一种同时制备鼠李柠檬素和鼠李秦素化学对照品的方法

摘要

将青天葵以石油醚加热回流提取脱脂，残渣再以乙酸乙酯加热回流提取，回收乙酸乙酯，得稠膏状乙酸乙酯提取物。乙酸乙酯提取物用硅胶柱色谱或聚酰胺色谱分离，以硅胶薄层层析或盐酸-镁粉化学检识方法，收集并合并鼠李柠檬素和鼠李秦素组分，回收溶剂，得鼠李柠檬素和鼠李秦素混合的粗品(黄色粉末)，该粗品再以反相高效液相制备色谱进行分离，即可获得纯度达98％以上的鼠李柠檬素和鼠李秦素两种化学对照品。本发明工艺步骤简单，纯度高，色泽好，制备量大。

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种从中药青天葵中同时制备鼠李柠檬素和鼠李秦素两种化学对照品的方法。属中药现代化领域。主要包括青天葵经石油醚脱脂、乙酸乙酯提取、硅胶柱层析或聚酰胺柱层析分离、反相高效液相制备色谱精制四个步骤，从而得到鼠李柠檬素和鼠李秦素两种化学对照品。两种对照品的结构如下：

二、背景技术

青天葵来源于兰科植物毛唇芋兰NerviliaFordii(Hance)Schltr的地下块茎和全草，主要分布于广东、广西、四川、云南、贵州等省区，是我国传统中药。青天葵性寒味甘，归心、肺、肝经。能润肺止咳，清热解毒，散淤止痛。青天葵具有镇咳平喘、抗肿瘤及免疫增强和抗菌抗病毒作用，临床应用于治疗哮喘、喘息型慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、放射性肺炎、急性前庭大腺炎、急性咽炎、慢性咽炎急性发作等均有显著疗效。鉴于青天葵对肺部疾病有显著疗效且能抗病毒，冯崇廉将其应用于防治非典型肺炎(SARS)，效果显著(中国中医急症，2005，13(6)：339-341)。

长期以来青天葵一直是紧缺的且经济价值较高的中药，但目前青天葵药材标准还处于较低的水平，仅见收录于《广西壮族自治区中药饮片炮制规范》(2007年版)和《广东省中药材标准》(2004年版)中。前者收录的标准检查项目仅限于生药学方面的药材外形性状的检查，后者在药材标准中引入了薄层色谱鉴别项目，采用与对照药材进行比对的方式来进行鉴别。两种标准中均缺乏青天葵专属性成分或药理活性指标成分的检测，难以精确控制其内在质量，导致市场上流通有多种青天葵的伪品。常见的伪品有细辛、红薯叶、积雪草、满天星、水半夏叶、车前草叶和犁头尖叶等，其中伪品细辛有小毒。

张丽等报道鼠李柠檬素和鼠李秦素是青天葵中主要的黄酮类化合物(药学学报，2011，46(10)：1237-1240)，具有抑菌、抗炎、抗脂质过氧化作用、抗肿 瘤等作用，是青天葵药理活性指标成分。但迄今为止，国家尚未有鼠李柠檬素和鼠李秦素化学对照品，对照品市场上也未见鼠李柠檬素和鼠李秦素对照品的供应。因此制备鼠李柠檬素和鼠李秦素化学对照品，对于青天葵药材及相关复方的多指标控制以及辨析青天葵的伪品具有重要意义。

本发明以青天葵为原料，经石油醚脱脂、乙酸乙酯提取、硅胶柱层析或聚酰胺柱层析分离、反相高效液相制备色谱精制，可批量同时获得鼠李柠檬素和鼠李秦素两个化学对照品。

三、发明内容

本发明旨在提供一种同时获取鼠李柠檬素和鼠李秦素二个化学对照品的制备工艺。本发明工艺步骤简单，纯度高，色泽好，制备量大。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种同时制备鼠李柠檬素和鼠李秦素两种化学对照品的方法。青天葵经石油醚脱脂、乙酸乙酯提取、硅胶柱层析或聚酰胺柱层析分离、反相高效液相制备色谱精制四个步骤，获得纯度大于98％的鼠李柠檬素和鼠李秦素两种化学对照品。其具体步骤如下：

(1)石油醚脱脂：将青天葵粉碎成粗粉，按照质量体积比kg/L加入6-10倍量的60-90℃的石油醚加热回流5-7次，每次1h。过滤，青天葵残渣挥干石油醚。

(2)乙酸乙酯提取：脱脂后的青天葵残渣，按照质量体积比kg/L加入4-8倍量的乙酸乙酯加热回流6-8次，每次1h。合并乙酸乙酯提取液，回收溶剂，得青天葵的乙酸乙酯部位浸膏，浸膏60-80℃真空恒温干燥12-24h。

(3)柱层析分离：干燥后的乙酸乙酯部位浸膏以硅胶柱色谱分离或以聚酰胺色谱分离。

①硅胶柱色谱分离时，乙酸乙酯部位浸膏以1-3倍无水乙醇溶解，按1∶1-1∶2比例与100-200目柱层析硅胶拌匀混合，50℃恒温真空干燥12h.取10-20倍拌混硅胶的新鲜硅胶装柱，再以石油醚-丙酮(30∶1-4∶1)或石油醚-乙酸乙酯(30∶1-4∶1)梯度洗脱。石油醚-丙酮梯度洗脱时，收集12∶1-8∶1流分；石油醚-乙酸乙酯洗脱时，收集9∶1-5∶1流分。减压回收溶剂，即得鼠李柠檬素和鼠李秦素的混合物(黄色)。

②聚酰胺色谱分离时，乙酸乙酯部位浸膏以1-3倍无水乙醇溶解，按1∶1-1∶2比例与100-200目聚酰胺拌匀混合，50℃恒温真空干燥12h。取20-30倍经预处理过的聚酰胺装柱，依次用水、10％乙醇水溶液、30％乙醇水溶液和50％乙醇水溶液洗脱，每种溶剂洗至有很少物质被洗下时更换下一种溶剂。通过盐酸镁粉鉴别反应，确定洗脱物是否含有黄酮类物质。收集50％洗脱液，减压回收溶剂，即得鼠李柠檬素和鼠李秦素的混合物(黄色)。

(4)反相高效液相制备色谱精制：鼠李柠檬素和鼠李秦素的混合物以60％甲醇水溶液溶解，配成浓度为20-30mg/ml的样品溶液，微孔滤膜过滤，色谱柱为ODS-C18(250mm×20mm，15μm)，进样体积为1-4ml，采用流动相为60％甲醇水溶液等度洗脱，流速为10-15ml/min，以368nm检测，分别收集制备色谱中保留时间分别为11.5min和12.4min的二个主要色谱峰，减压回收溶剂，50℃恒温真空干燥24h，即得鼠李柠檬素和鼠李秦素两个化学对照品。

采用反相高效液相分析色谱分析了其纯度，纯度均达到98％以上。

以本发明从青天葵中分离制备鼠李柠檬素和鼠李秦素两个化学对照品，具有如下优势和进步：

1.本发明首次制备鼠李柠檬素和鼠李秦素两个化学对照品。

2.本发明工艺简单，青天葵经石油醚脱脂、乙酸乙酯提取、硅胶柱层析或聚酰胺柱层析分离、反相高效液相制备色谱精制四个步骤，即可同时获得纯度大于98％的鼠李柠檬素和鼠李秦素两个化学对照品，有利于资源利用最大化。

3.本发明分离成本低，所用试剂均可回收利用。

四、附图说明

图1为反相高效液相制备色谱图(368nm)；

图2为鼠李柠檬素的HPLC分析图谱(368nm)；

图3为鼠李秦素的HPLC分析图谱(368nm)；

五、具体实施方式

现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明。实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限制。

实施例1

(1)石油醚脱脂：将10kg青天葵粉碎成粗粉，用6倍量的60-90℃的石油醚加热回流7次，每次1h。过滤，青天葵残渣挥干石油醚。

(2)乙酸乙酯提取：脱脂后的青天葵残渣，加入5倍量的乙酸乙酯加热回流6次，每次1h。合并乙酸乙酯提取液，回收溶剂，60℃真空恒温干燥24h，得浸膏96.1g。

(3)硅胶柱色谱分离：干燥后的乙酸乙酯部位浸膏以硅胶柱色谱分离。取60g乙酸乙酯部位浸膏以2倍无水乙醇溶解，按1∶2比例与100-200目柱层析硅胶拌匀混合，50℃恒温真空干燥12h.取900g新鲜硅胶装柱，再以石油醚-丙酮(30∶1-4∶1)梯度洗脱，收集12∶1-8∶1流分，减 压回收溶剂，即得鼠李柠檬素和鼠李秦素的混合物0.9g(黄色)。

(4)反相高效液相制备色谱精制：0.9g鼠李柠檬素和鼠李秦素的混合物以60％甲醇水溶液溶解，配成浓度为30mg/ml的样品溶液，微孔滤膜过滤，岛津色谱柱ODS-C18(250mm×20mm，15μm)，进样体积为3ml，采用流动相为60％甲醇水溶液等度洗脱，流速为10ml/min，检测波长368nm，分别收集制备色谱中保留时间分别为11.5min和12.4min的二个主要色谱峰，减压回收溶剂，50℃恒温真空干燥24h，即得鼠李柠檬素和鼠李秦素两个化学对照品。鼠李柠檬素对照品重0.48g，HPLC纯度分析为98.5％；鼠李秦素对照品重0.33g，HPLC纯度分析为99.0％。

实施例2

(1)石油醚脱脂：将10kg青天葵粉碎成粗粉，用8倍量的60-90℃的石油醚加热回流6次，每次1h。过滤，青天葵残渣挥干石油醚。

(2)乙酸乙酯提取：脱脂后的青天葵残渣，加入6倍量的乙酸乙酯加热回流6次，每次1h。合并乙酸乙酯提取液，回收溶剂，60℃真空恒温干燥24h，得浸膏100g。

(3)硅胶柱色谱分离：干燥后的乙酸乙酯部位浸膏以硅胶柱色谱分离。取60g乙酸乙酯部位浸膏以2倍无水乙醇溶解，按1∶2比例与200-300目柱层析硅胶拌匀混合，50℃恒温真空干燥12h.取900g新鲜硅胶装柱，再以石油醚-乙酸乙酯(30∶1-4∶1)梯度洗脱，收集9∶1-5∶1流分。减压回收溶剂，即得鼠李柠檬素和鼠李秦素的混合物0.82g(黄色)。

(4)反相高效液相制备色谱精制：0.82g鼠李柠檬素和鼠李秦素的混合物以60％甲醇水溶液溶解，配成浓度为25mg/ml的样品溶液，微孔滤膜过滤，岛津色谱柱ODS-C18(250mm×mm，15μm)，进样体积为3.5ml，采用流动相为60％甲醇水溶液等度洗脱，流速为15ml/min，检测波长368nm，分别收集制备色谱中保留时间分别为11.5min和12.4min的二个主要色谱峰，减压回收溶剂，50℃恒温真空干燥24h，即得鼠李柠檬素和鼠李秦素两个化学对照品。鼠李柠檬素对照品重0.40g，HPLC纯度分析为98.3％；鼠李秦素对照品重0.26g，HPLC纯度分析为98.7％。

实施例3

(1)石油醚脱脂：将10kg青天葵粉碎成粗粉，用6倍量的60-90℃的石油醚加热回流8次，每次1h。过滤，青天葵残渣挥干石油醚。

(2)乙酸乙酯提取：脱脂后的青天葵残渣，加入7倍量的乙酸乙酯加热回流6次，每次1h。合并乙酸乙酯提取液，回收溶剂，60℃真空恒温干燥24h，得浸膏98.1g。

(3)聚酰胺色谱分离：干燥后的乙酸乙酯部位浸膏以聚酰胺柱色谱分离。取60g乙酸乙酯部位浸膏以2倍无水乙醇溶解，按1∶1.5比例与100-200目聚酰胺拌匀混合，50℃恒温真空干燥12h.取1500g经预处理过的聚酰胺装柱，依次用水、10％乙醇水溶液、30％乙醇水溶液和50％乙醇水溶液洗脱，每种溶剂洗至有很少物质被洗下时更换下一种溶剂。通过盐酸镁粉鉴别反应，确定洗脱物是否含有黄酮类物质。收集50％洗脱液，减压回收溶剂，干燥，即得鼠李柠檬素和鼠李秦素的混合物1.2g(黄色)。

(4)反相高效液相制备色谱精制：1.2g鼠李柠檬素和鼠李秦素的混合物以60％甲醇水溶液溶解，配成浓度为30mg/ml的样品溶液，微孔滤膜过滤，岛津色谱柱ODS-C18(250mm×mm，15μm)，进样体积为3ml，采用流动相为60％甲醇水溶液等度洗脱，流速为12ml/min，检测波长368nm，分别收集制备色谱中保留时间分别为11.5min和12.4min的二个主要色谱峰，减压回收溶剂，50℃恒温真空干燥24h，即得鼠李柠檬素和鼠李秦素两个化学对照品。鼠李柠檬素对照品重0.62g，HPLC纯度分析为99.1％；鼠李秦素对照品重0.42g，HPLC纯度分析为98.6％。