一种基于光诱导电子转移筛选G-四链体配体的方法

摘要

本发明涉及一种基于光诱导电子转移筛选G-四链体配体的方法，其是通过向发夹型DNA稀释液中加入一定量的中药单体溶液，检测发夹型DNA溶液在加入中药单体溶液前后的荧光强度变化，即可实现G-四链体配体的筛选，本发明充分利用G-四链体的配体可以诱导包含人端粒DNA片段的发夹探针形成G-四链体，使得发夹探针上标记的羧基荧光素(FAM)堆积在由四个G碱基组成的G四分体平面上，与G碱基靠近而发生光诱导电子转移，荧光强度降低的机理，具有操作简单、响应快速、普适性强、易于推广的优点，能够实现G-四链体配体的高通量筛选，为筛选以G-四链体为靶点的抗肿瘤药物提供了一种简单、有效的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外基于光诱导电子转移均相筛选G-四链体配体的方 法，属于抗肿瘤药物筛选的技术领域。

背景技术

端粒酶以自身的RNA作为模板，在染色体末端合成端粒序列，以保持染 色体末端端粒长度稳定，从而使细胞永生化。研究发现，端粒酶在85％以上 的癌症细胞中呈阳性表达，而在正常体细胞中几乎没有表达，并且，肿瘤细 胞分化程度与端粒酶的活性直接相关，这表明端粒酶与肿瘤细胞的恶性转化 及快速增殖可能存在密切的关系(Shay J.W.,Wright W.E.Telomerase  therapeutics for cancer:challenges and new directions[J].Nat.Rev.Drug Discov. 2006,5:577–584.)，因此恶性肿瘤与端粒酶的活性之间具有高度的相关性。

富含G的端粒DNA单链在K⁺、Na⁺等离子以及一些药物分子的存在下可 以通过G碱基之间的Hoogsteen环状氢键形成稳定的G-四链体结构(Hupper J. L.,Balasubramanian S.Prevalence of quadruplexes in the human genome[J]. Nucleic.Acids.Res.2005,33(9):2908–2916.)。G-四链体的形成可以阻止端粒酶 对端粒DNA序列的识别，从而抑制端粒酶的活性。端粒酶活性的抑制可使肿 瘤细胞端粒缩短直至细胞停止增殖，转入细胞凋亡过程，从而抑制肿瘤的发 展。因此这一发现使G-四链体成为端粒酶抑制剂作用的新靶点，对于能够诱 导形成或增强G-四链体稳定性的小分子化合物则很有可能对癌症的治疗具有 潜在的意义。

在已报道的研究工作中，X-射线衍射、表面等离子体子共振(SPR)、核 磁共振(NMR)、圆二色性(CD)、凝胶电泳等多种分析方法被用来研究G- 四链体。但是它们存在操作复杂，费时，成本较高等不足而使其较难实现高 通量的筛选。为了克服这些缺点，不少研究工作者试图发展不同的检测途径， 其中荧光光谱，特别是荧光共振能力转移途径，由于其优越的灵敏度以及信 号转化的多元化而成为有利的检测途径。虽然取得的一定的研究成果，但是 时常需要双标记，成本较高并且对染料有特殊的要求。鸟苷可以与多种荧光 染料例如荧光素,香豆素,芘,罗丹明等,发生光诱导电子转移(photoinduced  electron transfer,PIET)过程，结果表现为染料的荧光被猝灭。在此过程中,这 些染料以它们的电子激发态作为电子受体,而鸟苷则扮演电子给体的作用。相 对于FRET途径，其不需要标记特异性的染料，成本低廉，操作过程简单。 目前为止，利用G碱基作为猝灭剂的分析已广泛应用于检测特定蛋白、 DNA/RNA、金属离子和小分子、以及发生在寡核苷酸中点突变的检测，但是 还没有报道将其应用于高通量的药物筛选方面。

每一个筛选模型由于自身分析技术的局限性和操作影响，都会造成数据 波动误差。一般而言，系统越稳定，数据的波动性越小可靠性也越高。相反， 则系统的可靠性低，不适用高通量药物筛选。Z因子是一个用于判断筛选模型 稳定性的统计学参数，其公式为：