一种细胞程序性死亡受体1抗体制剂及其用途

摘要

本发明提供了一种包含抗细胞程序性死亡受体1单克隆抗体的药物制剂，所述药物配制剂包括：抗PD‑1单克隆抗体、枸橼酸‑枸橼酸钠缓冲液、蛋白保护剂和、表面活性剂、等渗调节剂等成分。本品经过40℃，最长4周的加速实验，主要检测指标外观、浓度、浊度（A350）、pH值、渗透压、纯度等测试等标均无明显变化，表现出良好的稳定性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种PD-1抗体制剂及其用途。

背景技术

细胞程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)，也称CD279，是一种重要的免疫抑制分子，属于免疫球蛋白超家族CD28家族成员，分子量为50～55kD的I型跨膜糖蛋白。PD-1持续性表达在T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞以及骨髓细胞的表面。PD-1具有两个已知配体，PD-L1和PD-L2。目前，研究发现，PD-1与其配体PD-L1结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+T细胞的增生，而且PD-1还可以借由调节Bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性T细胞的聚积。而阻断PD-1与PD-L1的结合，可以有效阻止T淋巴细胞抑制信号的产生，从而打破免疫系统对自身组织的外周免疫耐受，促进T淋巴细胞的活化与增殖，以及细胞因子表达。因此研发新型的抗PD-1单克隆抗体，用于癌症的免疫治疗，使其具有更低的毒副作用，更佳的临床药效，成为目前的研究热点，也将给患者提供更多的药物选择。

蛋白质(单克隆抗体等)类药物制剂适合于非肠道给药，包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下注射等给药方式。其液体制剂使用方便，但稳定性较差，对储存条件要求较高，一般需在低温条件下保存。此外液体制剂中蛋白易形成聚体或颗粒，也会导致单抗制剂稳定性下降。通常的药物制剂中，包含的蛋白质特别是单克隆抗体类药物，很难在储藏期内，尤其非冷藏条件下保持良好的物理稳定性、化学稳定性和生物稳定性，因此需要研究针对此类药物的稳定缓冲液体系。已有报道可在蛋白（单抗）类药物中加入的稳定剂包括表面活性剂、糖和多元醇、盐类、氨基酸/氨基酸盐以及一些大分子化合物。但是抗体类药物的结构性质各异且易于聚合，目前还缺乏满足制药工业需求的稳定的蛋白制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种包含抗PD-1单克隆抗体的药物制剂。

本发明通过筛选和配方优化研究，首先确定使用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液作为抗PD-1单抗药物制剂的优选缓冲体系。具体地该药物制剂包括抗PD-1单克隆抗体、缓冲液、稳定剂和表面活性剂、以及可选地包含等渗调节剂等成分。

在经筛选的缓冲液体系基础上，设计单因素试验，考察蛋白质浓度、pH值以及稳定剂种类及含量、表面活性剂种类及含量、是否添加等渗调节剂等因素对蛋白稳定性的影响。从而优化筛选得出优选的其他制剂组分。

所述药物制剂中抗PD-1单克隆抗体的含量较佳地为5-50 mg/mL，更佳地为8-30mg/mL，优选地为10.0mg/mL，所述抗PD-1单克隆抗体可选地为具有SEQ ID NO.7所示的重链可变区和SEQ ID NO.8所示的轻链可变区，优选h1G4抗体（由SEQ ID NO.10所示的重链和SEQ ID NO.9所示的轻链构成）。

该制剂的缓冲液体系中，所述枸橼酸-枸橼酸钠的浓度较佳地为10-50mM，更佳地为15-30mM，优选地为20mM；所述药物制剂的pH值较佳地为：pH 5.0-6.5，优选地为：pH 5.5。

本发明制剂还添加蛋白保护剂提供产品的稳定性，选自本领域常规蛋白保护剂，所述蛋白保护剂能够保护蛋白质药物的稳定性，并保护蛋白质药物的功能不受条件变化的影响(例如：冷冻、冻干或其他制备条件的变化)。蛋白保护剂较佳地包括：糖类、蛋白质、氨基酸、聚合物、盐、胺、表面活性剂等，更佳地包括：蔗糖、甘露醇、或甘氨酸中的一种或多种。所述蛋白保护剂的含量较佳地为：蔗糖、甘氨酸或甘露醇的一种或数种，质量/体积百分含量（g/L）0.5-5%；较佳地为：1-3%蔗糖，或者1%甘氨酸；优选地为：3%甘露醇。

本发明制剂包括表面活性剂，选自本领域常规表面活性作用剂，较佳地为非离子型表面活性剂。本文中的表面活性剂的例子较佳地包括：聚山梨酯(例如聚山梨酯20和聚山梨酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-，肉豆蔻基-，亚油基-，或硬脂酰基-磺基甜菜碱；月桂基-，肉豆蔻基-，亚油基-，或硬脂酰基-肌氨酸；亚油基-，肉豆蔻基，或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰氨基丙基-，椰油酰氨基丙基-，亚油酰氨基丙基-，肉豆蔻酰氨基丙基-，棕榈酰氨基丙基-，或异硬脂酰氨基丙基-甜菜碱(例如月桂酰氨基丙基)；肉豆蔻酰氨基丙基-，棕榈酰氨基丙基-，或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺；甲基椰油基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；和MONAQUATTM系列(MonaIndustries，Inc.，Paterson，N.J.)；聚乙二醇，聚丙二醇，及乙二醇和丙二醇共聚物(例如Pluronics，PF68等。其中，更佳地为聚山梨酯，优选地为聚山梨酯80。所述表面活性剂的含量较佳地为0.01％-0.05％，优选地为0.02％。

本发明配制剂中可以根据需要含有或不含有等渗调节剂，其中所述等渗调节剂为本领域常规等渗调节剂，较佳地为氯化钠，含量为质量/体积百分比0.1-0.5%，其中质量/体积比为g/L。

本发明对各个组分的制剂进行了40℃，最长4周的高温加速试验，检测评价各制剂配方的稳定性数据，检测项目包括：外观、浓度、浊度（A350）、pH值、渗透压、纯度(SEC-HPLC、CEX-HPLC)等测试。结合测试结果，分析得出最优的制剂配方。

其中一个优选的实施方式为：抗PD-1单克隆抗体10 mg/ml ，20 mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，质量/体积百分比为3%的甘露醇，体积百分比为0.02%的聚山梨酯80，质量/体积百分比为0.3%的氯化钠，pH 5.5，其中质量/体积比为g/L。另一优选的制剂含有：抗PD-1单克隆抗体10 mg/ml， 20 mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，质量/体积百分比为1-3%的蔗糖，体积百分比为0.02%的聚山梨酯80，质量/体积百分比为0.3%的氯化钠，pH 5.5，其中质量/体积比为g/L。再一优选的配制剂含有：抗PD-1单克隆抗体10 mg/ml ，20 mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，质量/体积百分比为1%的甘氨酸，体积百分比为0.02%的聚山梨酯80，质量/体积百分比为0.3%的氯化钠，pH 5.5，其中质量/体积比为g/L。

所述药物配制剂的剂型为本领域常规剂型，较佳地包括注射用液体制剂或冻干制剂等等。所述注射用液体制剂较佳地包括皮下注射制剂、静脉注射制剂、腹腔给药制剂、肌肉注射制剂、静脉/皮下注射制剂或玻璃体注射制剂等。所述注射用液体制剂较佳地包括水针注射制剂、预充针注射制剂等，优选地为水针注射制剂，该水针注射制剂可以用于静脉注射。

本发明所得药物制剂经过高温加速测试，主要检测指标均无明显变化；在40℃条件下经过4周的加速处理，经检测表明，各项主要检测指标均无明显变化，较为稳定，且所有检测结果均符合本品现行质量标准要求，表现出良好的稳定性。

附图说明

图1 h1G4抗体制剂缓冲体系筛选研究加速稳定性试验（40°C）SEC片段含量（%）柱状图。

图2 h1G4抗体制剂缓冲体系筛选研究加速稳定性试验（40°C）浊度柱状图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行进一步的详细说明，不应理解为对本发明的限制。

试剂来源：本发明的实验部分涉及的试剂均为市售产品。

实施例1. 样品测试方法

1.1.渗透压检测

移液器吸取20 μl样品及2份290 mOsmol/kg的渗透压标准品，采用Advanced 2020 型渗透压仪测定样品及标准品的渗透压值。

1.2.SEC-HPLC

采用Agilent 1260高效液相色谱，TOSOH TSK G3000（300*7.8 mm）色谱柱分析样品，柱温为室温，流速0.5 mL/min，检测波长280 nm。流动相组成为100 mM PB，0.5% NaCl，pH6.8，供试样品用流动相稀释到1.0 mg/mL左右，进样50 μL，停止时间30 min。

1.3.CEX-HPLC

采用Agilent 1260高效液相色谱，Thermo ProPac WCX-10色谱柱 (4×250 mm)分析样品，柱温为35°C，流速1.0 mL/min，检测波长280 nm，流动相洗脱梯度见表 1所示。流动相A组成为CX-1 Gradient buffer A，pH 5.6，流动相B组成为CX-1 Gradient buffer B，pH10.2，供试样品用流动相A稀释到1.0 mg/mL左右，进样20μL。

表 1. 流动相洗脱梯度

时间（min）流动相B%流速（mL/min）0.0010.01.05.0010.01.035.0040.01.035.01100.01.040.00100.01.040.0110.01.045.0010.01.0

1.4.DSC

通过差示热量扫描方法测试供试品Tm onset、Tm1及Tm2值。样品扫描前需用安慰剂稀释至1.0 mg/ml。

实施例2.抗体的制备

PD-1抗体h1G4来源自专利申请WO2018052818中所公开的h1G4，其制备方法完全引用WO2018052818。PD-1抗体h1G4的氨基酸序列如下：

表 2 h1G4的CDR序列

h1G4抗体重链可变区（VH）SEQ ID NO：7

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWIRQAPGKGLEWVSTISGGGSNIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSYYYGIDFWGQGTSVTVSS

h1G4抗体轻链可变区（VL）SEQ ID NO：8

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTIPWTFGGGTKLEIK

h1G4抗体轻链（LC）SEQ ID NO：9

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTIPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

h1G4抗体重链（HC）SEQ ID NO：10

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWIRQAPGKGLEWVSTISGGGSNIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSYYYGIDFWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

实施例3.缓冲体系筛选研究

本研究选择了两组不同的制剂缓冲体系作为备选处方（以下分别称为B1~B6），目标药物h1G4抗体浓度为10.0 mg/mL。其中B1~B3为20 mmol/L 枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系，pH值为5.0、5.5及6.0；B4~B6为20 mmol/L组氨酸-组氨酸盐酸缓冲体系，pH值为5.0、5.5及6.0；上述缓冲体系中均含有3%甘露醇、0.02%聚山梨酯80以及0.3%氯化钠作为辅料，本材料中辅料浓度百分比均指代质量体积比（w/v，g/L）。h1G4抗体制剂缓冲体系筛选研究备选处方信息见表3。

表3. h1G4抗体制剂备选缓冲体系组成

取适量抗体原液超滤换液，加辅料，调节浓度制备成表3处方。生物安全柜内采用0.22μm一次性无菌过滤器过滤样品，无菌分装至2 mL西林瓶中，加13 mm胶塞，轧13 mm铝塑组合盖。将分装后样品放置于40°C及2~8°C的恒温药用保存箱内正置2周，于第0、1、2周分别取样，检测分析，测试项目详见表4。

表4. h1G4抗体缓冲体系筛选研究考察条件

研究结果

1.高温加速试验结果

0周时除20 mmol/L pH 5.0的枸橼酸体系（C50）出现颗粒外，其余缓冲体系外观均为无色微乳光液体，无明显可见异物，浓度在9~11 mg/mL范围内，渗透压摩尔浓度为300~340mOsmol/kg。SEC主峰含量均大于99.0%，聚体含量为0.6~0.7%。CEX主峰含量为47.0~48.6%，酸性峰含量为11.0~14.3%，碱性峰含量为38.6~40.9%，R-CE-SDS纯度为94.1~96.9%。基础理化检测结果显示0周时，各缓冲体系质量良好，无明显差异（见表5）。

在40°C加速条件下放置2周后，所有枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系蛋白浓度无明显变化，均在9~11 mg/mL范围内，但是组氨酸-组氨酸盐酸缓冲体系中浓度显著升高，并且C50、C60以及H55缓冲体系出现蛋白沉淀，组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲体系浊度（A350：使用NanoDrop 2000C，加样2.5 μL，测定样品在350 nm波长下的吸光度值。重复测定三次取其均值为最终结果。）数值明显增加（见图1和图2），故缓冲体系优劣排序为C55>C60>C50, H60>H55>H50。40 ± 2ºC条件下放置2周CE-SDS测定重链含量降低5.4~23.7%，纯度排序为C55,H55, H50>H60>C50>C60。

40°C加速条件下放置2周，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系SEC主峰含量降低0.1~2.5%，聚体含量增加0.1~0.4%，片段含量增加0~2.1%。但是所有组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲体系均发生明显降解反应，因此枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系优于组氨酸-组氨酸盐酸体系，最佳pH为5.5。

表5. h1G4抗体缓冲体系筛选研究加速稳定性试验（40°C）数据汇总表

注：N/A表示不适用。

实施例4.

本轮研究共6个备选处方（以下分别称为F1~F6），目标蛋白h1G4抗体浓度为10.0 mg/mL。缓冲体系均为20 mmol/L pH 5.5的枸橼酸-枸橼酸钠溶液。除了处方F3不含氯化钠以外，其余处方中均含有0.3%氯化钠、0.02%聚山梨酯80，其中处方F1、F2和F5中甘露醇的含量分别为1%、3%和5%，单因素考察甘露醇含量对蛋白稳定性影响。对比处方F2（0.3% NaCl）及F3（0% NaCl），考察氯化钠是否有助于增加蛋白的稳定性。F2、F5和F6处方中分别含有等渗的3%甘露醇、3%蔗糖以及1%甘氨酸，筛选有助于h1G4抗体制剂长期稳定性的最优辅料体系。h1G4抗体制剂辅料筛选研究备选处方信息见表6。

表6. h1G4抗体制剂辅料筛选研究备选处方组成

取适量原液超滤换液，加辅料，调节浓度制备成表6处方，生物安全柜内采用0.22 μm一次性无菌过滤器过滤样品，无菌分装至2 mL西林瓶中，加13 mm胶塞，轧13 mm铝塑组合盖。将分装后样品放置于40 ºC及2~8ºC的恒温药用保存箱内正置8周。于第0、1、2、4、6、8周分别取样检测。

h1G4抗体制剂辅料筛选研究单因素试验设计6个处方，根据40 ºC加速稳定性试验结果以及辅料优劣排序（见表7），不含氯化钠的处方（F3）以及含有5%甘露醇的处方（F4）稳定性略差，含有1%甘露醇、3%甘露醇的处方与含有3%蔗糖的处方（F5）无显著性差异。

表7. h1G4抗体制剂辅料筛选研究高温加速试验（40°C）数据汇总表

注：N/A表示不适用。*表示F4处方在40±2℃放置2周后乳光情况略重于其余处方。

实施例5.稳定剂的筛选

本轮研究通过单因素试验筛选制剂处方，共设计9个备选处方（以下分别称为F7~F15），目标药物h1G4抗体浓度为10.0 mg/mL。其中处方F7~F14的缓冲体系均为20 mmol/L pH 5.5枸橼酸-枸橼酸钠，F15为20 mmol/L枸橼酸钠-磷酸氢二钠，制剂辅料筛选研究备选处方信息见表8。

表8. h1G4抗体制剂辅料筛选研究备选处方组成

取适量原液超滤换液，加辅料，调节浓度制备成表8处方，生物安全柜内采用0.22 μm一次性无菌过滤器过滤样品，无菌分装至2 mL西林瓶中，加13 mm胶塞，轧13 mm铝塑组合盖。将分装后样品放置于恒温摇床内40 ºC，200 rpm振摇4周。于第0、1、2、4周分别取样，检测分析（见表9）。

表9. h1G4抗体制剂辅料筛选研究考察条件

研究结果

0周时所有处方外观均为无色澄清液体，无明显可见异物，浓度在9~11 mg/mL范围内，渗透压为185~540 mOsmol/kg，浊度（A350）为0.006~0.009。SEC主峰含量为98.0~98.2%，聚体含量为1.7~1.9 %。CEX主峰含量为35.4~39.1%，酸性峰含量为31.6~33.8%，碱性峰含量为27.5~30.8%（见表10）。基础理化检测结果显示0周时，各处方质量良好，无明显差异。

经过最长4周的40°C加速处理，可以看出枸橼酸钠-磷酸氢二钠缓冲体系不适于h1G4抗体的稳定保存。

表10. h1G4抗体制剂辅料筛选研究振摇稳定性试验（40 °C，200 rpm）数据汇总表

注：N/A表示不适用。

结果表明，本发明所得h1G4制剂成品在40 ºC条件下保存最长4周，外观、可见异物、蛋白质含量、SEC、CEX、pH、渗透压均未见明显变化趋势，均符合本品现行质量标准草案要求，表明所述制剂具有较好的稳定性。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司

<120> 一种细胞程序性死亡受体1抗体制剂及其用途

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(11)

<223> h1G4 LCDR1

<400> 1

Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala Val Ala

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

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<400> 2

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1 5

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<212> PRT

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<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(9)

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<400> 3

Gln Gln His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(9)

<223> h1G4 HCDR1

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Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser

1 5

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(10)

<223> h1G4 HCDR2

<400> 5

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(9)

<223> VSYYYGIDF

<400> 6

Val Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Phe

1 5

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(116)

<223> h1G4 VH

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

202530

Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

354045

Ser Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65707580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Val Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

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<223> h1G4 VL

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala

202530

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

354045

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505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Ile Pro Trp

859095

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<221> CHAIN

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 1015

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

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859095

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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

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130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

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210

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<220>

<221> CHAIN

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<223> h1G4 重链

<400> 10

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

202530

Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Val Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

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225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440