一种用于神经保护和促进神经再生的药物组合物及其制剂

摘要

本发明公开了一种用于神经保护和促进神经再生的药物组合物，所述药物组合物包含如结构式I所述的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。本发明还提供了一种本发明的药物组合物在制备用于预防或治疗涉及神经元受损或具有发展成神经元受损的风险的疾病或病症的药物中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于神经保护和促进神经再生的药物组合物及其制剂。

背景技术

“脑卒中”是一种严重威胁人类生命健康的急性脑血管疾病。从病理学的角度来看，脑卒中是由于脑部血管阻塞，导致血液无法灌注大脑血管，或者是由于脑部血管突然破裂，从而引起脑组织损伤的一类疾病，又称“脑血管意外”、俗称“中风”。脑卒中包括缺血性卒中和出血性卒中两类，其中缺血性卒中包括短暂性脑缺血发作、脑血栓形成、脑栓塞等类型，其发病率高于出血性卒中，占脑卒中总数的60％～70％，严重者可引起死亡，而出血性卒中包含脑出血和蛛网膜下隙出血两种，死亡率较缺血性卒中更高。

导致脑卒中的最常见原因是脑部血管内壁上的小栓子或心脏瓣膜的附壁血栓脱落，堵塞脑血管，导致动脉-动脉栓塞，即缺血性卒中，或者是由于高血压、脑动静脉畸形以及动脉瘤等因素引起脑血管或血栓出血而致病，为出血性卒中。高血压、糖尿病、高血脂等疾病，以及不健康的饮食、肥胖、吸烟、缺乏适量运动、过量饮酒和高同型半胱氨酸等因素都会增加脑卒中的发病风险。

脑卒中的临床特征主要包括言语、认知、运动和感觉功能障碍、吞咽障碍、平衡障碍、心理障碍等，具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点。不同类型的脑卒中，其治疗方式不同。然而截止到目前，临床上能够用于治疗脑卒中的手段仅有溶栓药、外科手术等少数种类，且临床使用时间窗极为短暂。目前，本领域的研究热点集中于寻找能够用于神经保护和促进神经再生，从而延长神经元对缺血的耐受时间和治疗窗、补充受损或死亡的神经元，促进脑卒中后中枢神经系统功能恢复的药物。然而，鉴于脑卒中本身的严重危害性和中枢神经系统结构和功能的复杂性，在本领域中还存在着对此类药物的未满足的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可以用于预防或治疗涉及神经元受损或具有发展成神经元受损的风险的疾病或病症，特别是用于预防或治疗缺血性卒中的药物组合物及其制剂。

本发明的发明人通过实验意外地发现，如以下结构式所述的(6S)-5'-氟-2'-氧代-1',2',5,7-四氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,3'-吡咯并[2,3-b]吡啶]-3-甲酸(以下简称化合物I)具有神经保护和促进神经再生的作用

，因而可以用于预防或治疗涉及神经元受损或具有发展成神经元受损的风险的疾病或病症，特别是用于预防或治疗缺血性卒中。

为此，在一个方面中，本发明提供一种用于神经保护和促进神经再生的药物组合物，所述药物组合物包含化合物I或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

本发明所使用的化合物I先前描述于专利文献WO2012/064910A1中。专利文献WO2012/064910A1一般地涉及降钙素基因相关肽(CGRP)受体拮抗剂化合物，据信所述化合物是CGRP受体的非常有效的拮抗剂，并可用于治疗或预防其中涉及CGRP的疾病，诸如偏头痛。在该文献中，化合物I被描述作为INTERMEDIATE 34(中间体34)公开，并且可以根据第66-68页描述的合成方法制备。但是，该专利文献并未提及所述化合物具有任何生物学和/或药理学活性，更没有提及所述化合物具有神经保护和促进神经再生的作用，而这构成了本发明的意外发现。

本发明所述的药物组合物还可以包含其它用于预防或治疗缺血性脑卒中的药物，所述药物包括但不限于改善微循环、扩充血容量的药物如低分子右旋糖酐、溶解血栓的药物如尿激酶、抗凝药物如肝素、钙离子拮抗剂如尼莫地平、防止血小板凝聚的药物如阿司匹林。

本发明所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。可以采用本领域内通常使用的任何药学上可接受的载体来制备所述药物组合物。

例如，为了制备用于口服给药的固体剂型，可以使用乳糖、微晶纤维素、蔗糖、环糊精、甘露醇、阿拉伯胶、羧甲基淀粉钠、玉米淀粉、马铃薯淀粉、滑石粉、硬脂酸镁、明胶等本领域已知的固体载体。另外，还可以使用和活性成分或已使用的成分相容的任何其它通常用于着色、矫味、防腐等目的的载体。

为了制备用于口服给药的液体剂型，可以使用水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇以及植物油如花生油、芝麻油、大豆油、橄榄油等本领域已知的液体载体。

为了制备胃肠外给药的剂型，可以使用注射用水、注射用油如大豆油、花生油、蓖麻油、其它注射用溶剂如乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、二甲基乙酰胺等本领域已知的无菌载体。如果需要，还可以使用如润湿剂、增溶剂、助悬剂、乳化剂、缓冲剂、抑菌剂、抗氧剂、等渗调节剂等各种添加剂。为了制备注射用无菌粉末，还可以使用如乳糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸和人血清白蛋白等填充剂与保护剂。

可根据本领域的常规制剂技术将本发明所述的药物组合物制成各种药学上可接受的剂型，如片剂、粉末剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、可注射溶液、注射用无菌粉末等。

本发明所述的药物组合物可以通过任何适当的给药途径给药。优选地，本发明所述的药物组合物通过胃肠外途径给药。

为此，在一个方面中，本发明提供了一种用于神经保护和促进神经再生的药物组合物，其中所述药物组合物是胃肠外制剂的形式，所述胃肠外制剂由化合物I或其药学上可接受的盐、任选的其它用于预防或治疗缺血性脑卒中的药物和药学上可接受的载体组成，其中所述化合物I或其药学上可接受的盐以5-20mg/ml的浓度存在，所述药学上可接受的载体由聚山梨酯80、羟基甲基丙基纤维素、磷酸盐缓冲剂、NaCl和水组成，并且所述化合物I或其药学上可接受的盐、聚山梨酯80、羟基甲基丙基纤维素、磷酸盐缓冲剂和NaCl的重量比为5-20:5-20:2-8:0.6-2.4:4.2-16.8。

在一个方面中，所述化合物I或其药学上可接受的盐、聚山梨酯80、羟基甲基丙基纤维素、磷酸盐缓冲剂和NaCl的重量比为10:10:4:1.2:8.4。

在一个方面中，所述磷酸盐缓冲剂由NaH₂PO₄、NaH₂PO₄:H₂O和Na₂HPO₄组成，且三者之间的重量比为1:3:2。

本发明还提供了一种本发明的药物组合物在制备用于预防或治疗涉及神经元受损或具有发展成神经元受损的风险的疾病或病症的药物中的用途。优选地，所述涉及神经元受损或具有发展成神经元受损的风险的疾病或病症是缺血性脑卒中。

为了使本发明的实质和精神得到进一步理解，下面结合具体实施例对本发明的优选实施方案及其效果进行描述。但是，应当理解，这些描述只是用于进一步说明本发明的特征和优点，而绝非对本发明的权利要求构成任何限制。

具体实施方式

实施例1

胃肠外制剂

将5.0g聚山梨酯80加入到500mL烧瓶中，并加入100mL注射用水到烧瓶中以溶解。接着，将2.0g羟基甲基丙基纤维素与额外的300mL注射用水加入到烧瓶中。用搅拌棒搅拌内容物以溶解。然后，加入磷酸盐缓冲剂：0.1g>2PO₄；0.3g>2PO₄:H₂O；和0.2g>2HPO₄以及4.2gNaCl。将混合物再次搅拌以溶解并且然后补足至500mL。将溶液经0.22微米Corning过滤器过滤。最后，在环境室温下在搅拌下将50mg化合物I加入带塞子的透明的无菌小瓶中，加入前述滤液，配制成浓度为5mg/ml的溶液，即得用于肌肉内注射的胃肠外制剂。

实施例2

胃肠外制剂

将5.0g聚山梨酯80加入到500mL烧瓶中，并加入100mL注射用水到烧瓶中以溶解。接着，将2.0g羟基甲基丙基纤维素与额外的300mL注射用水加入到烧瓶中。用搅拌棒搅拌内容物以溶解。然后，加入磷酸盐缓冲剂：0.1g>2PO₄；0.3g>2PO₄:H₂O；和0.2g>2HPO₄以及4.2gNaCl。将混合物再次搅拌以溶解并且然后补足至500mL。将溶液经0.22微米Corning过滤器过滤。最后，在环境室温下在搅拌下将100mg化合物I加入带塞子的透明的无菌小瓶中，加入前述滤液，配制成浓度为10mg/ml的溶液，即得用于肌肉内注射的胃肠外制剂。

实施例3

胃肠外制剂

将5.0g聚山梨酯80加入到500mL烧瓶中，并加入100mL注射用水到烧瓶中以溶解。接着，将2.0g羟基甲基丙基纤维素与额外的300mL注射用水加入到烧瓶中。用搅拌棒搅拌内容物以溶解。然后，加入磷酸盐缓冲剂：0.1g>2PO₄；0.3g>2PO₄:H₂O；和0.2g>2HPO₄以及4.2gNaCl。将混合物再次搅拌以溶解并且然后补足至500mL。将溶液经0.22微米Corning过滤器过滤。最后，在环境室温下在搅拌下将200mg化合物I加入带塞子的透明的无菌小瓶中，加入前述滤液，配制成浓度为20mg/ml的溶液，即得用于肌肉内注射的胃肠外制剂。

实验例1化合物I的神经保护作用评价

本实验的目的是利用OGD模型考察本发明的化合物I对神经元的保护作用。OGD模型即糖氧剥夺(Oxygen and glucose deprivation,OGD)离体脑缺血模型，该模型可模拟在体脑缺血的情况。

本实验的实验方法如下：

(1)原代皮质神经元培养方案

将新生SD大鼠的大脑置于包含1mM丙酮酸钠和10mMHEPES缓冲剂的无镁离子和钙离子的Hank平衡盐溶液中。接着，在Hank平衡盐溶液(含有0.125％胰蛋白酶溶液)中分离皮层组织，并在37℃下温育10分钟。然后，通过巴斯德吸管(pasteurpipette)彻底分散组织。加入包含10％热灭活的小牛血清的DMEM培养基停止消化。将分散的组织静置3分钟，并取上清液，转移到新的离心管中，在600×g下离心3分钟。将沉淀物重悬在补充了B27细胞培养添加剂、0.5mML-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素和100mg/mL链霉素的无血清的NEUROBASAL培养基中。将细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度接种至用聚-D-赖氨酸包被的24孔细胞培养板中。将细胞培养物保持在37℃、5％CO₂饱和湿度条件下。培养基每2-3天用无谷氨酸的新鲜培养基进行半量换液。

(2)糖氧剥夺离体脑缺血模型

培养一周后，将根据步骤(1)制备的原代皮质神经元的培养基转换成含有1％(v/v)小牛血清和1％(v/v)青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基血清饥饿过夜。为了建立糖氧剥夺(OGD)离体脑缺血模型，用OGD培养基(含有1％(v/v)小牛血清和1％青霉素-链霉素(v/v)并添加了作为神经元培养物的B27的无糖DMEM培养基)洗涤(×2)培养物。将培养物和药物(化合物I，用OGD培养基配制成浓度分别为5mg/ml、10mg/ml和20mg/ml的溶液)温育半小时，转换成OGD培养基，然后将培养物转移到低氧培养箱中温育2小时，随后移除OGD培养基。随后，将培养物用含有1％(v/v)小牛血清和1％(v/v)青霉素-链霉素和B27的含氧高糖DMEM培养基培养。8小时后，收集再灌注培养基进行LDH分析。

(3)细胞存活率的测定

采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法进行细胞存活率的测定。LDH是活细胞浆内酶，正常时不能通过细胞膜，当细胞损伤导致细胞膜通透性变化时，会将LDH释放到培养液中。因此培养液中该酶的活性与被裂解的细胞数量成正比。

在本实验中，分别测定在细胞培养基中的LDH和细胞裂解后的总LDH，计算两者的比率并标准化为对照的倍数。通过测定LDH释放的抑制率，评价不同药物浓度条件下的神经保护程度。一般而言，对LDH释放的抑制率越大，表示药物对神经保护的程度越高。抑制率结果参见下表1。

表1不同浓度的化合物I对培养的神经元的LDH释放的抑制率

注：结果表示为均值±标准差。

从以上结果来看，化合物I对糖氧剥夺的离体皮质神经元具有显著的神经保护作用，并且具有显著的剂量依赖性。

实验例2化合物I的促进神经再生的作用评价

本实验的目的是利用大脑中动脉闭塞模型考察本发明的化合物I的促进神经再生的作用。

1、实验动物

本实验采用60只体重为290g±10g的雄性成年SD大鼠。将动物在25℃室温、50％相对湿度和12小时光照-12小时黑暗条件下适应两天。动物可自由进食和饮水。

2、造模

(1)大脑中动脉闭塞模型组：参照中国专利申请公开号CN106474113A公开的方法，建立大鼠大脑中动脉闭塞模型。将造模成功的大鼠随机分为模型对照组(20只)和化合物I治疗组(20只)。

(2)假手术组：另取出20只大鼠作为假手术组。假手术组大鼠进行同样的开颅术操作，但不凝闭大脑中动脉，其余操作与模型对照组相同。

3、给药

给药方案如下：

化合物I治疗组：自于每日下午6-7点之间肌肉内注射给予实施例2的胃肠外制剂，剂量为50mg/kg体重/日，持续4周。

模型对照组：于每日下午6-7点之间肌肉内注射给予等量生理盐水，持续4周。

假手术组：同模型对照组。

实验结束后，采用前肢放置检测法测定大鼠运动功能。大鼠每侧受测10次，前肢触及桌面角边缘次数的百分率即为该侧得分。

分别于造模成功后24h、7d、2、4周进行评分。另外，实验结束后，分别用免疫组化法和原位杂交法观察脑组织酪氨酸受体激酶B(trk-B)和勿动蛋白A(Nogo-A)的表达，并测定染色平均灰度。

4、结果

实验统计结果参见下表2-3。

表2各组大鼠运动功能评分

注：结果表示为均值±标准差，**表示与模型对照组比较，p<0.01。

表3各组大鼠trk-B和Nogo-A平均灰度比较

注：结果表示为均值±标准差，**表示与模型对照组比较，p<0.01。

以上结果显示，化合物I能够明显改善大脑中动脉闭塞模型大鼠的运动功能。特别地，化合物I治疗组大鼠在造模成功后第2、4周的运动功能评分明显高于模型对照组，P＜0.01。另外，对于trk-B表达而言，化合物I治疗组(90.9±9.7)较模型对照组明显增强(112.7±6.3)，P＜0.01；而对于Nogo-A表达而言，化合物I治疗组(137.8±8.8)表达较模型对照组明显减弱(119.5±7.9)，P＜0.01，从而提示化合物I能够显著增强trk-B并抑制Nogo-A的表达，改善神经再生的微环境，促进缺血性卒中大鼠的运动功能恢复。

总而言之，以上实验结果充分证实了化合物I可以用于神经保护和促进神经再生，从而可以用于预防或治疗涉及神经元受损或具有发展成神经元受损的风险的疾病或病症，诸如缺血性卒中。

以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和原理的前提下，还可以做出若干改进、修饰和等同替换等，这些改进、修饰和等同替换后的技术方案也应视为落在本发明的保护范围之内。