一种以柠檬提取液为防褐化培养基的蝴蝶兰防褐化组培方法

摘要

本发明公开了一种以柠檬提取液为防褐化培养基的蝴蝶兰防褐化组培方法，所述培养基包括初代培养基和增殖分化培养基，所述初代培养基和增殖分化培养基分别含有一定量的天然柠檬提取液，本发明组培方法包括包括外植体消毒、初代培养和增殖分化培养，生根培养、炼苗和移栽等步骤。本发明使用了含有天然添加物的培养基对蝴蝶兰常见的褐化问题起到防治的作用，同时采用不同的切取方式辅助防治分化阶段的褐化问题，形成了一种复合防褐化的方法。本发明方法稳定性高，成功率大，绿色环保，可周年重复生产。解决现有方法中成功率不高且不环保的问题，具有极大的现实应用意义。

说明书

本申请是申请号为：201410003340X，申请日为：2013-4-27，发明名称为：一种蝴蝶兰 防褐化组培方法及防褐化培养基的分案申请

技术领域

本发明主要涉及植物组织培养领域，具体地说是一种蝴蝶兰防褐化组培方法及防褐化培 养基。

背景技术

外植体褐变是植物组织培养中遇到的重要问题。有研究表明，导致褐化的主要原因是由 多酚氧化酶作用于天然底物酚类物质形成醌而引起的，通过加入抗氧化剂和吸附剂可较好地 控制褐化现象发生。

针对这些产生褐化的原因，早前有研究表明活性炭是能够起到防褐化的作用的，因为活 性炭防褐化用的原理是活性炭的吸附作用，而活性炭本身吸附作用是有限的，也就是说每瓶 中我们不可能加入大量的活性炭，所以小量的活性炭的吸附作用是比较小的，一旦吸附的有 害成分达到饱和，基本上就没有功效了，因此在培养过程中需更换新鲜培养基，而植物的生 长发育是连续的过程，对培养的内在小环境是有严格要求的，频繁更换培养基不利于培养基 中的营养成分产生作用，且在转接过程中存在着污染的风险，高频率的转接会加大污染死亡 的机率，也就说活性炭防褐化的作用有严重的缺陷。随后又有研究表明光照对初代培养的褐 化是有影响的，结果表明，1000lx和3000lx光强培养可降低褐化率，2000lx光强培养的外 植体褐化严重，差异显著。不难发现这些方法存在着一定的缺陷和不全面性且不环保，对于 整个培养阶段的防褐化和一个比较系统的防褐化方法的研究还是甚少。

蝴蝶兰又名蝶兰(Phalaenopsis amabilis)，兰科(Orchidaceae)蝶兰属(Phalaenopsis) 多年生附生草本植物，有着“洋兰皇后”之称的蝴蝶兰，由于其花形如彩蝶飞舞，色彩艳丽， 体态轻盈、飘逸，在国内外花卉市场上极受欢迎，一直都是消费者的宠儿。而且蝴蝶兰除了 盆栽之外，还特别适宜用作切花，是艺术插花的高档花材。

“V31”是蝴蝶兰红花系列的一个品种，以超长的花梗长度，良好的花序排列，中庸的 花形及花色，特别的花朵图案，博得广大生产者及消费者的欢迎，多年以来一直受到追捧， 是蝴蝶兰中的佼佼者。但是兰科植物在组织培养过程中的褐化问题是多发的常见的，几乎不 可避免，褐化会导致植株的死亡，也就是培养中的植物不能继续进行培养，所以防止褐化是 在兰科植物组织培养中要极力解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蝴蝶兰防褐化组培方法，通过该方法可以对蝴蝶兰组织培养 过程出现的褐化问题进行改善，提高存活率，增加健康的组培苗数量从而增加最终的产量。

本发明的目的还在于提供提供一种植物防褐化组织培养基；该培养基可以对植物组培过 程中出现的褐化问题得到显著改善。

本发明解决技术问题采用如下方案：

一种植物防褐化组培培养基，其特点在于，各阶段培养基由如下组分组成：

(1)初代培养基

每升MS基本培养基中添加6-BA 8.0mg、NAA 0.5mg、金盏花提取液175mg、琼脂 8g、蔗糖30g，培养基pH＝5.6；或

每升N6基本培养基中添加6-BA 8.0mg、NAA 0.5mg、柠檬提取液150mg、琼脂8g、 蔗糖30g，培养基pH＝5.6；或

每升MS基本培养基中添加6-BA 8.0mg、NAA 0.5mg、西红柿提取液300mg、琼脂8 g、蔗糖30g，培养基pH＝5.6；或

每升MS基本培养基中添加BA 8.0mg、NAA 0.5mg、迷迭香提取液110mg、琼脂8 g、蔗糖30g，培养基pH＝5.6；

(2)增殖分化培养基

每升B5基本培养基中添加6-BA 8.0mg、NAA 0.5、金盏花提取液175mg椰汁150g、 琼脂8g、蔗糖30g、培养基pH＝5.6；或

每升N6基本培养基中添加+6-BA 8.0mg、NAA 0.5mg、柠檬提取液150mg、椰汁150g、 琼脂8g、蔗糖30g，培养基pH＝5.6；或

MS基本培养基中添加6-BA 8.0mg、NAA 0.5mg、西红柿提取液300mg、椰汁150g、 琼脂8g、蔗糖30g，培养基pH＝5.6；或

MS基本培养基中添加6-BA 8.0mg、NAA 0.5mg、迷迭香提取液110mg、椰汁150g、 琼脂8g、蔗糖30g、培养基pH＝5.6。

本发明同时提供一种蝴蝶兰防褐化组培方法，包括外植体消毒、初代培养和增殖分化培 养，生根培养、炼苗和移栽，其特点在于，

所述初代培养是指：

将消毒处理的外植体接入权利要求1所述的初代培养基上，25±1℃、光照1500-2000Lx； 光照时间为10-12小时/天，培养5-6周；

所述增殖分化培养是指：

将初代培养后的没有发生褐化的组织接入权利要求1所述的增殖分化培养基，25±1℃、 光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养至分化出幼苗。

所述生根培养是指:

将增殖分化培养后的苗高2cm的无根小苗，按每瓶1株，接种于MS+6-BA 1.0mg/L +NAA 0.2mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L培养基中，培养2周。

所述炼苗是指：

将生根培养后的成苗每隔25-30天重新转入生根培养基，如此反复2-3次；将壮苗后的 成苗瓶口打开，在培养室半遮光放置2-3日，期间适时补充水分，使组培苗逐步适应外界环 境，达到炼苗的目的。

所述移栽是指：

将消毒处理过的水苔用清水浸泡，然后用脱水机脱去水苔中多余的水分至水苔手紧握无 水滴产生，待用；移栽时将苗的根系分开呈散射状，中间填充水苔，再用水苔包裹整个根系， 然后将苗根部浸入营养液中，待水苔吸收营养液后再进行包苗，移栽。

所述外植体消毒是指：

从植株上剪下当年生嫩叶，自来水冲去泥沙，洗涤液浸泡10min并除去表面污垢，自 来水冲洗3h，置于超净工作台上：体积浓度75％的酒精溶液浸泡35s，之后无菌水冲洗3次， 再用体积浓度0.2％的HgCl₂溶液浸泡5-7min，无菌水冲洗8次，之后用500mg/L PVP浸泡 4-8min转入培养皿中，吸干附着水分等待接入初代培养基。

本发明方法具有如下优点或效果：

1.本发明采用天然添加物金盏花和柠檬作为添加剂加入培养基中，是第一次将天然物质 加入培养基中起到防褐化的作用，与传统的化学试剂和活性炭相比较，这些天然物质天然纯 净，绿色环保，利用添加物自身所含有益物质起到防褐化的作用。

2.本发明采用几种不同的基本培养基与天然添加剂组合，找到了最优化的防褐化的组合 方案，且方案不唯一，可以有多种选择，为今后蝴蝶兰组培过程中的防褐化提供思路和解决 办法。

4.本发明在最后阶段，待组培苗长势稳定后接入不加防褐化试剂的培养基中正常生根， 极少发生褐化，起到节约成本的目的。

5.本发明在初代和增殖过程都能起到防止褐化的作用，与传统方法相比更全面，从各个 阶段解决防褐化的问题，因而提高组培苗的成活率和质量，同时对组培苗自身的生长起到一 定的促进作用，可以得到大量的优质成苗。

6.本发明中的组培苗褐化率低，营养健康，温光合理，长势旺盛。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明技术方案做进一步说明。

以下实施例MS培养基配方：每升培养基中含KNO₃(1900mg/L)，NH₄NO₃(1650mg/L)， MgSO₄·7H₂O(370mg/L)，KH₂PO₄(170mg/L)，CaCl₂(330mg/L)，KI(0.83mg/L)，H₃BO₃(6.2mg/L)，MnSO₄·H₂O(16.9mg/L)，ZnSO₄·7H₂O(8.6mg/L)，CuSO₄·5H₂O(0.025mg/L)， CoCl₂·6H₂O(0.025mg/L)，Na₂MoO₄·2H₂O(0.25mg/L)，FeSO₄·7H₂O(27.85mg/L)，Na₂EDTA (37.25mg/L)，甘氨酸(2.0mg/L)，烟酸B3(0.5mg/L)，盐酸硫胺素B1(0.1mg/L)，盐酸 吡哆醇B6(0.5mg/L)，肌醇(100mg/L)。

B5培养基配方：KNO₃(2500mg/L)，(NH₄)₂SO₄(134mg/L)，NaH₂PO₄·H₂O(150mg/L)， MgSO₄·7H₂O(250mg/L)，CaCl₂(124mg/L)，KI(0.75mg/L)，H₃BO₃(3mg/L)，MnSO₄·H₂O (10mg/L)，ZnSO₄·7H₂O(2mg/L)，CuSO₄·5H₂O(0.025mg/L)，CoCl₂·6H₂O(0.025mg/L)， Na₂MoO₄·2H₂O(0.25mg/L)，FeSO₄·7H₂O(27.85mg/L)，Na₂EDTA(37.25mg/L)，烟酸B3 (1mg/L)，盐酸硫胺素B1(100mg/L)，盐酸吡哆醇B6(1mg/L)，肌醇(100mg/L)。

N6培养基配方：KNO₃(2830mg/L)，(NH₄)₂SO₄(463mg/L)，MgSO₄·7H₂O(185mg/L)， KH₂PO₄(400mg/L)，CaCl₂(125mg/L)，KI(0.8mg/L)，H₃BO₃(1.6mg/L)，MnSO₄·H₂O (3.3mg/L)，ZnSO₄·7H₂O(1.5mg/L)，FeSO₄·7H₂O(27.85mg/L)，Na₂EDTA(37.25mg/L)， 甘氨酸(2.0mg/L)，烟酸B3(0.5mg/L)，盐酸硫胺素B1(1mg/L)，盐酸吡哆醇B6(0.5mg/L)。

蝴蝶兰防褐化组培方法包括以下步骤：

(1)外植体的选择及天然添加剂的制备与灭菌

选取当年生嫩叶或组培苗中的嫩叶，当年生嫩叶需要经过如下的灭菌过程：从植株上剪 下，自来水冲去泥沙，洗涤剂液浸泡10min并用软刷轻轻刷去表面污垢，自来水冲洗3h， 置于超净工作台上：体积浓度75％的酒精溶液浸泡35s，之后无菌水冲洗3次，再用体积浓 度0.2％的HgCl₂溶液浸泡7min，无菌水冲洗8次，之后用500mg/L PVP浸泡6min转入培 养皿中吸干水分等待接入培养基；使用了PVP(聚乙烯吡咯烷酮)后的消毒效果比原先没有 使用的溶液无菌率提高了4倍。

选取组培苗为外植体是不需要经过消毒的过程直接置于超净工作台中待用。

本发明选取的天然添加剂为金盏花、柠檬、西红柿、迷迭香，需要提前制备成无菌溶液。 选取刚过观赏期的金盏花摘下花朵洗净，榨取汁液，将汁液过滤除去固体残渣，再用无菌过 滤器在超净工作台中过滤制成无菌提取液待加入灭菌完成的培养基中使用。带表皮柠檬榨取 汁液，将汁液过滤除去固体残渣，再用无菌过滤器在超净工作台中过滤制成无菌提取液待加 入灭菌完成的培养基中使用。带表皮西红柿榨取汁液，将汁液过滤，再用无菌过滤器在超净 工作台中过滤制成无菌提取液待加入灭菌完成的培养基中使用。迷迭香植株放入水中先沸水 煮0.5h，然后保持水温90°煮2.5h，将汁液过滤除去固体残渣，再用无菌过滤器在超净工 作台中过滤制成无菌提取液待加入灭菌完成的培养基中使用。

(2)初代培养

将处理好的叶片切为正常的0.5cm*0.5cm的小块，或再将0.5cm*0.5cm的小块再横向从 中间切开切成小块；将上述小块接入表1中的各培养基中，在25±1℃、光照1500-2000Lx； 光照时间10-12小时/天的条件下培养，每组培养基处理分3次重复，每次处理9瓶。6周 内的平均褐化率结果(培养6周)如表1所示，其中第3、9、12、30四组中2周内没有发 生褐化、6周内平均褐化率小于5。

表1初代培养基

每种培养基均加入6-BA 8.0mg/L+NAA 0.5mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.6。

(3)增殖分化培养

将没有发生褐化的组织接入表2中的各增值分化培养基中培养，培养条件：25±1℃、 光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，其中第3、4、5、10组3周内没有发生褐 化，6周内的平均褐化率低于3％，且增殖率提高5倍以上，分化周期缩短8d。

表2增殖分化培养基

每种培养基均加入6-BA 8.0mg/L+NAA 0.5mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.6。 每组处理都是3次重复，每次处理9瓶。

(4)生根培养

取苗高2cm的无根小苗，按每瓶1株，接种于MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+ 琼脂8g/L+蔗糖30g/L培养基中，2周内长出4-6条根，6周内在不使用防褐化试剂的条 件下没有发生褐化。

(5)炼苗与移栽

生根后的成苗每隔25-30天重新转入生根培养基，如此反复2-3次，这样的成苗质量优良， 能经受外界环境带来的影响。将壮苗后的成苗瓶口打开，在培养室半遮光放置2-3日，期间 适时补充水分，使组培苗逐步适应外界环境，达到炼苗的目的。

将消毒处理过的水苔用清水浸泡，然后用脱水机脱去水苔中多余的水分(水苔脱水程度 以用手紧握无水滴产生为宜)，待用。移栽时将苗的根系分开呈散射状，中间填充少许水苔， 再用水苔包裹整个根系，然后将苗送入营养钵(营养钵营养液是MS培养基的母液稀释10倍 后的溶液)中，将水苔轻压到营养钵的水线以下即可。包苗时要做到松紧适宜。可先将穴盘 用水苔填充好，然后用镊子在每一穴盘中间挖1个小洞，把小苗根系放入其中，轻压即可。 移栽后要及时喷洒3000-4000倍杀菌剂进行预防处理。一般栽后3～5天无需浇水，但应适 当增加空气湿度。

本发明方法中，使用了几种基本培养基，将几种基本培养与天然添加组合起来进行了全 交实验设计，多方面的考虑最终的实验效果，将天然添加剂的自身的作用发挥大最大程度， 也解决了在各个阶段都适合使用的问题，在防褐化的同时还能促进组培苗的生长。