JAK1和JAK2的抑制剂

摘要

本发明提供了氨基吡唑化合物，所述化合物为3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，或其药学上可接受的盐，其抑制JAK1和JAK2，因此可用于治疗癌症。

说明书

本发明涉及医学领域。更具体地，本发明涉及氨基吡唑化合物或其药学上可接受的盐，其抑制JAK1和JAK2且可用于治疗癌症。

Janus激酶(JAK)家族是一组酪氨酸激酶，且包括JAK1、JAK2、JAK3、和TYK2。JAK家族通过JAK-STAT(信号转导与转录活化因子)通路将细胞因子介导的信号传递至细胞中。一种此类途径，JAK-STAT3，在许多类型的人癌症和癌细胞系中具有组成型活性。组成型活性的STAT3已经由于增加增殖、存活和侵袭而牵连于肿瘤细胞。

JAK3优先表达于淋巴细胞中；已经针对JAK3抑制剂报道了免疫抑制作用。鉴于JAK3抑制剂的免疫抑制活性，将针对用于癌症治疗中的JAK抑制剂寻求JAK1和JAK2的抑制和针对JAK3的选择性。

WO 2006/087530公开了作为酪氨酸受体激酶的抑制剂的某些吡唑化合物，并且进一步公开了所述化合物可用于治疗癌症。

仍然需要提供有效的可替代JAK1/2抑制剂用于治疗实体瘤。也仍然需要提供相对于JAK3对于JAK1和JAK2具有选择性的有效的JAK抑制剂。因此，本发明提供了JAK1和JAK2的有效抑制剂。本发明还提供了相对于JAK3对于JAK1和JAK2具有选择性的有效的JAK抑制剂。

本发明提供了化合物，所述化合物为3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，或其药学上可接受的盐。

作为一个具体实施方案，本发明提供了化合物，所述化合物为3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺。作为另一个具体实施方案，本发明提供了化合物，所述化合物为3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺二盐酸盐。

本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺二盐酸盐，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，或其药学上可接受的盐，额外包含一种或多种治疗剂。

本发明提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，或其药学上可接受的盐。本发明提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺。本发明提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺二盐酸盐。

本发明提供了3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，或其药学上可接受的盐，其用于治疗中。本发明提供了3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，或其药学上可接受的盐，其用于治疗癌症。本发明提供了用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，或其药学上可接受的盐。

本发明提供了3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途。本发明提供了3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗癌症的药物的用途。

本发明提供了结晶形式的3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺。本发明还提供了结晶形式的3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，其特征在于具有在16.11以及4.32、8.71、13.12、15.19 和18.86中的一个或多个存在(以2θ ± 0.2计)的特征峰的X射线粉末衍射图。

此外，本发明提供了如本文所述方法和用途的优选实施方案，其中癌症选自乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、头颈癌、肝细胞癌和结肠癌。

除非另有说明，在上文中和本发明的整体描述中，以下术语应当被理解成具有以下含义：

“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是本领域公认用于将生物活性剂递送至哺乳动物(例如，人)的介质。

“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机盐和有机盐。

“治疗有效量”或者“有效量”意指本发明化合物或其药学上可接受的盐、或者含有本发明化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物将引起研究人员、兽医、医生、或其他临床医生正在谋求的对组织、系统、动物、哺乳动物、或人的生物学或医学响应或者期望治疗效果的量。

术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”、“治疗(treating)”等意在包括减缓或逆转病症的发展。这些术语也包括缓解、减轻、减弱、排除、或者减缓病症或病况的一种或多种症状，即使该病症或病况实际上未被排除以及即使病症或病况的进展本身未被减慢或逆转。

本发明的化合物能够例如与多种无机酸和有机酸反应而形成药学上可接受的盐。此类药学上可接受的盐以及制备它们的常见方法在本领域是众所周知的。参见例如P. Stahl，等人, HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS:  PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge，等人, “Pharmaceutical Salts, “ Journal　of　Pharmaceutical　Sciences, Vol 66, No. 1, January 1977。

优选使用药学上可接受的载体、稀释剂、或赋形剂将本发明的化合物配制成药物组合物，并且通过各种途径施用。优选地，此类组合物是用于口服施用。此类药物组合物及其制备方法在本领域是众所周知的。参见例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A.Gennaro等人编著，第21版，Mack Publishing Co.，2005年)。

本发明化合物的实际施用量将由医师在相关情况下决定，所述相关情况包括待治疗的病况、所选择的施用途径，实际施用的一种或多种本发明化合物，个体患者的年龄、体重和响应，以及患者症状的严重性。每日剂量通常落到约0.1至约300 mg的范围内。在一些情况下，低于前述范围下限的剂量水平可能比足量更多，而在其他情况下仍然可能采用较大的剂量。剂量水平可以由本领域技术人员确定。

本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以通过本领域已知的各种程序以及以下实施例中所述的程序制备。每一描述的途径的具体合成步骤可以不同方式组合，以制备本发明的化合物或其药学上可接受的盐。

本领域普通技术人员通常可容易地获得试剂和起始原料。其他可通过有机化学和杂环化学的标准技术、类似于已知的结构相似活性化合物和前药合成的技术、以及下文中的实施例中所描述的程序(包括任何新程序)制备。本文中说明的化合物使用ACDLABS或Symyx Draw 3.2 来命名或编号。

实施例1的化合物命名为：3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺二盐酸盐；且也可以命名为3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-二盐酸盐；且其他名称可以用来明确鉴定实施例1的化合物。实施例2的化合物命名为：3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺；且也可以命名为：3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺，3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-；且其他名称可以用来明确鉴定实施例2的化合物。

如本文中所使用，以下术语具有所指定的含义：“DMEA”是指二甲基乙醇胺；“DMF”是指二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲基亚砜；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“EtOH”是指乙醇；“ee”是指对映体过量；“EDTA”是指乙二胺四乙酸；“GC/MS”是指气相色谱，随后质谱；“LC”是指液相色谱；“LC/MS” 是指液相色谱，随后质谱；“MeOH”是指甲醇；“MS”是指质谱；“NMR”是指核磁共振；“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水；“TLC”是指薄层色谱；“UV”是指紫外线；且“XRD”是指X射线衍射。

实施例1

3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺二盐酸盐

步骤1: 苄基-(6-氟茚满-1-亚基)-胺

将6-氟茚满-1-酮 (14.57 g, 97.04 mmol)和苄胺 (10.60 mL, 97.04 mmol)合并在甲苯 (75 mL)中。添加对甲苯磺酸一水合物 (0.923 g, 4.85 mmol)。连接回流冷凝器且经六小时在氮气下加热混合物至回流，然后在室温下搅拌14小时。用乙酸乙酯和水萃取混合物。用硫酸镁干燥所得有机物，过滤，且真空浓缩，以得到作为红色油状物的标题化合物(23.22 g, 100%)。。

步骤2: 苄基-(6-氟茚满-1-基)-胺

将苄基-(6-氟茚满-1-亚基)-胺 (23.22 g, 97.03 mmol)溶解于乙醇 (1200 mL)中。在氮气下将混合物冷却至0℃。将硼氢化钠 (11.01 g, 291.10 mmol)添加至混合物。一小时后，添加二氯甲烷 (150 mL)和水 (150 mL)。在氮气下搅拌14小时，且真空浓缩以去除乙醇。用二氯甲烷和饱和氯化钠水溶液萃取残余物。用硫酸镁干燥所得有机物，过滤，且真空浓缩，以得到作为红色油状物的标题化合物(22.12 g, 94%)。。

步骤3: 6-氟茚满-1-基胺

向高压烧瓶中添加乙醇 (100 mL)中10% 碳上钯 (1.44 g)。添加乙醇 (200 mL)中苄基-(6-氟茚满-1-基)-胺 (14.44 g, 59.84 mmol)的溶液。用氮气吹扫腔室三次，然后用氢气吹扫三次。在氢气(60 psi)下在50℃剧烈搅拌两小时。将混合物过滤通过Celite ? 521，且用甲醇洗涤固体。在真空下浓缩滤液，以得到作为浅棕色液体的标题化合物(9.14 g, 100%)。。

步骤4: 6-氯-N-(6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基)-3-硝基吡啶-2-胺

将6-氟茚满-1-基胺 (8.50 g, 56.22 mmol)溶解在甲醇 (200 mL)和三乙胺 (8.62 mL, 61.84 mmol)中。添加2,6-二氯-3-硝基吡啶 (10.85 g, 56.22 mmol)，且在氮气下搅拌14小时。过滤反应混合物，且用甲醇和己烷洗涤固体，以得到作为黄色固体的标题化合物(9.00 g, 52%)。。

步骤5: N2-(6-氟茚满-1-基)-N6-(5-甲基-2H-吡唑-3-基)-3-硝基吡啶-2,6-二胺

将6-氯-N-(6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基)-3-硝基吡啶-2-胺 (9.00 g, 29.34 mmol)和3-氨基-5-甲基吡唑 (4.56 g, 46.95 mmol)合并在二甲基亚砜 (60 mL)中。添加N,N-二异丙基乙基胺 (8.18 mL, 46.95 mmol)，且在120℃在氮气下加热反应物90分钟。将反应物倒入冰水(200 mL)，且搅拌20分钟，然后过滤。将获得的固体悬浮在二氯甲烷和甲醇的混合物中，且在40℃搅拌20分钟。过滤混合物，以得到作为黄色固体的标题化合物(6.03 g, 56%)。。

步骤6: 3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺

将N2-(6-氟茚满-1-基)-N6-(5-甲基-2H-吡唑-3-基)-3-硝基吡啶-2,6-二胺 (0.571 g, 1.55 mmol)溶解在甲醇 (10 mL)中。添加铟 (0.890 g, 7.75 mmol)和盐酸 (12N, 0.65 mL, 7.75 mmol)。将混合物在氮气下搅拌一小时。将反应混合物过滤通过Celite ? 521，且用甲醇洗涤固体。在真空下浓缩滤液，以得到粗N2-(6-氟茚满-1-基)-N6-(5-甲基-2H-吡唑-3-基)-吡啶-2,3,6-三胺二盐酸盐。

将N2-(6-氟茚满-1-基)-N6-(5-甲基-2H-吡唑-3-基)-吡啶-2,3,6-三胺二盐酸盐溶解在乙酸 (5 mL)和原甲酸三甲酯 (0.68 mL, 6.20 mmol)中。在氮气下搅拌30分钟。在真空下浓缩且通过反相色谱纯化，用乙腈中0.03% 盐酸水溶液的梯度洗脱，以得到标题化合物的外消旋物(0.124 g，19%，2步)。。用手性色谱条件分离外消旋物以得到标题化合物 (70 mg, 11%。对映异构体1 (首先在3.7 min洗脱) > 99% ee, 100% MeOH, 0.2% DMEA, 1.0 mL/min, 4.6 x 150 mm, CHIRALPAK? AD-H)。

步骤7: 3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺二盐酸盐

将3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺 (0.070 g, 0.201 mmol)溶解在二氯甲烷 (5 mL)中。添加1,4-二氧杂环己烷 (0.100 mL, 0.400 mmol)中的4 M氯化氢。将溶液搅拌14小时，然后在真空下浓缩至干燥。溶解在甲醇中，且在真空下浓缩至干燥三次，以得到标题化合物(0.067 g, 79%)。。

实施例2

3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺

步骤1: (1S)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-醇

装备具有高架搅拌、热电偶、1L和5L加料漏斗、冷却浴和氮气入口的22L四颈圆底烧瓶。在氮气吹扫下，用6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-酮(500 g, 3.33 mol)和甲苯 (5 L)加入烧瓶。将所得混合物搅拌5分钟，以溶解所有固体，然后使用冰/丙酮浴冷却至-10℃。用R-(-)-2-甲基-CBS-噁唑硼烷(甲苯中1M, 666 mL, 0.666 mol)加入1 L加料漏斗。将溶液添加至反应混合物，然后搅拌5分钟。用甲苯(5 L)加入5 L加料漏斗，随后加入硼烷-甲基硫醚络合物 (310.1 mL, 3.33 mol)。涡旋漏斗以混合试剂后，经3小时将该溶液逐滴添加至反应混合物，保持釜温度低于-5℃。15分钟后，通过TLC监测反应样品(用50 μL MeOH猝灭25 μL反应混合物; 75/25 己烷/EtOAc，UV)。该分析显示无起始材料剩余。使混合物在冷水浴中搅拌过夜。

将反应混合物冷却至10℃，且将甲醇 (0.5 L)加入加料漏斗，然后经30分钟逐滴添加。出气在MeOH猝灭开始时是明显的，但在添加~1/3后消退。搅拌所得混合物15分钟，然后用饱和NaCl (2.5 L)稀释。搅拌20分钟后，将混合物过滤通过Hyflo Super Cel?的垫，且用甲苯(2 L)冲洗垫。

将滤液转移至底部出口烧瓶，且分离各层。用去离子水(2.5 L)、1N HCl (2.5 L)、饱和NaHCO₃ (2.5 L)和饱和NaCl (2.5 L)洗涤有机物。在Darco (0.5 kg)存在的情况下经Na₂SO₄ (1 kg)干燥0.5小时后，将混合物过滤通过用Kieselgel 60二氧化硅(0.5 kg)覆盖的Hyflo Super Cel?。用甲苯(1 L)冲洗垫，且在真空下浓缩滤液。用先前制备的固体接种所得油状物以诱导结晶。结晶提供了作为浅黄色固体的标题化合物(500g, 98.7%, 98.1% ee)。

步骤2: (1R)-1-叠氮基-6-氟-2,3-二氢-1H-茚

装备具有高架搅拌、热电偶、氮气入口、1L加料漏斗和冷却浴的22 L 3颈烧瓶。用(1S)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-醇 (700 g, 4.6 mol)和甲苯 (7 L)加入烧瓶。将所得溶液冷却至0-5℃，且以一份添加叠氮化磷酸二苯酯 (1444 g, 5.1 mol)。15分钟后，将1,8-二氮杂双环[5.4.0]-十一碳-7-烯 (847 mL, 5.5 mol)加入加料漏斗，然后经2小时逐滴添加至反应容器，保持釜温度低于10℃。去除浴，且使反应混合物在室温搅拌过夜。

22小时后，TLC (80/20 己烷/EtOAc, UV)和GC/MS表明反应完全。经15分钟添加去离子水(3.5 L)且搅拌15分钟。将混合物转移至底部出口烧瓶，且分离各层。用去离子水(3.5 L)，然后0.5 M HCl (3.5 L)，和最后去离子水(3.5 L)洗涤有机物。合并三次含水洗液且用甲苯(3.5 L)反萃取。合并有机物，且在Darco (0.5 kg)存在的情况下经Na₂SO₄ (1 kg)干燥。搅拌15分钟后，将混合物过滤通过用Hyflo Super Cel?的垫覆盖的GFF纸。用甲苯(1 L)冲洗垫，将滤液转移至22L Büchi烧瓶，且在真空下浓缩至~ 4个体积(2.8 L)。

设置大漏斗用于硅胶塞色谱，且加入Kieselgel 60二氧化硅(6 Kg)。用沙(1 Kg)覆盖二氧化硅，且用甲苯润湿。在轻微真空下将2.8 L含有粗产物的反应溶液倒至漏斗上。用甲苯(4 x 4L)洗脱产物。将滤液转移至配衡烧瓶，且在真空下浓缩(40℃浴)至约3 L (2788g甲苯溶液)。基于小样品重量分析(0.467g甲苯溶液中0.123g标题化合物)，存在753.5g标题化合物(甲苯中7782 g溶液，90.2％产率)。将甲苯溶液转移至加仑壶，且储存在冰箱中用于随后步骤中使用。

步骤3: (1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-胺

用5% Pd/C (164 mL 甲苯中8.2g)和三分之一步骤2中获得的(1R)-1-叠氮基-6-氟-2,3-二氢-1H-茚 (2594 g乙醇溶液中163.9 g叠氮化物)加入3加仑氢气罐T-85。用氮气吹扫该罐，然后用氢气(~50 psi)加压。搅拌混合物30分钟。然后放空该罐，用氢气(~50 psi)重新加入，且再搅拌30分钟。TLC和GC/MS显示反应完成。将反应混合物转移至大玻璃瓶(carboy)，且用3A-EtOH冲洗罐。在相同规模重复反应两次。合并三次反应的溶液。在减压下浓缩至约8个体积。通过GFF纸过滤混合物以去除催化剂，且用3A-EtOH (~ 200 mL)冲洗垫。基于小样品的分析，以92％产率(386 g)在3A-EtOH溶液中获得标题化合物。

步骤4: 6-氯-N-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-3-硝基吡啶-2-胺

用氮气吹扫12 L 3颈烧瓶，然后装配热电偶、加热套和冷凝器。将(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-胺 (386 g, 2.55 mol)加入烧瓶，添加3A-EtOH (3.9 L)、二异丙基乙基胺 (1.34 L, 7.68 mol)和2,6-二氯-3-硝基吡啶 (643 g, 3.07 mol)。将反应混合物在室温搅拌八小时，然后加热至70℃持续12小时。经1.25小时将反应混合物冷却至8℃，然后过滤至聚丙烯垫上。用3A-EtOH (760 mL)洗涤固体，转移至配衡皿，且在真空烘箱(45℃)中进一步干燥，以得到作为橙色固体的标题化合物(786 g, 71%, 98.0 % ee)。。

步骤5: N2-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-3-硝基吡啶-2,6-二胺

装备具有热电偶、冷凝器、顶部搅拌器、氮气入口和加热套的3颈烧瓶(22 L)。向烧瓶中加入6-氯-N-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-3-硝基吡啶-2-胺 (600 g, 1.95 mol)、5-甲基-1H-吡唑-3-胺 (208.31 g, 2.14 mol)、二甲基亚砜 (6.0 L)和二异丙基乙基胺 (680.11 mL, 3.90 mol)。将溶液在70℃搅拌20小时。将混合物冷却至室温，且将其用MeOH (6.0 L)稀释。经一小时将去离子水(2.1 L)添加至溶液，以得到橙色悬浮液。将悬浮液搅拌一小时，然后过滤通过聚丙烯。用去离子水(12 L)洗涤滤饼，将固体转移至配衡皿，且真空干燥(50℃)至恒重，以提供标题化合物(647 g, 90%)。。

步骤6: 3-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-胺

将N2-[(1R)-6-氟-2,3-二氢-1H-茚-1-基]-N6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-3-硝基吡啶-2,6-二胺(622 g, 1.69 mol)添加至10 L圆底烧瓶中，且将其用DMF (5 L)处理。涡旋烧瓶内容物，直到所有固体都溶解。在涡旋的情况下将原甲酸三甲酯 (1.85 L, 16.9 mol)和对甲苯磺酸吡啶鎓(42.4 g, 0.169 mol)加入烧瓶。在氮气吹扫下用DMF (100 mL)中作为稠浆的5% Pd/C (93.3 g, 15重量％负荷)加入3加仑氢气罐。将上述混合物添加至氢气罐，且用氮气吹扫几次，然后在氢气(~50 psi)下加入罐。将混合物加热至60℃，且使其搅拌过夜。在约22小时，放空反应器，取样，且通过TLC和LC/MS检查，这两者都指示反应完成。将混合物过滤通过Hyflo Super Cel?的垫，且用EtOAc(1 L)冲洗罐和垫。将滤液转移至Büchi烧瓶，用去离子水(622 mL)稀释，且真空浓缩(50℃浴)，以去除过量原甲酸三甲酯。将DMF溶液转移至50 L底部出口烧瓶，且用EtOAc (12.4 L)稀释。用饱和LiCl溶液(3 x 6.22 L)洗涤溶液。合并含水洗液且用EtOAc (4 x 3.11 L)反萃取。合并有机物，且用饱和LiCl (2 x 1 L)洗涤，经Na₂SO₄干燥，且过滤通过GFF纸。真空浓缩滤液(45℃浴)，以得到作为绿色固体的粗产物(609 g, 103.5%)。

装备具有热电偶、冷凝器、顶部搅拌器、氮气入口和加热套的3颈烧瓶(22 L)。向烧瓶中加入上述直接制备的粗材料(598.5 g, 1.7 mol)和乙腈(12 L)，且将所得混合物加热至回流。获得完全溶液之后，终止热源且使溶液自我冷却。在56℃用来自上面的绿色固体接种溶液，且结晶立即开始；基本上如上获得初始晶种材料。用冰浴进一步冷却悬浮液，搅拌过夜，且过滤。用乙腈(1.2 L)洗涤产物滤饼，将固体转移至配衡皿，且真空干燥(50℃)至恒重，以提供标题化合物(349.54 g, 58.4%)。

X-射线粉末衍射

结晶固体的XRD图在配备有CuKa源(λ = 1.54060 ?)和Vantec检测器在35 kV和50 mA下操作的Bruker D4 Endeavor X-射线粉末衍射仪上获得。在4和40°(以2θ计)之间，用0.0087°的步长(以2θ计)和0.5秒/步的扫描速率，和0.6mm散度，5.28mm固定的反散射和9.5mm检测器狭缝扫描该样品。将干燥粉末填装在石英样品架上，并使用载玻片获得光滑的表面。在结晶学领域中众所周知的是，对于任何给定晶形，衍射峰的相对强度可能随因素诸如结晶形态学和习性引起的优选取向而不同。当存在优选取向的效应时，峰强度改变，但多晶形物的特征峰位置不变。此外，在结晶学领域中也众所周知的是，对于任何给定晶形，角峰位置可能稍微改变。例如，由于分析样品时的温度或湿度的变化、样品移位或内部标准的存在或不存在，峰位置可以移动。在本情况下，±0.2 (以2θ计)的峰位置变化将考虑这些潜在变化而不妨碍明确鉴定指定的晶形。可以基于特征峰(通常为较显著的峰)的任何独特的组合(以° 2θ为单位)确认晶形。在室温和相对湿度下收集的晶形衍射图基于在8.85和26.77度(2-θ)的NIST 675标准峰进行调整。

因此，实施例2的制备样品通过使用CuKa照射而具有如下表1中所述衍射峰(2-θ值)的XRD图表征。具体而言，该图含有在16.11的峰和一个或多个选自4.32、8.71、13.12、15.19和18.86的峰，和0.2度的衍射角的公差。

表 1：实施例2的X-射线粉末衍射峰。

　JAK1/2/3体外酶测定法

JAK LanthaScreen? 激酶测定法(Life Technologies, #PV4844)用于测定针对JAK1、JAK2和JAK3激酶的化合物IC₅₀值。该激酶测定是时间分辨的荧光共振能量转移(TR-FRET)测定形式，其使用长寿命铽(Tb)标记的抗体作为供体种类和绿色荧光蛋白-信号转导与转录活化因子(GFP-STAT1)作为受体种类。

TR-FRET比率用于监测JAK1、JAK2或JAK3活性，其中GFP-STAT1的磷酸化的增加导致TR-FRET比率的增加。在浅黑色384孔Proxiplate (PerkinElmer, #6008260)中使用12.5微升反应体积进行激酶反应。添加试剂以获得以下最终反应条件：50毫摩尔N-2-羟乙基哌嗪-N-2'-乙磺酸(HEPES) pH 7.3，1.76毫摩尔Triton^TM X-100，20.0微摩尔用于JAK1测定的腺苷三磷酸(ATP)(5微摩尔ATP用于JAK2测定，或2微摩尔ATP用于JAK3测定)，10.0毫摩尔氯化镁(MgCl₂)，1毫摩尔乙二醇四乙酸(EGTA)，0.01% Brij-35，0.05微摩尔绿色荧光蛋白-信号转导与转录活化因子(GFP-STAT1)，14纳摩尔JAK1酶(或1.0纳摩尔JAK2酶，或2.5纳摩尔JAK3酶)和4％二甲基亚砜和实施例1化合物的系列稀释液(从20,000纳摩尔1:3稀释至1纳摩尔)。添加ATP/GFP-STAT1之后，以1000转/分钟(RPM)离心测定板1分钟。使板在室温孵育60分钟，然后通过添加12.5微升终止缓冲液终止，所述终止缓冲液含有20毫摩尔乙二胺四乙酸(EDTA)，2纳摩尔Tb-抗-pSTAT1[pTyr701]，0.67毫摩尔三(羟甲基)氨基乙烷盐酸盐(Trizma?) pH 7.5，0.02％叠氮化钠和0.01％壬基苯基聚乙二醇(Nonidet ? P40)。在室温孵育90分钟，且用340 nm波长激发滤光片和520 nm和495 nm波长的发射滤光片在EnVision读板器(PerkinElmer, #2104-0010)中读数。从520纳米测量的针对GFP-STAT1的发射波长相比于针对Tb-抗-pSTAT1[pTyr701]的495纳米的发射推导出比率。使用百分比抑制数据推导化合物的IC₅₀值，这从反应数据相对于板上对照(活性酶相比于2.0微摩尔对照抑制的酶)计算。使用ActivityBase 4.0将百分比抑制和十点化合物浓度数据拟合至四参数逻辑方程。

基本上如上所述在该测定中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物被确定为针对JAK1具有1.7 nM +/- 0.8 nM的IC₅₀ (n=3)，针对JAK2具有1.7 nM的IC₅₀ (n=1)，且针对JAK3具有8.0 nM +/- 5.9 nM的IC₅₀ (n=6)。实施例1的化合物在酶测定中表现出针对JAK1和JAK2相比于JAK3的大于四倍的选择性。这些结果显示，实施例1的化合物是JAK1和JAK2的有效体外抑制剂，并且针对JAK1和JAK2相比于JAK3在体外是选择性的。

基于细胞的测定 - Cellomics ArrayScan? HCS

JAK2 EPO-TF1/pSTAT5基于细胞的测定模拟红系祖细胞中JAK2-STAT5的组成型活化，其驱动红血细胞的过度产生，这是真性红细胞增多症(PV)的标记。因此，EPO-TF1/pSTAT5基于细胞的测定使得能够在体外评价JAK化合物的JAK2细胞活性。

将TF-1(人红系白血病)细胞维持在具有10％胎牛血清(FBS)，0.075％碳酸氢钠，1 mM丙酮酸钠，1×抗生素/抗真菌剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)和0.45％葡萄糖的RPMI 1640中(RPMI-1640由Roswell Park Memorial Institute的Moore等人开发。该制剂基于利用碳酸氢盐缓冲系统和氨基酸和维生素的量的变化的RPMI-1630培养基系列)。将培养基用GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)以2 ng/mL的最终浓度补充。将细胞保持在37℃与5% CO₂。将细胞在无血清培养基中饥饿以去除内源生长因子。将TF-1细胞计数并收集细胞以便以2 x10⁵个细胞/孔的密度接种2x10⁷个细胞/96孔板。将细胞用未补充的RPMI 1640(具有0.075％碳酸氢钠、1 mM丙酮酸钠、1x抗生素/抗真菌剂和0.45％葡萄糖的RPMI 1640)冲洗两次，然后在具有0.6% FBS的RPMI中以5x10⁵个细胞/mL的最终浓度悬浮细胞。将稀释的细胞添加回组织培养瓶中，并在37℃下孵育过夜。将试验化合物以10 mM浓度制备在100% DMSO中。将化合物以10点-200x浓度-响应范围(4 mM- 200 nM)用100% DMSO 1:3系列稀释。在分开的96深孔板中，将2.5 μL 200x化合物溶液添加至125 μL具有10% FBS的完全RPMI 1640培养基，用于4x浓度化合物板。

为了进行测定，收集血清饥饿的细胞且用未补充的RPMI 1640培养基洗涤一次。将细胞悬浮在10% FBS完全RPMI培养基，最终浓度为8x10⁵个细胞/mL。将250 μl稀释的细胞(2x10⁵个细胞)等分试样添加至4x浓度化合物板中的各孔中。将细胞通过涡旋混合，且将板在37℃水浴中孵育10分钟。通过使用预热的10％ FBS完全RPMI 1640培养基制备6.4单位/mL的促红细胞生成素(EPO)的新鲜4x工作溶液。用化合物处理细胞10分钟之后，将125 μL EPO培养基添加至各孔中，且将板涡旋。将细胞在37℃水浴中孵育20分钟，且在孵育时间过程中每5分钟混合。最后的10点浓度响应范围为20 μM-1 nM，DMSO的最终浓度为0.5％，且EPO的最终浓度为1.6 U/mL。细胞处理后，将500 μl 1％甲醛溶液(用磷酸盐缓冲盐水(PBS)新鲜制备且在37℃保温)添加至各孔。江板密封且反转8-10次以混合。将板置于37℃水浴中10分钟。孵育后，将细胞板在室温(RT)以1200 rpm离心5分钟。吸出上清液，留下100 μL细胞(2x10⁵个细胞)。将细胞涡旋且通过重复离心步骤用800 μL PBS洗涤两次，且在最终洗涤后留下含有~2 x105个细胞的100 μL。将800 μL冷90％甲醇的等分试样添加至细胞中，且置于-20℃过夜。将板离心且去除甲醇。细胞用FACS缓冲液(具有5％ FBS和0.02％叠氮化钠的PBS)洗涤。将200 μL荧光活化细胞分选(FACS)缓冲液中小鼠抗pSTAT5 (pY694) Alexa Fluor 647?的1至10倍稀释液的等分试样添加至细胞。将细胞充分混合且在黑暗中在室温孵育2小时。将细胞用PBS洗涤一次，且留下100 μL细胞。用PBS 制备2 μg/mL Hoechst (Acros Organics, Morris Plains, NJ)的工作溶液。将200 μL的等分试样添加至各孔且将细胞在黑暗中在室温孵育10分钟。将细胞用PBS洗涤，且将50 μL Cytofix (BD Biosciences, San Jose, CA)添加至细胞。将细胞转移至96孔黑色组织培养板且密封。将板离心下来。收集平均荧光强度数据且使用Cellomics Arrayscan? VTi分析。将化合物处理与媒介物比较以测定百分比抑制数据。用ActivityBase 4.0使用4参数逻辑曲线拟合分析计算相对IC₅₀。

基本上如上所述在该测定中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物以0.035 μM +/- 0.013 μM (n=65)的IC₅₀抑制JAK2。这些结果显示，在JAK2 EPO-TF l/pSTAT5基于细胞的测定中，实施例1的化合物是JAK2的有效抑制剂。

基于细胞的测定法– Cellomics ArrayScan? HCS

IL-2激活自然杀伤(NK)细胞中的JAK3通路，以驱动NK和CD8淋巴细胞增殖。因此， IL-2刺激的NK92 /pSTAT5基于细胞的测定使得能够在体外评价JAK化合物的JAK3细胞活性。

将NK-92(自然杀伤)细胞(ATCC, Manassas, VA)维持在具有15％胎牛血清、15％马血清和1x抗生素/抗霉菌素的最低必需培养基(MEM) α (Invitrogen, Carlsbad, CA)中。将培养基用IL-2 (R&D systems, Minneapolis, MN)补充，最终浓度为4 ng/mL。将细胞保持在37℃与5% CO₂。将细胞在无血清培养基中饥饿以去除内源生长因子。将NK-92细胞计数并收集以便以2 x10⁵个细胞/孔的密度接种2x10⁷个细胞/96孔板。将细胞用未补充的MEM α (MEM Alpha)冲洗两次，然后在具有0.6%血清(0.3% FBS, 0.3%马血清)的MEM α中以8x10⁵个细胞/mL的最终浓度悬浮细胞。将稀释的细胞添加回组织培养瓶中，并在37℃下孵育过夜。将试验化合物以10 mM浓度制备在100% DMSO中。将化合物以10点-200x浓度-响应范围(4 mM- 200 nM)用100% DMSO 1:3系列稀释。在分开的96深孔板中，将2.5 μL 200x化合物溶液添加至125 μL 10% FBS完全RPMI 1640培养基，用于4x浓度化合物板。为了进行测定，收集血清饥饿的细胞且用未补充的RPMI 1640培养基洗涤一次。将细胞悬浮在10% FBS完全RPMI 1640培养基，最终浓度为8x10⁵个细胞/mL。将250 μl稀释的细胞(2x10⁵个细胞)等分试样添加至4x浓度化合物板中的各孔中。将细胞通过涡旋混合，且将板在37℃水浴中孵育10分钟。使用预热的10％ FBS完全RPMI培养基制备2 ng/mL的IL-2的新鲜4x工作溶液。用化合物处理细胞10分钟之后，将125 μL IL-2培养基添加至各孔中。通过涡旋混合细胞。将细胞在37℃水浴中孵育20分钟，且在孵育时间过程中每5分钟混合。最后的10点浓度响应范围为20 μM-1 nM，DMSO的最终浓度为0.5％，且IL-2的最终浓度为0.5 ng/mL。细胞处理后，将500 μl 1％甲醛溶液(用磷酸盐缓冲盐水(PBS)新鲜制备且在37℃保温)添加至各孔。将板密封且反转8-10次以混合。将板置于37℃水浴中10分钟。孵育后，将细胞板在RT以1200 rpm离心5分钟。吸出上清液，留下100 μL细胞(2x10⁵个细胞)。将细胞涡旋且通过重复离心步骤用800 μL PBS洗涤两次，且在最终洗涤后留下含有~2 x10⁵个细胞的100 μL。将800 μl冷90％甲醇的等分试样添加至细胞中，且置于-20℃过夜。将板离心且去除甲醇。细胞用FACS缓冲液(具有5％ FBS和0.02％叠氮化钠的PBS)洗涤。将200 μL荧光活化细胞分选(FACS)缓冲液中小鼠抗pSTAT5 (pY694) Alexa Fluor 647?的1至10倍稀释液的等分试样添加至细胞。将细胞充分混合且在黑暗中在室温孵育2小时。将细胞用PBS洗涤一次，且留下100 μL细胞。用PBS 制备2 μg/mL Hoechst (Acros Organics, Morris Plains, NJ)的工作溶液。将200 μL的等分试样添加至各孔且将细胞在黑暗中在室温孵育10分钟。将细胞用PBS洗涤，且将50 μL Cytofix^? (BD Biosciences, San Jose, CA)添加至细胞。将细胞转移至96孔黑色组织培养板且密封。将板离心下来。收集平均荧光强度数据且使用Cellomics Arrayscan? VTi分析。将化合物处理与媒介物比较以测定百分比抑制数据。用ActivityBase 4.0使用4参数逻辑曲线拟合分析计算相对IC₅₀。

基本上如上所述在该测定中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物以0.228 μM +/- 0.076 μM (n=61)的IC₅₀抑制JAK3。从上述两种基于细胞的测定的结果来看，JAK3/ JAK2 IC₅₀的比率被测定为超过6倍，这表明，在JAK2 EPO-TF l/pSTAT5和JAK3 IL-2-NK-92/pSTAT5基于细胞的测定中，实施例1的化合物针对JAK2相比于JAK3 是选择性的。

基于细胞的测定

DS1-AlphaScreen-pSTAT3-基于细胞的测定用于检查化合物阻断IL6刺激的STAT3通路的效力。JAK-STAT3通路在许多类型的癌症中具有组成型活性，且由于增加增殖、存活和侵袭而牵连于肿瘤细胞。将DS1细胞(ATCC)培养在具有10% FBS的RPMI完全培养基中，然后采用且在37℃在95％湿度和5 % CO₂气氛下生长在补充10% FBS的DMEM/高改良培养基中。将DS1细胞以4x10⁴个细胞/孔的密度铺板在96孔板中，且在37℃在无血清培养基中培养3小时，随后用单独媒介物 (DMSO)或0-20 μM的最终浓度范围的试验化合物预处理10分钟。然后将IL6 (R&D System, 206-IL)以10 ng/ml最终浓度添加至细胞培养物，将其在37℃再继续30分钟。最后，将细胞用5Xα裂解缓冲液裂解且转移至填充用于pSTAT3检测(#TGRS3SHV100)的反应混合物(TGR Biosciences, South Australia, Australia, #TGRS3S10K)的384孔板(PerkinElmer, #6008280)。将板密封且在室温孵育2小时，且通过使用Envision06读板器(TGR Biosciences, South Australia, Australia)测量pSTAT3。数据用ActivityBase 4.0进行分析。

基本上如上所述在该测定中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物以0.066 +/-0.023 μM的IC50抑制IL-6-STAT3信号传导。这些结果表明，实施例1的化合物在DS1-AlphaScreen-pSTAT3-基于细胞的测定中抑制IL-6刺激的JAK-STAT3通路。

基于细胞的测定

Mia-Paca2-MSD (MesoScale Diagnostics)-pSTAT3基于细胞的测定用于检查化合物阻断胰腺癌细胞中STAT3磷酸化的效力。使Mia-paca2细胞(ATCC)在5% CO₂的培养箱中在37℃在补充10％ FBS的DMEM完全培养基中生长。然后将细胞收集，计数，且以4x10⁴个细胞/孔铺板在96孔板中，且在37℃与5% CO₂培养过夜。从细胞中去除培养基且用含有单独媒介物 (DMSO)或0-20 μM范围(1:3稀释(10种稀释液))的2X最终浓度的化合物的无血清培养基替代。再孵育5小时后，将100微升10天MIA PACA2培养上清液(条件培养基)添加至所述板以激活STAT3。在供给5% CO₂的培养箱中在37℃再处理细胞20分钟。刺激后，如上手工去除所有培养基，且将细胞在50微升冰冷的含有1X HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物((Thermo Scientific, 78441)的1X MSD裂解缓冲液(MesoScale Diagnostics, K150DID-2)中裂解。将96孔板密封，然后在室温在定轨摇床上混合2分钟，然后立即冷冻在-80℃过夜。pSTAT3如下通过使用用于磷酸化-STAT-3 (Tyr 705)的MA6000 MSD全细胞裂解物试剂盒(MesoScale Diagnostics, # K150DID-2)检测，将板在摇动的情况下在室温用封闭缓冲液封闭1-2小时，然后用洗涤缓冲液洗涤4次。将25 μl蛋白裂解物添加至每个孔，且将板再孵育1-2小时。在用洗涤缓冲液将板洗涤4次后，用MSD读板器6000阅读板。使用Graph Pad程序分析数据。

基本上如上所述在该测定中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物以12 nM的IC₅₀抑制STAT3的磷酸化。这些结果表明，实施例1的化合物在胰腺癌细胞系中抑制JAK-STAT3通路。

基于细胞的测定

SUM-159-MSD-pSTAT3基于细胞的测定用于检查化合物阻断乳腺癌细胞中STAT3磷酸化的效力。使Sum-159细胞(Asterand)生长并维持在具有5% FBS、胰岛素(5微克/ml)和氢化可的松(1 μg/ml)的HAM's F-12培养基(Gibco 11765-054)中。将细胞收集，计数，且以4x10⁴个细胞/孔铺板在96孔板中，且在37℃与5% CO₂培养过夜。然后去除培养基且用含有单独媒介物 (DMSO)或0-20 μM范围(1:3稀释(10个浓度点))的2X最终浓度的化合物的F-12-培养基替代。再孵育5小时后，去除培养基，且将细胞用100微升2X人IL-6 (20 ng/mL稀释在F-12完全培养基中)处理，且在37℃在5% CO₂中再孵育20分钟。刺激后，如上手工去除所有培养基，且将细胞在50微升冰冷的含有1X HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的1X MSD裂解缓冲液中裂解。将96孔板密封，然后在室温在定轨摇床上混合2分钟，然后立即冷冻在-80℃过夜。pSTAT3如上通过使用用于磷酸-STAT-3 (Tyr 705)的MA6000 MSD全细胞裂解物试剂盒(Meso Scale Diagnostics, # K150DID-2)检测。通过使用MSD读板器阅读板。使用Graph Pad程序分析数据。

基本上如上所述在该测定中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物以21 nM的IC₅₀抑制STAT3的磷酸化。这些结果显示，实施例1的化合物在乳腺癌细胞系中抑制JAK-STAT3通路。