gtcccttgtt 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 27

tttgtggtct cccaatttta tgcctcatgc acatgtaact ctatatacat atatagaggg 60

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<210> 28

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 28

gtttgtcagc cccttggcta tggggaagcc agcttaaggc tcccactaca actgtcaccc 60

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tcagaatcca caaacattaa cattggcata ttttaataaa 160

<210> 29

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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tcatttgaaa tatacttggt tttcttataa gaatcactgt gtatacatat aagtacattt 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 30

cgaccagcct gtttattatc ttgctttcta tttatgtaca gtcactttct tctggaacaa 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 31

gtgccctggg gagaaatagg tagtaaagac atgtttgtgg ctggcagaga atcctgggaa 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 32

ccttttctgt tgtgcaaact tttaaagcct tctttcagtc cttttcgtca tagccaaact 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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cacaaaaaca ttttgctagg aactcttcca gttttcaacg tttaagcttg attccttagt 60

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<210> 34

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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catttttctt ctcttgaata ttatattatt tatcctgttc tcagagctgt tagattgccc 60

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aggtcctgtt ttctcagtct ttgccctttt gctcaacatt 160

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<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 35

tgcttttgaa atatttatga aataatcaca gtttaactgt ttaattgcat gagctagatt 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 36

tgccttatga gtgaagaaag ttggatgatt gggtgtaaaa gatgtaaggt taatgggaaa 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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ccagttagtg agcatctttg tttgttaata tctgtacttc atacttaatg gactaatttt 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

<400> 42

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 44

catctgggct tgtattcttc tgaagcagca aattgaaaca atagtcaaaa actccagttt 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 49

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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atccctaaat atattgtatt acacaataag catttaagtt gtgttttcta tatgagggaa 60

taatcatgcg gaataataaa caaacttgtg tcttctaaac agtgttaaaa ccatgatgga 120

cgttttcttc ttggcctaaa catgattttc ccagagtctg 160

<210> 79

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 79

tttaaagaaa gtcaacgggg taatgtgttc agtttctttt ttaaataaaa agtatgcaat 60

attataatga ttagagtccc atgtagtaga aggaagagaa taaaggactg aaattataag 120

actatttgtg cccttgattt taatttctta ccttgagtcc 160

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<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 80

ctctgtcgcc caggctggaa tgcagtggag ctcaaaactg atcttgttca tcaggaaaat 60

agaatgaaca taattatggg gtatgattca aagaactagt ctttcaagag taaaagtatg 120

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<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 81

gacatatgcc atttttcatt ctaatcaaaa gtccccaagc acacagaaac cattgaccag 60

aatgtaacca tttgtacatg ccaagataaa aattataggt gtttgttagt ttcacactga 120

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<210> 82

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 82

attaaagggc tggaagtagg aggaggtgag gcagatgagg atctgggagg caggtgttgg 60

cagactaaat ctggggaggt gtataaatag ggtacaatac agtagatatg tcaacaggtg 120

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 83

cttgccctag ggctgattaa agggctggaa gtaggaggag gtgaggcaga tgaggatctg 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 84

tgaggatctg ggaggcaggt gttggcagac taaatctggg gaggtgtata aatagggtac 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 85

gatcttgttc atcaggaaaa tagaatgaac ataattatgg ggtatgattc aaagaactag 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 86

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 87

gaagtatcca ggttaggtgc ttacagaatg tgtttatgaa tttccttaat gctaatttgg 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 88

cttcagtaaa gctaagatgg ggtcttccag ctgaaggtgc tcacagatct cattctccca 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 89

tttcattcta tgtaaaggga attgagggag gaaaaagtaa ttatgtaatc ctcaagaagt 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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tgacaaaaac agtgaacggt ttttcaaggg aggtaaaagc tgccagagct gagcctgatg 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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cccaattatc ctccttgttg agacataatt taatgctact gttttgtcac atactcctcc 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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agagaggact tgagggaact cccacctcat cagtggggat ccctcagagt ccctctgtat 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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ttgcctatct tctctaacct tgtccctgag tagaatattt tcaacatctg atgctctttg 60

agatacagat agtataagag ggatgtgtaa tacgttagtt atgcatctca agccatgctt 120

tatttgctgc tgccaatttc tcagttgctt gtatttaata 160

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 94

taccatggct ggtggaggga tcagacctga aggggaggaa gggaggagag tagtaactga 60

gaggttctag tgaagtgggg ggaaggaaag acactggaaa tagaagagaa atatgatcta 120

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 95

cagactgcta gatactaagg tgaggacccc tagtggggac gtagggacca gcgacgctag 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 97

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 98

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 99

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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aacaaatata tgactataca actgtatcag aaccctccca tcagcctcat tcttctcttg 60

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 105

ttccgagctc tcgccagtac agccagcacg gaaggcgttc gtagaggaag tggaagccca 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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aaaataaatg aaaacaaata tatgactata caactgtatc agaaccctcc catcagcctc 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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cagtaaaagc tacctgatac actgtgtgag tgacctcatg tgaatgcctt tgcaattctt 60

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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aaaatcggtt gatatagggt gatcacaaat tactaatttt tacttttacc attctgtttt 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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cgccgcaagg cccgagatga gacccggggt ctcaatgttc ctcaggtcac tgaagcagag 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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tcattgtaat tacattttta cacattctga ttttctaccc tagacattcc cttcactcca 60

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<213> 人类细胞(human cells)

<400> 119

taaaatattt attgaagaat taacagaggt cttctattaa tctgacatgg taaaacagaa 60

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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aaactggggg caagcactga ctcaattatc tcaggctggg gaatttgtta ccctttttat 60

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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gaaaaaaata aaagaaattt tttggaaatt tgaacagcaa caacaaaaag aactcacatt 60

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<213> 人类细胞(human cells)

<400> 127

atatcaaatt cagcacaagg gggagagaag aagcagggga gataagtttc ttgtccaaaa 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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aattttcaac aatgacatgg tatgaaatta atttgtgctc aacacatcat gaagtaccac 60

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<213> 人类细胞(human cells)

<400> 129

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<211> 160

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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<213> 人类细胞(human cells)

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cctcccctcc ctacccccag caattgtcac tggtctagag 160

<210> 136

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 136

cctgtgaggc tctagagcac tgccctcaag aaaaaaactg ctggaggcag catttattgg 60

agccaccaac cgttgagttt accagatgag gccattcaca tcttccctct atccccaagt 120

tgggcttcac tgtcatctag cttcctgccc acattcctgc 160

<210> 137

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 137

ccccaaatga agaaggcccc tcacaactct gtcgttctcc ctgcagaaag gaggaatggc 60

cttaagtggt ttttcttgtc ttttgcttgg agagtgagag aatggtgagt accatagtct 120

aagaagtgtg accttcagtc tgcagaggca agaatttcag 160

<210> 138

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 138

catttttgtc atcagaaaat atttccaagt taagcaatct tacaaagaag tatctcagga 60

ctatcaacat tagtgagccg ggtaccctga agtgaggtac tctttcctca cttcatagtg 120

tggccaccat agccattctt gcctttcttc agtttgctgt 160

<210> 139

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 139

tttccctgcc acatctacat cttttctcag tcttacttcc tgagtcctga tggctccttc 60

ttggctttcc caggtaaaat taaggcgaag gggctctgca agaagggaag gggctttggg 120

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<210> 140

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 140

ctgaaaataa agggtatata ttacgggaag aagtacttca tctctgggga tcccaggaag 60

gtcatcacca gagatctgac gcatgaaagg tagctggact gccagcagat gccccatagt 120

gattcttccc actatgaatt cctatggggt ctgagagccc 160

<210> 141

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 141

ggattaaaga agctcagaga gttgtagaag ctcgtttgtc cttaaaatgc aggaatcatg 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 142

gattaaagaa gctcagagag ttgtagaagc tcgtttgtcc ttaaaatgca ggaatcatgg 60

cttctgatac atataggacg gtcaaggttt atttctcccc tgccttgcct tatttcattg 120

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 143

gtattacaca ataagcattt aagttgtgtt ttctatatga gggaataatc atgcggaata 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 144

tgaagcaggg gttctacttg ttagtaacca tgtttaaaag tctggttgtg gaagatgttg 60

acttaataag atttgaggaa tatctcaagt aaacctttat ttatttcaag taaagctttg 120

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<210> 145

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 145

gctcaggccc tgccaagact tcatatgata atcctaaaag ttaactgata aaaccccaaa 60

caccagaaga caggaggccg cactgccagt acctcctgtc accatagtaa gcccaaggaa 120

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<210> 146

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 146

agagtgttcc taggtctctc attttgggtc cctcattgtg gatccagtgg gcagtgtctc 60

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<210> 147

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 147

gactgtccta ggcctgatat ttacaaaagg caattgaacc aatgaggaga taatcttgga 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 148

gaagccttcc ttacaaatct aatttataag catgaagaag tctgagcact cagtgaagca 60

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<210> 149

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 149

attaaagcta tcacagagtg ctctgcacag cactgtgtca gtgggcccaa tcaatgtaca 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 150

agaagtgggc tgtctagtgt tctggactcc ctagcatcaa ttttccttct atttttttcc 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 151

ttcaccagtt ctaattctgg ctttgtcttg gtaagtgggt ttttactttc tcgtggaaac 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 152

gcaaaactgt gctgaggccc ttttagggcc ataggtcttt aaaatttaaa ggactccgtg 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 153

catcacaggg cttcaacctg ccagccacag ctttcagcct ctggagaata tgggcattgt 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 154

ctgagaaata agggtaatac cctcaaggga cgggggaggc ccagaagcca ctgtgctggt 60

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<210> 155

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 155

aatgcttcag gaaataggaa tgttttattg agctgggaga ttaaatatat gtggagccac 60

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tgaagtgtga caaagtaatc agaaccgctt gctattgcaa 160

<210> 156

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 156

ggagacatgt gaggcccgag ggcactgccc ttaggaaaag cctagtgtaa gtggcctttg 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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tgaatcctgt gatttgtcat gcattatctt tgcttttcat tttatgtgct gttctggaaa 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 158

cttctgccca catttcttgg tttacccagc catcatgcct cgtggtcaga agagtaagct 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 159

agaaattatg gatgattcta atttttcttt cagcttagct gtattttcca atttttctag 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 160

ctgaaatcaa tttgagggcc ctaaatgtgg actgaagaga acatctccta cccttaacaa 60

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<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 161

tggatataaa acctcaaaca aaacaaaaaa atacagtttc atgtgggttt ttaaagaatc 60

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<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 162

agtttcatga tcagaatggg ggatcaaagt cagaatacca ggattagttt caagtgattt 60

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<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 163

tttccaaaca gactaaactt gaaaacataa gtgttacttc tcaggcaaat aagtgaagac 60

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<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 164

ctttcaaatg gaagccaaca gcttacaaaa atggctacca tctgaaaaga tgattaatag 60

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<210> 165

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 165

ggaagagaaa ctcaaatcgt aatcttacaa tcagagtctt cctgccacat gtgaccattt 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 166

ttctaaaggt aatcagagtg gatcctctcc aagccagaac acagaaagcc ccactgcgag 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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gatggctgtt gaggtggttg tgaaggagga gtagctgcac ttctgttctg ttcgttcata 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 168

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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attatttgaa cattaaattt tatttttctg aaagagcaca tgagatagct gtctcatttg 60

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<213> 人类细胞(human cells)

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ggggaatcct gcccgcggcc tcccgagact ccggtgtccc gtctccgtcc tcagcttccc 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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accaccacta atattcttta ctttcctcct cctttcattt ttctttccgt cttgctcctc 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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agtgtggaag tttgctgtct actttatagc ctaaaatttt caagtttacc attcaagggc 60

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<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 175

gtacctcaga ttcactaatt ccctacatat acttccaaat aattgacaga tgtgaatttc 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 176

agtagctcat tggtttgacc aatgctctag ccattttggt gaaatggata gaaccacttt 60

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<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 178

caccctgtat acagaaaaca ggccctgaat ttctttgccc tgtattattt tctcctcagg 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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accctgtata cagaaaacag gccctgaatt tctttgccct gtattatttt ctcctcaggg 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 181

cacgtttttc acatttctac caatcagact aaggagcaca ttctttaggc atacgattag 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 182

ggaaggagga catctgagaa agccttaacc ccagagagat tgcagtcttg agcaggtgag 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 184

tccagtccaa ccctttattt tcagccctag aaagctcagg aaagggttat caggtttagt 60

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<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 187

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<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 188

ctggtgggag gggtgctttc tataattgaa ctatgttttc caaatctatc cctatttttt 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

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ccaggaactc agtgtggcca gtagattgaa aagacaagtc attattgaaa aaacccttat 60

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 190

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<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 191

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<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 192

cccctcctct ttaccccatt gtagatcaga acaaaagctt gaaaagtttg aggctaccat 60

tacagtttga aaaatttgtc ggaagcagac tcaccctagg atgcaatttg aaatctcttc 120

ctacattctg tggtcattta tttgtttttt cttcttttct 160

<210> 193

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 193

cctgaaatac ctgacctctg ctaaccatac aacatgttgg tgagaactgg ggagttccaa 60

aaaggataaa aaaggcagaa tagtgttctc ctgagaatag tattaaggac ccaattgcaa 120

atgatttttt gaaagccatt cccggccggg cacggtggct 160

<210> 194

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 194

caacagtatc ttctacatag tactaatggg cattgggatt tgaacctaag tcttctggtg 60

caatattcca tggagtttcc ccatcttcac actgtgcttt ccattgccct gagatcaata 120

tagagtcctt aatgcagtgc atattgttac catggctggt 160

<210> 195

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 195

ttcggcctcc caaagtgctg gtgggagggg tgctttctat aattgaacta tgttttccaa 60

atctatccct attttttcta ctgcccatca aagaatgttc tggctgcttt tgagttttta 120

agcatctgga ttcagggaga gagaaagtaa aagacactct 160

<210> 196

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 196

attatataaa ggttttggac aatagctggg gcttgaggga gtgagaaaag tcaagcaaaa 60

ggggatttgt ccctctgggg attaattcca ggacgacccc acccccgccg ccctcaccac 120

acacactcac cctccctacc ccgaggatac aaaaatccga 160

<210> 197

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 197

tacatctacc tagtgccaac gtccattgac aatgaagtaa aacctacctg tcacccattt 60

ttccctctgc atgccacccc gacctggtgg cttaatattc catttttttt cagtcacttt 120

cctataatct tctacctcca ccagactgtt ctgtaaaaag 160

<210> 198

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 198

tttggacata tacacagatg tgtgttgaaa gtgggtgata gaatctgaga cccagatctg 60

agagtcgatc cacagagggc gtaactgaag tcaatttcct caatattctc ttagtgaagg 120

tatgtaaaga ggtgtgaaaa tgaacaatta ctaagcatgc 160

<210> 199

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类细胞(human cells)

<400> 199

aagtccctaa aaggaagaag gagtaagatt ccagtactaa aattaagatc aatggaccta 60

agaacaagag tagattcaag gatcaatccg cagaactaga gggatgtggg aaacatggct 120

ggtatcttgt cttagtccat ttttgctact ataacagaat 160