樱花品种“菊垂樱”的分子特异性标记引物及检测方法

摘要

本发明涉及一对特异性高的樱花品种“菊垂樱”的分子特异性标记引物，以及一种能对樱花品种“菊垂樱”进行快速鉴定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-AGCGGCCGCGTGGTATGGA-3′；下游引物：5′-AGCGGCCGCGTGTTGTAGAAG-3′。本发明分子特异性标记引物可对樱花品种“菊垂樱”进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别樱花品种所不能替代的分子手段。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及樱花品种“菊垂樱”的分子特异性标记引物，以及利用该 引物对樱花品种“菊垂樱”进行快速鉴定的方法。

(二)背景技术

樱花隶属于蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)，是世界著名的观赏 植物。目前已知樱花品种有300多个，因其株型优美、花色艳丽、整个花 期延续期长，在园林上有极大的应用价值。近年来，我国各地大规模种植 樱花并应用于公园、学校、街道、庭院等绿地中，成为早春主要观赏花木 之一。北京、武汉、青岛、上海等城市每年纷纷举办樱花节，樱花产业得 到迅猛发展，这对于建设美丽中国，促进农民增收，推进山区综合开发和 建设社会主义新农村，都具有十分重要的意义。

我国樱属植物资源丰富，分布广泛，且樱属植物表型具有较强可塑 性，种间杂交容易，品种数量众多，有些品种间性状差异较小，传统形态 分类很难快速、准确有效评价与区分。学术界对目前种植樱花品种的名称 和描述都很混乱，“同物异名”或“同名异物”现象较为严重，缺乏统一规范 的名称及科学系统的分类体系，不便于品种鉴定、推广、交流及新品种的 培育，因此亟需建立一个科学合理的樱花品种分类鉴定系统。

目前就全国范围内的樱花品种调查和分类还仅仅是通过传统的形态 学特征、过氧化物酶和酯酶同工酶技术、电镜扫描花粉粒和Q型聚类分 析等方法，这些方法尽管有用，但很难对樱花品种进行正确的鉴定和应用。 而近年来在植物分类界已广泛应用的DNA分子标记技术迄今尚未在樱花 品种分类、品种间亲缘关系及遗传多样性等研究上得以应用。因此，有必 要利用分子标记技术手段，对我国现有的樱花品种进行科学鉴别，不仅有 助于樱花品种分类鉴定系统的建立，也为樱属植物资源的进一步研究提供 分子依据。

目前国内引进大量的樱花品种，在北京、青岛、武汉、上海等各大公 园内广泛栽植，观赏价值极高，其中以晚樱品种居多，普遍具有花量大、 花色艳丽、花瓣多、花期长、抗性强、适应性广等特点。我们经过长期的 调查工作，发现20个晚樱品种包括红笠(Cerasus serrulata‘Benigasa’)、 红华(C.serrulata‘Kouka’)、一叶(C.serrulata‘Hisakura’)、福绿寿(C. serrulata‘Contorta’)、普贤象(C.serrulata‘Albo-rosea’)、松月(C.serrulata ‘Superba’)、郁金(C.serrulata‘Grandifora’)、红丰(Cerasus×sieboldii ‘Beni‐yutaka’)、御衣黄(C.serrulata‘Gioiko’)、关山(C.serrulata ‘Kanzan’)、大提灯(C.serrulata‘Ojochin’)、八重红枝垂(C.spachiana ‘Plena Rosea’)、市原虎尾(C.serrulata‘Albo Plena’)、咲耶姬(Cerasus ×yedoensis‘Sakuyahime’)、朱雀(C.serrulata‘Shujaku’)、杨贵妃(C. serrulata‘Mollis’)、雨情枝垂(C.spachiana‘Ujou‐shidare’)、菊垂樱 (C.serrulata‘Plena-pendula’)、平野妹背(C.serrulata‘Imose’)、旭山 樱(C.serrulata‘Asahiyama’)在园林中的应用极其广泛，但这些品种的“同 名异物”、“同物异名”现象也异常严重，从表型特征方面很难鉴别，给园 林植物应用、推广以及新品种选育带来很多困难，因此着力从分子水平上 开发出这些品种稳定、特异的DNA指纹标记才是实现樱花品种准确快速 鉴定的科学途径。

(三)发明内容

本发明目的是提供樱花品种“菊垂樱”的分子特异性标记引物，以及 一种能对樱花品种“菊垂樱”进行快速鉴定的方法。

本发明采用的技术方案是：

樱花品种“菊垂樱”的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：

上游引物：5′-AGCGGCCGCGTGGTATGGA-3′；

下游引物：5′-AGCGGCCGCGTGTTGTAGAAG-3′。

该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验获得樱花品种“菊垂 樱”的特异性DNA片段之后，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列 为基础设计特异性引物，以该特异性引物对樱花品种进行PCR扩增，仅 “菊垂樱”可获得1584bp大小的特异性片段，其他樱花品种均不能获得 特异性片段。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限于樱花品种 的鉴定(鉴定其是否为“菊垂樱”)，即待测样品仅限于樱花。

本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对樱花品种“菊垂 樱”进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测樱花品种叶片的基因组 DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩 增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现1584bp的特异DNA条 带，则待测樱花品种为樱花品种“菊垂樱”，反之则否；所述分子特异性 标记引物序列为：

上游引物：5′-AGCGGCCGCGTGGTATGGA-3′；

下游引物：5′-AGCGGCCGCGTGTTGTAGAAG-3′。

本发明方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及 反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

优选的，本发明所述PCR反应体系组成如下：

所述PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃变性40s，65℃退 火40s，72℃延伸2min，共35个循环；最后于72℃补平7min，终止温 度为4℃。

PCR Buffer终浓度为1×，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的 浓度与1×PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCR  Buffer。10×PCR Buffer成分为：100mM Tris-HCl(pH 8.5)、500mM KCl、 25mM MgCl₂和1.0％Triton-X-100，溶剂为ddH₂O。

具体的，所述方法如下：

(1)取待测樱花叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测樱花 叶片的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标 记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：

PCR扩增体系每25μL组成如下：

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性40s，65℃退火40s，72℃延伸2min， 共35个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；

(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μL 0.25％溴酚兰缓冲液混匀， 点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压 下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相， 若电泳结果出现1584bp的DNA条带，则待测樱花品种为“菊 垂樱”，反之则否。

本发明有益效果主要体现在：本发明分子特异性标记引物可对樱花品 种“菊垂樱”进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征 辨别樱花品种所不能替代的分子手段。

(四)附图说明

图1为对樱花品种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；编号 18为樱花品种“菊垂樱”，扩增出了分子量为1584bp的特异DNA条带； 其余编号为其它的樱花品种，未见有1500bp多大小的特异DNA条带产 生。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：

(1)樱花品种基因组DNA的提取：

取待测樱花品种幼嫩叶片0.01g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的 提取采用SDS-CTAB法，经多次抽提，来提取获得樱花品种的基因组DNA 粗提物。DNA粗提物再经Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化(博日Bioer， 杭州，中国)后，通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光 度计(GeneQuant Pro，GE Healthcare)来检测完整性、纯度及浓度。 OD260/OD280>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃ 冰箱贮藏备用。

(2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：

上游引物5′-AGCGGCCGCGTGGTATGGA-3′和下游引物5′- AGCGGCCGCGTGTTGTAGAAG-3′，由上海生物工程技术有限公司合成。

(4)PCR扩增：

PCR反应液组成：10×PCR Buffer 2.5μL，10mmol/L dNTPs 2.5μL， 25mmol/L MgCl₂2.5μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10mM特异引物对 各1μL，20ng/μL模板DNA 3μL，ddH₂O补足至25μL。

扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。扩增条件：95℃预变性3min； 95℃变性40s，65℃退火40s，72℃延伸2min，共35个循环；最后于72℃ 补平7min，终止温度为4℃。

(4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5μL，与1μL 0.25％溴酚 兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm 电压下电泳，电泳结束后，在含0.5μg/mL EB的水溶液中染色30分钟， 然后在上海培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。

按照上述方法，分别对20个樱花品种(编号1～20代表樱花品种依 次为：1、红笠(C.serrulata‘Benigasa’)、2、红华(C.serrulata‘Kouka’)、 3、一叶(C.serrulata‘Hisakura’)、4、福绿寿(C.serrulata‘Contorta’)、 5、普贤象(C.serrulata‘Albo-rosea’)、6、松月(C.serrulata‘Superba’)、 7、郁金(C.serrulata‘Grandifora’)、8、红丰(Cerasus×sieboldii ‘Beni‐yutaka’)、9、御衣黄(C.serrulata‘Gioiko’)、10、关山(C.serrulata ‘Kanzan’)、11、大提灯(C.serrulata‘Ojochin’)、12、八重红枝垂(C. spachiana‘Plena Rosea’)、13、市原虎尾(C.serrulata‘Albo Plena’)、 14、咲耶姬(Cerasus×yedoensis‘Sakuyahime’)、15、朱雀(C.serrulata ‘Shujaku’)、16、杨贵妃(C.serrulata‘Mollis’)、17、雨情枝垂(C.spachiana ‘Ujou‐shidare’)、18、菊垂樱(C.serrulata‘Plena-pendula’)、19、平 野妹背(C.serrulata‘Imose’)、20、旭山樱(C.serrulata‘Asahiyama’) 的PCR扩增图谱进行电泳检测，结果见图1。

其中仅从编号为18的樱花品种“菊垂樱”中扩增出了一条清晰明 亮、稳定的分子量约为1500bp多大小的特异DNA条带，而其余编号的 樱花品种，未见有1500bp多大小的特殊DNA条带产生，也未有其它非 目的条带产生，可见本发明开发出的分子特异性标记引物用于樱花品种 “菊垂樱”的鉴定，其稳定性、特异性非常高。