检测应激诱导磷蛋白的纳米电化学适体传感器的制备方法

摘要

本发明公开了一种检测应激诱导磷蛋白的纳米电化学适体传感器的制备方法，采用溶剂热法制备了锰掺杂的镍基金属骨架化合物Mn‑MOF，滴涂在玻碳电极GCE表面，再滴涂亚甲基蓝末端标记单链核酸适体MB‑DNA，构筑MB‑DNA/Mn‑MOF/GCE传感界面。加入应激诱导磷蛋白STIP1，MB‑DNA适体与STIP1特异性结合，形成MB‑DNA/STIP1复合物，使MB‑DNA脱离GCE表面，引起MB氧化电流峰强度减弱。拟合MB电流峰强度与STIP1浓度之间的线性关系，构建检测STIP1的纳米电化学适体传感器。本发明方法操作便捷、灵敏度高、特异性好，可作为一种新的方法用于STIP1的定量检测。

说明书

技术领域

本发明属于功能纳米复合材料和电化学适体传感器的制备技术领域，具体涉及一种检测应激诱导磷蛋白的纳米电化学适体传感器的制备方法，其制备的传感器可用于生物医学样品中应激诱导磷蛋白的高灵敏和高选择性检测。

背景技术

应激诱导磷蛋白(STIP1)是由卵巢癌组织分泌到患者外周血中的一种蛋白，检测STIP1有助于提高卵巢癌的早期诊断水平。近年来，有关STIP1作为潜在肿瘤标志物用于检测人体卵巢癌的研究被陆续报道。Huang等制备了基于金纳米颗粒的杂化纳米复合物调控的荧光开-关，用于检测人源STIP1(Yue Huang,Hao Li,Lei Wang,Xiaoxia Mao,Genxi Li,Highly sensitive protein detection based on smart hybrid nanocomposite-controlled switch ofDNA polymerase activity,ACS AppliedMaterials&Interfaces,2016,8,28202-28207)；Chen等制备了基于还原氧化石墨烯的双功能传感界面，用于STIP1的荧光和拉曼散射光检测(Feng Chen,Yi Liu,Chunyan Chen,Hang Gong,Changqun Cai,Xiaoming Chen,Respective and simultaneous detection tumor markers CA125 andSTIP1 using aptamer-based fluorescent and RLS sensors,Sensors and ActuatorsB:Chemical,2017,245,470–476)；朱蒂·万德瓦特等将来自母体的生物样品与生物标志物STIP1抗体相结合，开发了一种用于预防或降低胎儿或儿童自闭症谱系障碍发生风险的方法(朱蒂·万德瓦特；丹尼尔·布劳恩施魏格,诊断和治疗自闭症的方法,专利公开号CN105911275A)。当前，有关STIP1定量检测的文献报道较少，且报道的检测方法依然存在某些挑战，难以在实际样品中实现简单、快速、高灵敏和高选择性检测STIP1的目标。

基于此，本发明公开了一种检测应激诱导磷蛋白的纳米电化学适体传感器的制备方法。首先制备锰掺杂镍基金属骨架化合物(Mn-MOF)，将其乙醇分散液滴涂到洁净的玻碳电极(GCE)表面，孵育一段时间后自然干燥；然后将亚甲基蓝末端标记单链核酸适体(MB-DNA)的水溶液滴涂至Mn-MOF/GCE表面，孵育一段时间后自然干燥；最后将表面修饰的GCE插入电解槽中，以磷酸盐水为电解质溶液，并向其中加入一定量STIP1，孵育一段时间。由于MB-DNA适体与STIP1之间特异性结合形成MB-DNA/STIP1复合物，使MB-DNA脱离GCE表面，引起MB氧化还原作用降低，即电流峰强度减弱。通过拟合MB电流峰强度与外加的STIP1浓度之间的线性关系，即可构建检测STIP1的纳米电化学适体传感器。截止目前，尚未检索到有关MB-DNA/Mn-MOF纳米复合物，以及基于该复合物构建纳米电化学适体传感器用于STIP1定量检测的国内外文献和专利报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的问题，设计一种操作便捷、灵敏度高、特异性好的应激诱导磷蛋白检测的新方法。

为实现上述目的，本发明涉及的一种检测应激诱导磷蛋白的纳米电化学适体传感器的制备方法，其具体制备方法包括以下步骤：

1.检测应激诱导磷蛋白的纳米电化学适体传感器的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

(1)锰掺杂镍基金属骨架化合物(Mn-MOF)的制备：将0.465g Ni(NO₃)₂·6H₂O和0.01g>3)₂·4H₂O溶于25mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌30min后形成溶液A。将0.133g1,4-苯二甲酸溶于25mL>

(2)亚甲基蓝末端标记单链核酸适体/锰掺杂镍基金属骨架化合物/玻碳电极(MB-DNA/Mn-MOF/GCE)传感界面的构筑：在洁净的玻碳电极(GCE)表面滴涂5μLNafion溶液(5％w/w)，孵育5min后滴涂Mn-MOF水分散液，其中Mn-MOF浓度为0.1～1mg/mL，滴涂用量为5～50μL。将MB-DNA(2μM)在37℃下孵育2h，量取5～25μL滴涂在Mn-MOF/GCE表面，孵育12h后用N₂吹干，然后用二次蒸馏水和乙醇淋洗3次，产物自然干燥，得到表面修饰GCE。

(3)将MB-DNA/Mn-MOF/GCE作为工作电极插入电解槽中，加入0.1M磷酸盐水缓冲液作为电解液(pH 7.4)，向其中加入STIP1，STIP1在此电解液中的浓度为0～500ng/mL。采用含有三电极系统的CHI 660E电化学工作站测定不同STIP1浓度(C_STIP1)存在下的电化学方波伏安曲线，通过拟合亚甲基蓝的氧化电流峰强度(I_MB)与C_STIP1之间的线性关系，构建用于STIP1定量检测的纳米电化学适体传感器。STIP1浓度的线性检测范围为1～500ng/mL，检测限为1～10ng/mL。

本发明的效果是：报道了一种检测应激诱导磷蛋白的纳米电化学适体传感器的制备方法。采用溶剂热法一锅制备了锰掺杂的镍基金属骨架化合物(Mn-MOF)，在玻碳电极(GCE)表面滴涂少许Nafion作为交联剂，然后滴涂Mn-MOF的水分散液，构筑Mn-MOF/GCE。将亚甲基蓝末端标记单链核酸适体(MB-DNA)的水溶液滴涂至Mn-MOF/GCE表面，构筑MB-DNA/Mn-MOF/GCE传感界面。将表面修饰的GCE插入电解槽中，以磷酸盐水为电解质溶液。当加入一定量STIP1之后，MB-DNA适体与STIP1发生特异性结合形成MB-DNA/STIP1复合物，导致MB-DNA脱离GCE表面，引起MB氧化还原作用降低即电流峰强度减弱。通过拟合MB电流峰强度与外加的STIP1浓度之间的线性关系，可构建检测STIP1的纳米电化学适体传感器。与现有技术相比，本发明方法操作便捷、灵敏度高、特异性好，可作为一种新的STIP1检测方法，用于生物医学样品中STIP1的定量检测。

附图说明

图1为基于MB-DNA/Mn-MOF/GCE传感界面的纳米电化学适体传感器的制备方法及其定量检测STIP1的原理示意图。

图2为不同STIP1浓度存在下，以MB-DNA/Mn-MOF/GCE为工作电极测定的电化学方波伏安曲线。

图3为不同STIP1浓度对应的亚甲基蓝氧化还原电流峰强度(I_MB)，拟合不同I_MB与外泌体浓度(C_STIP1)之间的线性关系。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

本实施例涉及的基于MB-DNA/Mn-MOF/GCE传感界面的纳米电化学适体传感器的制备方法及其定量检测STIP1的原理示意图，如图1所示，具体步骤如下：

锰掺杂镍基金属骨架化合物(Mn-MOF)的制备：将0.465gNi(NO₃)₂·6H₂O和0.01gMn(NO₃)₂·4H₂O溶于25mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌30min后形成溶液A；将0.133g>

亚甲基蓝末端标记单链核酸适体/锰掺杂镍基金属骨架化合物/玻碳电极(MB-DNA/Mn-MOF/GCE)传感界面的构筑：在洁净的玻碳电极(GCE)表面滴涂5μLNafion溶液(5％w/w)，孵育5min后滴涂Mn-MOF水分散液，其中Mn-MOF浓度为0.2mg/mL，滴涂用量为10μL；将MB-DNA(2μM)在37℃下孵育2h，量取10μL滴涂在Mn-MOF/GCE表面，孵育12h后用N₂吹干，然后用二次蒸馏水和乙醇淋洗3次，产物自然干燥，得到表面修饰GCE；

将MB-DNA/Mn-MOF/GCE作为工作电极插入电解槽中，加入0.1M磷酸盐水缓冲液作为电解液(pH 7.4)，向其中加入STIP1，STIP1在此电解液中的浓度为0～275ng/mL；采用含有三电极系统的CHI 660E电化学工作站测定不同STIP1浓度(C_STIP1)存在下的电化学方波伏安曲线(如图2所示)，通过拟合亚甲基蓝的氧化电流峰强度(I_MB)与C_STIP1之间的线性关系(如图3所示)，构建用于STIP1定量检测的纳米电化学适体传感器；STIP1浓度的线性检测范围5～275ng/mL，检测限2ng/mL。

实施例2

本实施例涉及的基于MB-DNA/Mn-MOF/GCE传感界面的纳米电化学适体传感器的制备方法和定量检测STIP1的原理示意图，以及Mn-MOF的制备步骤同实施例1，其它具体制备步骤如下：

亚甲基蓝末端标记单链核酸适体/锰掺杂镍基金属骨架化合物/玻碳电极(MB-DNA/Mn-MOF/GCE)传感界面的构筑：在洁净的玻碳电极(GCE)表面滴涂5μLNafion溶液(5％w/w)，孵育5min后滴涂Mn-MOF水分散液，其中Mn-MOF浓度为0.4mg/mL，滴涂用量为20μL；将MB-DNA(2μM)在37℃下孵育2h，量取15μL滴涂在Mn-MOF/GCE表面，孵育12h后用N₂吹干，然后用二次蒸馏水和乙醇淋洗3次，产物自然干燥，得到表面修饰GCE；

将MB-DNA/Mn-MOF/GCE作为工作电极插入电解槽中，加入0.1M磷酸盐水缓冲液作为电解液(pH 7.4)，向其中加入STIP1，STIP1在此电解液中的浓度为1～500ng/mL；采用含有三电极系统的CHI 660E电化学工作站测定不同STIP1浓度(C_STIP1)存在下的电化学方波伏安曲线，通过拟合亚甲基蓝的氧化电流峰强度(I_MB)与C_STIP1之间的线性关系，构建用于STIP1定量检测的纳米电化学适体传感器；STIP1浓度的线性检测范围为2～250ng/mL，检测限为1ng/mL。

实施例3

本实施例涉及的基于MB-DNA/Mn-MOF/GCE传感界面的纳米电化学适体传感器的制备方法和定量检测STIP1的原理示意图，以及Mn-MOF的制备步骤同实施例1，其它具体制备步骤如下：

亚甲基蓝末端标记单链核酸适体/锰掺杂镍基金属骨架化合物/玻碳电极(MB-DNA/Mn-MOF/GCE)传感界面的构筑：在洁净的玻碳电极(GCE)表面滴涂5μLNafion溶液(5％w/w)，孵育5min后滴涂Mn-MOF水分散液，其中Mn-MOF浓度为0.8mg/mL，滴涂用量为30μL；将MB-DNA(2μM)在37℃下孵育2h，量取20μL滴涂在Mn-MOF/GCE表面，孵育12h后用N₂吹干，然后用二次蒸馏水和乙醇淋洗3次，产物自然干燥，得到表面修饰GCE；

将MB-DNA/Mn-MOF/GCE作为工作电极插入电解槽中，加入0.1M磷酸盐水缓冲液作为电解液(pH 7.4)，向其中加入STIP1，STIP1在此电解液中的浓度为1～500ng/mL；采用含有三电极系统的CHI 660E电化学工作站测定不同STIP1浓度(C_STIP1)存在下的电化学方波伏安曲线，通过拟合亚甲基蓝的氧化电流峰强度(I_MB)与C_STIP1之间的线性关系，构建用于STIP1定量检测的纳米电化学适体传感器；STIP1浓度的线性检测范围为2～500ng/mL，检测限为2ng/mL。