利用谷氨酸衍生物和羟基苯胺或羟基被保护的羟基苯胺合成拉马琳以及拉马琳前体的方法

摘要

本发明公开了一种合成拉马琳的方法，尤其是一种包括利用氯甲酸烷基酯制备的谷氨酸衍生物与从(保护的或未保护的)羟基苯胺制备的肼盐化合物反应。该合成方法使得即使不使用诸如DMF这样的剧毒溶剂，也可以以稳定的产率简单地合成具有优异的抗氧化活性和抗炎活性的拉马琳。此外，该方法具成本竞争力，且以高效率提供拉马琳，从而使拉马琳能够大量生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种合成拉马琳(ramalin)的方法。更具体地，本发明涉及 一种通过利用氯甲酸烷基酯制备的谷氨酸衍生物与羟基苯胺或受保护的羟基 苯胺反应来合成拉马琳的方法。

背景技术

地衣类似于非开花植物，是由以共生关系一起生长的真菌(地衣共生菌) 和光合作用伙伴(共生光合生物)组成的复合有机体。共生光合生物通常为 藻类和蓝藻菌之一或两者。在地衣中，真菌包含叶状体或典型代谢产物 (Ahmadjin V.,The lichen symbiosis,Wiley,New York,pp.1-6,1993)。由于难以 从自然中收集足够量的地衣，且尚未对它们建立大量生产，因此与高等植物 相比，对它们的研究不能令人满意。

然而，对地衣的活性研究正在进行中，且在对地衣的组织培养、大量培 养和生化分析方面已经有了改进(Behera,B.C.et al.,Lebensm.Wiss.Technol., 39:805,2006)。已从地衣中分离出多种具有诸如细胞毒性、杀菌活性、抗菌 活性和抗氧化活性的生物活性的化合物，例如脂肪酸、缩酚酸和缩酚酸环醚、 二苯并呋喃、二萜类、蒽醌、萘醌、地衣酸、普尔文酸、呫吨酮(xanthone) 和环二硫哌嗪二酮(epidithiopiperazinedione)(Muller,K.,Appl.Microbiol. Biotechnol.,56:9-16,2001)。

拉马琳(Ramalin)a terebrata是一种在南极洲King George岛上野生生 长而形成菌落的地衣，并且可从岛上的各个地方容易地收集。先前，本发明 人研究了南极洲地衣拉马琳a terebrata，并从中成功分离了一种具有优异的 抗氧化活性的新化合物，命名为拉马琳(韩国专利公开No. 10-2010-0052130)。此外，据报道，拉马琳表现出优异的抗炎活性(韩国专 利申请No.10-2010-005255)。

对拉马琳优异的抗氧化活性和抗炎活性的发现，增加了大量生产拉马琳 的必要性。然而，由于南极洲地衣的低生长速率特性、从自然中大量收集的 困难以及在拉马琳a terebrata中非常小的量，因而利用甲醇从拉马琳a  terebrata中分离拉马琳的传统方法(韩国专利公开No.10-2010-0052130)在 成本和时间方面存在问题。

从而本发明对拉马琳的新的化学合成方法进行了深入全面的研究，该方 法操作简单且具成本竞争力，结果发现可以通过使从氯甲酸烷基酯制备的谷 氨酸衍生物与从羟基苯胺或受保护的羟基苯胺制备的肼盐化合物反应，以高 产率简单地生产拉马琳。

背景技术部分中描述的信息是为了加强对本发明的背景的理解，可能并 不是本发明所属技术领域的普通技术人员已知的关于现有技术的信息。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种以具成本竞争力且简单的方式以高产率生 产拉马琳的新方法。

为了实现上述目的，本发明提供一种合成由以下化学式1表示的拉马琳 的方法，该方法包括由以下化学式2表示的谷氨酸衍生物与由以下化学式3 表示的肼盐化合物反应，得到由以下化学式4表示的中间体；使化学式4的 化合物氢化得到拉马琳：

[化学式1]

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

其中

R¹是烷基；

R²是氢或羟基的保护基；以及

X是酸。

此外，本发明提供一种合成拉马琳前体的方法，该方法包括由以下化 学式2表示的谷氨酸衍生物与由以下化学式3表示的肼盐化合物反应：

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

其中，

R¹是烷基；

R²是氢或羟基保护基；

X是酸。

进一步，本发明提供一种合成由化学式16表示的化合物的方法，该方 法包括由以下化学式17表示的氨基酸衍生物与由以下化学式18表示的肼 盐化合物反应：

[化学式16]

[化学式17]

[化学式18]

其中，

R³、R⁴、R⁵、R⁶或R⁷是氢、羟基或羟烷基；

R⁸是氢、烷基或酰基；

R⁹是氢或烷基；

n是1、2、3、4或5。

从下面的详细描述和所附的权利要求中，本发明的其他特征、优点和 实施方式将是显而易见的。

附图说明

图1是实施例1中合成的拉马琳的H-NMR谱。

图2是从拉马琳a terebrata中分离的天然拉马琳的H-NMR谱。

图3是化学式14的化合物的1H-NMR谱。

图4是化学式15的化合物的H-NMR谱。

图5和图6是实施例2中合成的拉马琳的H-NMR谱。

具体实施方式

除非另有规定，本说明书中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本 发明所属技术领域的普通技术人员所理解的含义相同。通常，本说明书中使 用的术语是本领域众所周知的并且是在典型实践中发现的。

根据其一方面，本发明提出一种合成拉马琳的方法，包括：

(a)由以下化学式2表示的谷氨酸衍生物与由以下化学式3表示的肼盐 化合物反应，得到由以下化学式4表示的化合物；以及

(b)使化学式4的化合物氢化而得到化学式1的拉马琳：

[化学式1]

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

其中，

R¹是烷基；

R²是氢或羟基保护基；以及

X是酸。

根据本发明的拉马琳是从南极洲地衣拉马琳a terebrata首次发现和分 离的抗氧化化合物，通过高分辨ES-MS测量发现，拉马琳的分子量为 254.1141，分子式为C₁₁H₁₆N₃O₄，且具有化学式1的结构。如名字所暗示的， 拉马琳源自拉马琳a terebrata。

在本发明中，已针对拉马琳的化学合成进行了研究，最终开发了一种 简单的方法来替代分离和提取，该方法通过谷氨酸衍生物与肼盐化合物反 应接着氢化来合成拉马琳。

本发明中使用的谷氨酸衍生物具有以下化学式2表示的结构。优选地， 化学式2的谷氨酸衍生物可通过用具有R¹-O-CO-Cl的结构的氯甲酸烷基酯 活化化学式5的谷氨酸衍生物以混合酸酐偶联机理来制备，化学式5的谷 氨酸衍生物源自谷氨酸，通过用苄氧羰基保护氨基并用苄基使α-羧基酯化 得到。

[化学式2]

[化学式5]

在氯甲酸烷基酯中，R¹对应于化学式2中的R¹，且为烷基。可采用本 领域中只要是烷基的任何基团。R¹的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、 异丙基、丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、辛基、2-乙基己基、取代的烷 基和环烷基。优选为乙基，因为它可以在工业上大量购买且易于处理。

化学式5的谷氨酸衍生物与氯甲酸烷基酯偶联之后，将苄基脱保护，在 本发明的一个实施方式中利用四氢呋喃(THF)或乙腈(MeCN)作为结晶溶剂。 测得THF使拉马琳的终产物产率提高约13％至16％。反应中使用的结晶溶 剂可以是本领域已知的任何一种溶剂。优选为THF。

随后，活化的化学式2的谷氨酸衍生物与以下化学式3的肼盐化合物进 行偶联反应。化学式3的肼盐可通过以下步骤制备：向受保护的羟基苯胺 中加酸得到酸式盐，接着与偶氮化合物偶联并还原。一种替代方法是非保 护处理，其中向化学式6的羟基苯胺中加酸(盐酸)得到酸式盐(盐酸盐)， 然后按反应流程1-2所示进行反应。

[化学式6]

[化学式3]

在本发明的一个实施方式中，如反应流程1-1和1-2所示，用HCl气体 处理化学式6的羟基苯胺，产生的加合物溶解于醇(如乙醇)中，并与偶氮 化合物偶联得到化学式8的中间体，然后用对甲苯磺酸(TsOH)和氯化锡还原， 得到化学式9的对甲苯磺酰肼。在这些反应流程中，采用羟基未保护的羟基 苯胺。

[反应流程1-1]

[反应流程1-2]

肼盐与活化的谷氨酸衍生物之间按混合酸酐偶联机理进行的反应，生成 纯度为97％或更高的拉马琳。特别地，即使放大反应，这种根据本发明的方 法的无保护路径也可以约50％的平均产率生成拉马琳，并分离得到纯度为 97％或更高的拉马琳。

如上面所阐明的，无保护路径为2到3个较少的工艺步骤，因而在生产 成本方面比保护路径更有利，因为后者需要2到3个工艺步骤用于制备受保 护的起始物料。

另一方面，化学式3的肼盐化合物特征在于羟基保护基R²。任何只要能 保护羟基的保护基都可用于本发明。优选为苄基。在随后的步骤中基于氢化 反应除去羟基保护基。

在本发明的另一个实施方式中，采用化学式12中羟基苯胺的羟基被苄基 保护的化合物，以约90～92％的平均产率生成拉马琳。就是说，采用受保护 的羟基苯胺的保护路径可以以非常高的产率生成拉马琳。

在本发明中，对参与形成化学式3的肼盐的酸没有特别限制，只要这种 酸使得形成与化学式2的活化的谷氨酸衍生物偶联的肼盐即可。酸的实例包 括盐酸、溴酸和对甲苯磺酸。

此外，提供根据本发明合成的拉马琳前体。因此，根据本发明的另一方 面设想一种合成拉马琳前体的方法。该方法包括由以下化学式2表示的谷氨 酸衍生物与由以下化学式3表示的肼盐化合物反应，得到化学式4的拉马琳 前体：

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

其中，

R¹是烷基；

R²是氢或羟基保护基；以及

X是酸。

根据其进一步方面，本发明提出一种合成由以下化学式16表示的化合物 的方法，该方法包括由以下化学式17表示的氨基酸衍生物与由以下化学式 18表示的肼盐化合物反应：

[化学式16]

[化学式17]

[化学式18]

其中，

R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷各自独立为氢、羟基或羟烷基；

R⁸是氢、烷基或酰基；

R⁹是氢或烷基；以及

n是1、2、3、4或5。

在这里，氨基酸衍生物是n＝1的天冬氨酸衍生物、n＝2的谷氨酸衍生物、 n＝3的2-氨基己二酸衍生物、n＝4的2-氨基庚二酸衍生物以及n＝5的2-氨基 辛二酸衍生物。

通过以下阐述说明的实施例，可获得对本发明更好的理解，但不应理解 为限制本发明。

实施例1：拉马琳1的合成

1-1：肼盐的制备

[反应流程1-1]

在1升的4颈烧瓶中，将50g(0.46mol)化学式6的化合物(2-氨基苯 酚)经剧烈搅拌完全溶解于500ml(11.5mol)的甲醇(MeOH)中。

将134g(2.3mol)NaCl置于配备有滴液漏斗的分离的500ml烧瓶中， 且滴液漏斗内装有113g(1.15mol)浓硫酸(H₂SO₄)。随着从漏斗缓慢加入 H₂SO₄，产生HCl气体。将HCl气体引入1L烧瓶中，同时搅拌。

气体生成完之后，移除分离的500ml烧瓶，在注入HCl气体的反应器 中继续搅拌15小时。

然后，用N₂清洗反应器，接着通过真空浓缩以蒸发约3/4(400ml)的溶 剂。加入乙酸乙酯(EA)(1L)以形成沉淀，同时搅拌30分钟或更长时间。

所述沉淀为2-氨基苯酚的盐酸盐，用200ml乙酸乙酯和己烷(3:7)的混 合物洗涤沉淀，并在真空中干燥，得到60g化学式7的化合物(产率：90％)。

[反应流程1-2]

在冰浴上的1L烧瓶中，通过搅拌将60g(0.41mol)化学式7的化合物 完全溶解于300ml乙醇(EtOH)中，同时保持烧瓶的温度为-5～0℃。

将55.3g(0.41mol)异戊基亚硝酸盐在200ml乙醇中的溶液加入烧瓶并 搅拌0.5～1.0小时，得到重氮盐溶液。

在冰浴上的配备有机械搅拌器的分离的2L烧瓶中，通过搅拌将156.3 g(0.82mol)SnCl₂、78.4g(0.41mol)对甲苯磺酸(TsOH)和500ml乙醇混合。

将重氮盐溶液缓慢加入烧瓶并反应1小时或更长时间，同时保持2L 烧瓶的温度为-5～0℃。

反应完成之后，将500ml乙醚(Et₂O)加入反应混合物中并搅拌10分钟 以形成沉淀。过滤后，用200ml乙酸乙酯(EA)和400ml己烷进一步洗涤得 到的滤饼，得到98g化学式9的肼盐(产率：80％)。

1-2:谷氨酸衍生物的制备以及拉马琳的合成

[反应流程1-3]

在冰浴上的500ml烧瓶中，通过搅拌将30g(0.08mol)化学式5的化合 物(N-苄氧羰基-L-谷氨酸α-苄酯,试剂级)完全溶解于150ml四氢呋喃(THF) 中，同时保持烧瓶的温度为-5～0℃。

将8.2g(0.08mol)三乙胺(TEA)在30mlTHF中的溶液在20～30分钟内 缓慢加入烧瓶中，并进一步额外搅拌0.5～1.0小时，同时保持烧瓶为-5℃。

将8.8g(0.08mol)氯甲酸乙酯(ECF)在50mlTHF中的溶液缓慢加入烧 瓶，并使其反应2.0小时或更长时间，同时保持烧瓶为-10～-5℃(溶液A)。

在冰浴上的分离的1L烧瓶中，将25.2g(0.085mol)化学式9的肼盐、 17.0g(0.16mol)TEA、200mlTHF以及60ml H₂O混合，同时保持烧瓶为 -5℃。

将以上制备的溶液A缓慢加入1L烧瓶中，将烧瓶的温度升至室温， 使其反应20小时或更长时间。

反应完成之后，通过真空蒸馏除去THF，加入500ml乙酸乙酯(EA)和 200ml H₂O，并搅拌10分钟以形成两层。回收有机层(EA)，并用5％HCl 洗涤，然后用蒸馏水洗涤一次，接着真空浓缩。

结果，得到油状浓缩物，将其溶解于250ml甲醇(MeOH)中。将该溶液 注入压力反应器，在压力反应器中存在3～5g的10％Pd/C的情况下，在1～2 atm的氢气压力下进行氢化反应。该氢化反应导致苄基脱保护。当氢化反应 进行20小时或更长时间时，通过硅藻土助滤剂滤去催化剂。用甲醇洗涤成 为滤饼的催化剂层，与滤液混合，并在真空中浓缩。在这一点上，直到固 体开始出现时，MeOH才蒸发(约4/5的MeOH被除去)，向残留物中加 入MeCN(或THF)以使产物结晶。随后，过滤结晶，用乙腈(MeCN)洗涤， 在真空中室温下干燥，得到灰白色固体拉马琳(化学式1)(12.4g，总产 率61％)。HPLC分析(条件：色谱柱：Capcellpak C18，流动相＝MeCN:H₂O (0.1％TFA)，UV波长＝220nm,流速＝0.5ml/min)表明，拉马琳具有97％ 或更高的纯度。通过H-NMR分析测定，发现该合成产物与天然拉马琳一致。 图1是合成的化学式1中拉马琳的H-NMR数据，而图2是天然拉马琳的 H-NMR数据。

1-3:根据结晶溶剂的结果

按与实施例1-1和1-2相同的方式合成拉马琳，除了改变结晶溶剂的种 类或化学式5的谷氨酸衍生物的量。测定这样得到的拉马琳的产率和纯度， 并将结果总结于下表1中。

表1

经偶联/氢化/浓缩之后利用各种结晶溶剂合成拉马琳的结果

即使放大反应，也可以约50％或更高的平均产率稳定地合成拉马琳， 并且纯度为约97％。特别地，利用THF作为溶剂使产率提高约13％至16％。

实施例2：拉马琳2的合成

2-1：肼盐的制备

[反应流程2-1]

在配备有搅拌器、温度计和冷凝器的3L反应器中，通过搅拌将85.0g (0.3606mol)化学式12的化合物溶解于1000ml蒸馏水中。将39.81g (0.5770mol)NaNO₂在300mlH₂O中的溶液装到滴液漏斗中。将3L反应器冷 却至0℃，并在相同的温度条件下，将NaNO₂溶液在约1小时内缓慢加入 反应器中。加完之后，在相同的温度下继续搅拌约1小时。

将225.61g SnCl₂在6M HCl中的溶液装到滴液漏斗中。在相同的温度 下，将SnCl₂/HCl溶液在约2小时内从滴液漏斗加入反应器中，接着再将它 们反应2小时。利用12.5M NaOH将得到的反应混合物的pH调整为11或 更高。中和后，用800ml乙醚萃取两次。弃去水层，干燥合并的醚层并注 入HCl气体，得到盐酸盐。用正己烷洗涤盐酸盐并干燥，得到化学式14的 肼盐。

使用的试剂的物料平衡如下：

表2

试剂的物料平衡以及化学式14的理论产量

  MW QTY 摩尔 化学式12 235.7 85.0 0.3606 H₂O 18.0 1000mL   NaNO₂69.0 39.81 0.5770 H₂O 18.0 300mL   SnCl₂189.61 225.61 1.1899 HCl 6M 36.5 800mL   25M NaOH 40.0     化学式14 250.72 90.41 0.3606

重复上述实验12次以上，并将结果总结于下表3中。

表3

13轮实验的结果

实验编号 100％产率wt.(g) 产物重量(g) 产率(％) 001 36.17 36.2 69.1 002 67.02 48.0 71.6 003 67.02 49.2 73.4 004 106.38 84.0 78.9 005 106.38 84.1 79.0 006 106.38 84.3 79.2 007 106.38 79.0 73.5 008 106.38 85.0 80.0 009 106.38 84.4 79.3 010 106.38 83.6 78.5 011 106.38 80.0 76.0 012 106.38 82.0 77.0 013 90.41 72.0 79.6

如表3所示，以平均产率75～80％制备了化学式14的肼盐，并且结果 由HPLC和¹H-NMR确认(图3)。

2-2:谷氨酸衍生物以及拉马琳的制备

[反应流程2-2]

在配备有搅拌器、温度计和冷凝器的3L反应器中，通过搅拌将92.58g (0.2493mol)化学式5的化合物溶解于1000ml二氯甲烷(MC)中。反应器冷 却至0℃之后，将30.26g(0.2991mol)三乙胺(TEA)缓慢加入反应器中并搅 拌约30分钟。进一步将反应器冷却至-15℃，然后在相同的温度条件下， 将32.46g(0.2991)氯甲酸乙酯(ECF)通过滴液漏斗在约1小时内加到反应 器中。然后，将反应器的温度升至-2～0℃，进行反应约2小时，得到化学 式10的化合物。

在分离的1L反应器中，通过搅拌将75.0g(0.2991mol)化学式14的化 合物、500ml MC和30.26g(0.2991mol)TEA混合约30分钟，并将混合物 转移到滴液漏斗中(化学式14溶液)。

进一步将3L反应器冷却至-15℃，将化学式14溶液(游离盐)在约4 小时内缓慢加入反应器中并搅拌。将温度升至室温，使它们反应过夜。反 应完成之后，按照蒸馏水、1N HCl、0.5N NaHCO₃和蒸馏水的顺序洗涤反 应混合物。弃去水层，干燥合并的醚层，通过蒸馏浓缩得到化学式15的粗 品化合物(141.5g,100％)。将该产物用乙酸乙酯(EA)和正己烷结晶，过滤 得到化学式15的化合物(130.1g，产率92％)

表4

物料平衡以及化学式15和拉马琳(化学式1)的理论产量

实验编号 MW Q'TY 摩尔 备注 化学式5 371.38 92.58 0.2493   TEA 101.19 30.26 0.2991 d:0.726 ECF 108.52 32.46 0.2991 d:1.1408 化学式14 250.72 75.0 0.2991   TEA 101.19 30.26 0.2991   化学式15 567.63 141.51 0.2493 100％产率 化学式1 253.25 63.13 0.2493 100％产率

图4给出了化学式15的化合物的H-NMR数据。

向压力反应器中加入80.0g(0.14mol)化学式15的化合物、800ml甲醇 和8.0g的10％Pd/C，利用氢气将反应器的压力控制为10～20psi。脱苄基 反应进行24小时。当从反应器中取出的样品监测到反应完成之后，通过过 滤除去催化剂，在真空中浓缩滤液，得到粗品化合物(化学式1)(35.45g,100 ％)。将浓缩物加入500ml EA中并充分混合约2小时或更长时间，以产生 结晶。将它们过滤并干燥，得到终产物拉马琳(化学式1)(32g，产率90.2 ％)。

上述实验总共重复五次，并将结果总结于下表5中。

表5

5轮实验的结果

实验编号 100％产率wt.(g) 产物重量(g) 产率(％) 001 35.68 32.6 91.3 002 35.68 32.7 91.8 003 91.45 82.0 92.0 004 49.07 45.0 91.7 005 35.45 32.0 90.2

由表5可以看出，以约90～92％的平均产率制备了化学式1的拉马琳， 并且采用H-NMR对结果进行了确认(图5和图6)。

工业实用性

如上所述，本发明的合成方法使得即使不使用诸如DMF这样的剧毒溶 剂，也可以以稳定的产率简单地合成具有优异的抗氧化活性和抗炎活性的 拉马琳。此外，本发明的方法具成本竞争力，且以高效率提供拉马琳，从 而使拉马琳能够大量生产。

尽管为了说明目的披露了本发明的优选的实施方式，然而本领域的技术 人员将会理解，在不背离所附权利要求中所披露的本发明的范围和精神的情 况下，各种修改、添加和替代都是可能的。