一种外周血单个核细胞无血清冻存液及冻存方法

摘要

本发明公开了一种外周血单个核细胞无血清冻存液，其按体积分数计包括以下组分：5～20％的二甲基亚砜、0.5～10％右旋糖酐40，余量为勃脉力A。本发明还公开了采用上述外周血单个核细胞无血清冻存液冻存外周血单个核细胞的方法。与现有技术相比，本发明的冻存液不含动物血清、人血清、细胞培养基，且冻存效果良好，细胞复苏后既可直接用于临床，又可在体外诱导成免疫细胞NKT、CIK，在临床上颇具应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞冻存液技术领域，具体涉及一种外周血单个核细胞无血清冻存液及冻 存方法。

背景技术

外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，指外周血中具有 单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞和造血干细胞等。PBMC 在体外可诱导分化成多种免疫细胞，如细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、自然杀伤细胞(NK)、 自然杀伤性T细胞(NKT)，在抗肿瘤、抗感染等方面具有重大用途。因此，冻存PBMC在细 胞治疗方面具有很重要的意义。

细胞冻存是细胞长期保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低 温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复 苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其 他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻 法冻存细胞。目前最常用的冻存保护剂为二甲基亚砜(DMSO)，这种物质分子量小，溶解度 大，易穿透细胞，可以使冰点下降，减少胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损 伤。由于高浓度DMSO对细胞有毒性，还必须添加其他的液体成分，如血清、细胞培养基， 以降低DMSO的浓度，减少对细胞的伤害。

现有PBMC冻存液主要以DMSO为主，联合胎牛血清(FBS)或人血清(HAS)，并添加细 胞培养基。血清可保护PBMC免于遭受冻存、复苏的损伤。比如，王桂喜等比较 DMSO10％+FBS90％、DMSO10％+右旋糖酐40(Dextran-40)10％+FBS80％、DMSO10％+(羟乙基淀 粉)HES 6％+FBS 84％等冻存液配方对对PBMC的保护作用，结果显示DMSO10％+Dextran-40 10％+FBS80％的冻存效果最好，PBMC复苏后活率最高，为79.7±1.5％。Robab Nazarpour 等研究发现，10％～15％DMSO+40％FBS冻存PBMC效果较好。此外，公开号为CN102669087A的 中国发明专利申请，公开了一种外周血单个核细胞冻存液，包含渗透性冷冻保护剂、β-葡 聚糖、血清或血浆、生理盐水。此外，细胞培养基也是冻存液的常用组分，比如覃春捷等 用以RPMI 1640培养基和DMSO、10％白蛋白作冻存保护剂在-80℃条件下直接冻存外周造血 干细胞。

现有技术中干细胞冻存液所使用的胎牛血清常携带动物源性病毒，比如欧洲多个国家 发生疯牛病，其血清中含有导致疯牛病的病毒，用于冻存细胞会导致此类病毒传播。此外， 有研究表明长期与胎牛血清接触的干细胞会对溶液介质中的胎牛血清发生内吞，内吞胎牛 血清后的干细胞有可能发生某些蛋白表达的变化，应用于人体后有可能发生异种动物蛋白 引起的免疫反应，从而导致干细胞移植后成功率降低以及不良反应的发生。而人血清亦可 传播潜在的病毒，比如乙肝病毒，艾滋病毒等。因此，中国药品和食品质量监督管理局2003 年发布的《人体细胞治疗临床研究和质量控制指导原则》明确指出，应尽量避免使用血清 培养细胞，包括动物血清和人血清。

为了避免使用血清带来病毒感染，有些人使用了人血白蛋白，但人血蛋白在临床上可 能引起一些不良反应，比如过敏性休克、发热、心脏损害、呼吸系统损害、肾脏损害等， 这限制了含有白蛋白的细胞冻存液在临床上直接使用的安全性。

另外，现有的冻存液配方中含有细胞培养基，细胞培养基不能直接注射入人体，故如 果需要细胞复苏后直接移植，则必需通过离心把细胞培养基去除掉，而离心又会导致刚刚 复苏的细胞受损，活率降低，影响细胞治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种外周血单个核细胞无血清冻存 液，该冻存液由DMSO、右旋糖酐40、勃脉力A组成，不含动物血清、人血清、细胞培养基， 且冻存效果良好，细胞复苏后既可直接用于临床，又可在体外诱导成免疫细胞NKT、CIK， 在临床上颇具应用价值。本发明具体的技术方案如下：

一种外周血单个核细胞无血清冻存液，其特征在于，按体积分数计包括以下组分：5～ 20％的二甲基亚砜、0.5～10％右旋糖酐40，余量为勃脉力A。

其中勃脉力A为中国药监局批准用于临床的复方电解质注射液，其组分为：每1000ml 含氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g。

本发明的目的还可以通过以下方案实现：

实现本发明的一种技术方案是：所述外周血单个核细胞无血清冻存液按体积分数计包 括以下组分：10％的二甲基亚砜、1％右旋糖酐40，余量为勃脉力A，所述右旋糖酐40为6％ 右旋糖酐-40葡萄糖注射液，其含有葡萄糖，可为细胞提供一定的营养成分。

实现本发明的一种技术方案是：所述外周血单个核细胞无血清冻存液按体积分数计包 括以下组分：20％的二甲基亚砜、2％右旋糖酐40，余量为勃脉力A，所述右旋糖酐40为6％ 右旋糖酐-40葡萄糖注射液。

本发明还提供了利用上述外周血单个核细胞无血清冻存液来冻存外周血单个核细胞的 方法，具体的技术方案如下：

一种外周血单个核细胞无血清冻存方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提供外周血单个核细胞；

(2)配制权利要求1至3任意一项所述的外周血单个核细胞无血清冻存液；

(3)用勃脉力A重悬外周血单个核细胞，并向细胞悬液中加入等体积的无血清冻存液， 然后分装于冻存管中，将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，在-80℃环境中冷冻，次日再 移入液氮罐。

优选地，步骤(3)加入的勃脉力A的量以使得外周血单个核细胞的浓度为最终冻存液 中外周血单个核细胞浓度的两倍为准。

优选地，步骤(3)冻存管中，外周血单个核细胞的密度为(0.5～1)×10⁷/ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明摒弃采用动物血清、人血清、细胞培养基作为冻存液的成分之一，而是采 用了勃脉力A和右旋糖酐40联合二甲基亚砜来作为PBMC的冻存液，避免了传播潜在病原 体的风险，提高了细胞冻存的安全性，又确保了PBMC的冻存效果；另外，不含细胞培养基 的冻存液，PBMC复苏后可以直接回输人体，在临床上具有很大的实用价值；本发明的配方 在没有白蛋白的情况下，亦取得良好的冻存效果。

2、本发明的冻存液中，DMSO易穿透细胞，在细胞冻存过程中可以使冰点下降，减少细 胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤；右旋糖酐40则起到稳定细胞膜的作用， 避免细胞遭受冻存伤害；勃脉力A则维持电解质平衡，使细胞处于一种比较温和的更接近 于体内环境的溶液中。

3、本发明选择合适于外周血单个核细胞冻存的物质配制成冻存液，且简化了冻存液的 组分，但获得了突出的效果，用本发明冻存液冻存的外周血单个核细胞复苏后，安全无毒， 可直接用于临床，又可在体外诱导成免疫细胞NKT、CIK，细胞的活性高。

附图说明

图1为采用本发明的方法冻存PBMC后复苏向NKT诱导培养第14天的细胞状图；

图2为PBMC向NKT诱导分化14天后表面标识物检测图；

图3为PBMC向CIK诱导分化14天后表面标识物检测图

图4为采用本发明的方法冻存PBMC后复苏向CIK诱导培养第14天的细胞状图。

具体实施方式

下面通过具体实施例子对本发明做进一步详细介绍，以便清楚理解本发明所要保护的 技术方案。

实施例一

人外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步聚：

1、PBMC的分离

1.1用10mL一次性移液管将添加枸橼酸钠抗凝剂的30ml外周血转移到50mL离心管 中，800g离心10min。

1.2离心结束后用巴氏吸管吸去上层血浆，用10mL一次性移液管加入20ml生理盐水 稀释，混合均匀。

1.3另取一支新的50mL离心管，用10mL一次性移液管每管加入12mL淋巴细胞分离 液(血液稀释液：淋巴分离液＝2:1)，用10mL一次性移液管将稀释后的血液缓慢转移至淋 巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。

1.4 700g离心30min，离心升降速率改为0。

1.5离心后从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、外 周血单个核细胞层(PBMC层)、血浆层。用巴氏吸管将PBMC层吸出，转移至另一支50mL 离心管中。

1.6用10mL一次性移液管加生理盐水至40mL，重悬PBMC，400g离心5min。

1.7离心结束后弃上清，用一次性移液管加入40mL生理盐水充分重悬细胞后，取20 μL细胞悬液于1.5mL EP管中，用细胞计数仪进行计数，其余悬液250g离心5min。

1.9去上清，得到PBMC。

实施例二

人外周血单个核细胞无血清冻存液的配制，按体积百分数计将5～20％的二甲基亚砜、 0.5～10％右旋糖酐40，余量为勃脉力A混合均匀。

勃脉力A组分为：每1000ml含氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化 钾0.37g、氯化镁0.30g。

进一步具体的方案，可以将上述人外周血单个核细胞无血清冻存液配制成按体积百分 数计，包含20％DMSO、2％右旋糖酐40，余量为勃脉力A。也可以将上述人外周血单个核细胞 无血清冻存液配制成按体积百分数计，包含10％DMSO、1％右旋糖酐40，余量为勃脉力A。

实施例三

人外周血单个核细胞无血清冻存方法，具体的步骤为：

1、取实施例二配制的细胞冻存液(20％DMSO+2％右旋糖酐40+勃脉力A)10～20ml。

2、取实施例一分离得到的PBMC细胞沉淀。

4、向PBMC细胞沉淀中加入勃脉力A使细胞密度为1～2×10⁷/ml，轻轻吹打混匀。

5、向上述PBMC细胞悬液中沿管壁缓缓加入与管内细胞悬液等体积的步骤1所配制的 细胞冻存液，轻轻吹打混匀，使细胞密度为(0.5～1)×10⁷/ml。

6、将细胞悬液分装于冻存管内，每管1ml。

7、在冻存管上做好标记，包括脐带编号、细胞代数、细胞冻存批号、冻存日期、操作 者等相关信息。

8、将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，于-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐。

实施例四

PBMC的复苏，具体方法如下：

1、恒温水浴箱的温度调节至37℃；从液氮中取出细胞冻存管，立即投入37℃温水中 轻轻晃动，直至冻存液完全溶解。

2、用75％乙醇擦拭冻存管盖子，火焰烧灼冻存管盖子；打开冻存管盖子，往冻存管中 缓缓加入4℃预冷RPMI 1640培养基1ml，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到50ml离心管 内；再次往冻存管中加入1ml 4℃预冷RPMI 1640培养基，1ml枪头吹打洗涤，一并移入离 心管中。

3、往离心管中缓缓加入4℃预冷RPMI 1640培养基15ml，200g离心5min，弃上清液；

4、向离心管中加入4℃预冷RPMI 1640培养基5ml，轻轻吹打混匀，取样10μl进行 计数，并计算细胞活率。

5、结果显示，冻存2个月的3个批次PBMC复苏后细胞活率平均值为84.03％，冻存效 果良好，具体见表1。

表1

PBMC批次 NO.1 NO.2 NO.3 平均值 PBMC复苏活率 83.50％ 85.70％ 82.90％ 84.03％

实施例五

PBMC向NKT细胞诱导实验，具体方法如下：

1、得到PBMC后，加入一定量X-VIVO15培养基(Lonza，瑞士),使细胞密度为1×10⁶/ml， 重悬细胞沉淀，接种于T75细胞培养瓶中，并添加20-300U/mL IL-2、5-50ng/mL IL-15。

2、此后，每3天取20ul细胞悬液进行计数，当细胞密度大于2×10⁶/ml时，添加X-VIVO15 培养基，使细胞密度为1×10⁶/ml，添加20-300U/mL IL-2、5-50ng/mL IL-15。

3、培养第14天，收集NKT细胞,观察NKT细胞，结果见附图1(图1为显微镜下NKT 照片，100倍)，进行细胞表面抗原CD3、CD56检测，以及针对肿瘤细胞的杀伤活性实验。

4、流式检测结果显示，NKT细胞培养14天后，CD3+CD56+细胞为32.7％，显示诱导效 果良好(见图2)。NKT对肿瘤细胞K562的杀伤活性，在NKT对K562细胞比例为40:1时， 其杀伤率可达到45.4％，显示其杀伤活性良好的检测结果见表2。

表2

NKT/K562 40:1 20:1 10:1 杀伤率 45.4％ 43.5％ 38.3％

实施例六

PBMC向CIK细胞诱导实验，具体方法如下：

1、得到PBMC后，按照1×10⁶/ml的密度加入一定量X-VIVO15培养基重悬细胞沉淀， 接种于T75细胞培养瓶中，并根据添加的培养基加入500-2000U/mL IFN-λ，诱导培养CIK 细胞。

2、第2天全量补加5-50ng/mL OKT-3和100-500U/mL IL-2。

3、此后，每3天取20ul细胞悬液进行计数，当细胞密度大于2×10⁶/ml时，添加 X-VIVO15培养基，使细胞密度为1×10⁶/ml，并加入100-500U/mL IL-2。

4、第14天，收集CIK细胞，观察细胞状态，结果见附图4(图4为显微镜下CIK照片， 100倍)。进行细胞表面抗原CD3、CD56检测，以及针对肿瘤细胞的杀伤活性实验。

5、流式检测结果显示，CIK细胞培养14天后，CD3+CD56+细胞为24.9％，显示诱导效 果良好(图3)。CIK对肿瘤细胞HL60的杀伤活性，在CIK对HL60细胞比例为20:1时，其 杀伤率可达到67.6％，显示其杀伤活性良好，结果见表3。

表3

CIK/HL60 20:1 10:1 5:1 杀伤率 67.6％ 45.8％ 38.1％

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进 行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一 些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了 一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。