对半翅目昆虫种类有毒的蛋白质

摘要

本发明公开半翅目昆虫抑制蛋白、使用此类蛋白的方法、编码此类蛋白的核苷酸序列、检测和分离此类蛋白的方法以及它们在农业系统中的用途。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年4月6日提交的美国临时申请序列号 61/621,436的优先权，所述申请以引用的方式整体并入本文。

序列表的并入

序列表包含在名为“38_21_56191_APCT_Sequence Listing_ST25. txt”的文件中，所述文件大小为529,794字节(在操作系统MS-Windo  ws中测量的)并且在2013年4月4日创建，所述序列表同时通过电 子提交方式提交(使用美国专利局EFS-Web提交系统)并且以引用的 方式整体并入本文。

发明领域

本发明大体上涉及昆虫抑制蛋白领域。具体地说，本发明涉及展 示针对农作物的农业相关害虫和昆虫、特别为半翅目种类昆虫害虫的 昆虫抑制活性的蛋白质。

发明背景

源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)的昆虫抑制蛋白 对人、脊椎动物和植物为无毒的。这些蛋白质也为生物可降解的、安 全的和有效于控制害虫昆虫的。这些蛋白质中的一些已经用于并且正 在用于通过用包含这些蛋白质的制剂或者用表达它们的微生物喷雾、 用包含这些蛋白质的处理法处理种子、或者在农作物和农作物种子中 表达这些蛋白质作为并入植物的保护剂来控制农作物的农业相关的 害虫。

某些半翅目种类，特别是芒果叶蝉属(Amrasca)、小绿叶蝉属 (Empoasca)和草盲蝽属(Lygus bug)，为棉花和苜蓿的害虫并且通常仅 使用可持续存在于环境中并且对环境有害的广谱化学物质例如硫丹、 高灭磷和草氨酰来控制。已开发用于由农民商业使用以控制鞘翅目和 鳞翅目害虫种类的制剂或者农作物中为转基因性状的一些Bt蛋白， 但是没有开发用于商业控制半翅目害虫种类的Bt蛋白。

本领域已报道半翅目特异性毒性蛋白。TIC807为美国专利申请 公开号US 2008-0295207 A1中公开的对半翅目害虫种类有毒的苏云 金芽孢杆菌蛋白。还已公开报道为对鳞翅目种类有毒的非常类似于T IC807的氨基酸序列的Cry51Aa1蛋白(Huang等人,(2007)J.Inverte  br.Pathol.95(3),175-180)，但是没有报道半翅目特异性活性。Baum 等人公开TIC853，其据报道为对草盲蝽属害虫种类有毒的蛋白质(美 国专利申请公开号US 2010-0064394A1)。据报道，称为AXMI-171 的蛋白质展示对半翅目昆虫(美国专利申请公开号US2010-0298207 A1,实施例18)、特别为豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)的一些有限的抑 制。

所有这些蛋白质展示仅针对豆荚草盲蝽的窄范围的毒性并且仅 在不认为能通过植物中的表达来实现的高剂量下展示针对其它草盲 蝽属害虫种类的毒性作用。与现有技术的半翅目毒性蛋白相比，存在 对可用于植物之上或之中、针对半翅目害虫种类并且以低浓度有效剂 量展示广泛宿主范围的毒性蛋白的需要。

发明简述

本文所述的重组工程化的半翅目毒性蛋白(在本文中被称为“工 程化毒素蛋白”、“工程化毒性蛋白”、“工程化半翅目毒性蛋白”、“工 程化半翅目毒素蛋白”，当指示两种或更多种此类蛋白质的组时在本 文中也以截短形式称为“eHTP’s”，当指示异常时称为“eHTP”)为天然 发生的苏云金芽孢杆菌杀昆虫毒素TIC807(SEQ ID NO:2)的衍生物， 先前已描述TIC807_M2(SEQ ID NO:8)、Cry51Aa1(SEQ ID NO:182)、 TIC853(SEQ ID NO:184)以及AXMI-171(SEQ ID NO:206)展示针对 半翅目害虫种类，特别为豆荚草盲蝽昆虫种类的生物控制活性(本文 任何其它部分引用的参考文献)。本发明的重组半翅目昆虫毒性蛋白 特别为对昆虫害虫芒果叶蝉属、小绿叶蝉属和草盲蝽属种类的昆虫有 毒并且对与这些昆虫害虫种类中的每一种系统发生地相关的其它昆 虫害虫种类有毒，并且额外地对使用由半翅目害虫种类芒果叶蝉属、 小绿叶蝉属和草盲蝽属种类所用的刺入和吸吮机制食用植物的昆虫 害虫有毒的。与前体杀昆虫毒素TIC807(SEQ ID NO:2)不同，来源于 它们的TIC807_M2(SEQ ID NO:8)、Cry51Aa1(SEQ ID NO:182)、 TIC853(SEQ ID NO:184)以及AXMI-171(SEQ ID NO:206)各自需要 适度高剂量至高剂量的蛋白质实现对草盲蝽属种类的毒性作用并且 展示对第二紧密相关的草盲蝽属种类的极低或者事实上不能检测的 毒性作用，本发明的eHTP蛋白质展示针对半翅目昆虫害虫的惊人且 意外的低剂量作用，包括跨越所述半翅目内的害虫谱的宿主范围毒性 作用。

与在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:182或SEQ  ID NO:184中任一项所列出的毒素蛋白中的一种或多种的初始氨基 酸序列相比，本发明的eHTP’s各自包含至少一个氨基酸取代、一个 氨基酸添加或者一个氨基酸缺失。在某些实施方案中，提供包含针对 草盲蝽属害虫种类的比SEQ ID NO:2(TIC807)、SEQ ID NO:8(TI C807_M2)、SEQ ID NO:182(Cry51Aa1)、SEQ ID NO:184(TIC85 3)和/或SEQ ID NO:206(AXMI-171)中任一种所列出的毒素中的任 何一种或多种大至少约2倍至约260倍的抑制活性的eHTP。任选地， eHTP与选自由SEQ ID NO:2(TIC807)和SEQ ID NO:182(Cry51A a1)组成的组的毒素蛋白展示至少约95％氨基酸序列同一性。在某些 实施方案中，提供在与SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 182或SEQ ID NO:184中任一项的氨基酸序列相比时包含至少一个 氨基酸取代、至少一个氨基酸添加或至少一个氨基酸缺失eHTP。与 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:18 4中所列出的苏金云芽孢杆菌蛋白的活性和目标害虫种类谱相比，e HTP展示增大或更大的草盲蝽抑制活性和目标害虫种类谱。上述eH TP’s中的每一种均共同地或替代地包含至少：(i)在溶剂可及的SEQ  ID NO:2氨基酸残基中的氨基酸取代、添加或缺失；(ii)在溶剂可及 的SEQ ID NO:2氨基酸残基的3个连续残基内的氨基酸取代、添加 或缺失；或者(iii)在SEQ ID NO:180中列出的氨基酸序列。上述eH TP’s将各种包含至少(参见根据TIC807的氨基酸位置编号的氨基酸序 列位置)选自由以下组成的组的一个取代或缺失：在位置12处由天冬 氨酸置换天冬酰胺、在位置46处由丝氨酸置换苯丙氨酸、在位置52 处由甲硫氨酸置换异亮氨酸、在位置54处由组氨酸置换酪氨酸、在 位置68处由丙氨酸置换苏氨酸、在位置70处由丙氨酸置换谷氨酰胺、 在位置87处由丝氨酸置换丙氨酸、在位置93处由丙氨酸置换苏氨酸、 在位置95处由丙氨酸置换丝氨酸、在位置105处由丙氨酸置换甘氨 酸、在位置117处由丙氨酸置换丝氨酸、在位置119处由丙氨酸置换 丝氨酸、在位置125处由半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丝 氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、亮氨酸、缬 氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸或酪氨酸置换谷氨酸盐(glutamate)、在位 置128处由丙氨酸置换甘氨酸、在位置133处由谷氨酸、酪氨酸或色 氨酸置换苏氨酸、在位置134处由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨 酸、赖氨酸、半胱氨酸或甲硫氨酸置换异亮氨酸、在位置135处由丝 氨酸、丙氨酸、缬氨酸、色氨酸或苏氨酸置换谷氨酰胺、在位置137 处由组氨酸、酪氨酸、苏氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、 甘氨酸、异亮氨酸、色氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨 酸、苯丙氨酸或精氨酸置换天冬酰胺、在位置138处由缬氨酸置换苯 丙氨酸、由丝氨酸置换Ala139、由丙氨酸置换Thr145、由丝氨酸、 缬氨酸、苏氨酸、半光氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、氨基乙酸、 谷氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、组氨 酸、丙氨酸、精氨酸、色氨酸或脯氨酸置换Phe147、在位置148处 由丙氨酸置换谷氨酸盐、在位置149处由天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨 酸、丙氨酸或苯丙氨酸置换谷氨酸盐、在位置150处由亮氨酸、缬氨 酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、色氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、酪氨 酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺或精氨酸置换丙 氨酸、在位置151处由丙氨酸置换丝氨酸、在位置153处由丙氨酸置 换天冬氨酸、在位置155处由半胱氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、天冬氨 酸、组氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸，天冬酰胺、苏氨酸、丙氨 酸、苯丙氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸或缬氨 酸置换谷氨酸盐、在位置157处由半胱氨酸、天冬氨酸、色氨酸、酪 氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷 氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或精氨酸置换天冬酰胺、在位置1 58处由丙氨酸置换异亮氨酸、在位置159处由丙氨酸或苏氨酸置换 丝氨酸、在位置167处由精氨酸或丙氨酸置换丝氨酸、在位置175处 由丙氨酸置换缬氨酸、在位置177处由丙氨酸置换甲硫氨酸、在位置 180处由天冬氨酸置换天冬酰胺、在位置182处由丙氨酸置换苏氨酸、 在位置187处由丙氨酸置换亮氨酸、在位置196处缺失组氨酸、在位 置197处缺失酪氨酸、在位置198处缺失丝氨酸、在位置199处缺失 组氨酸、在位置200处由丙氨酸置换酪氨酸、在位置200处缺失酪氨 酸、由丙氨酸置换Ser201、在位置201处缺失丝氨酸、在位置208 处由丙氨酸置换色氨酸、在位置217处由天冬酰胺置换丝氨酸、在位 置219处由精氨酸置换脯氨酸、在位置223处由酪氨酸置换色氨酸、 在位置235处由丙氨酸置换苯丙氨酸、在位置239处由丙氨酸置换天 冬酰胺、在位置241处由丙氨酸置换天冬氨酸、在位置243处由丙氨 酸置换苏氨酸、在位置244处由异亮氨酸置换缬氨酸、在位置245处 由丙氨酸置换苏氨酸、在位置246处由苯丙氨酸置换酪氨酸、在位置 247处由丙氨酸或赖氨酸置换苏氨酸、在位置249处由丙氨酸或精氨 酸置换丝氨酸、在位置250处由丙氨酸置换缬氨酸、在位置251处由 丙氨酸置换缬氨酸、在位置252处由丙氨酸置换丝氨酸、在位置273 处由色氨酸置换精氨酸、在位置274处由丙氨酸置换苏氨酸、在位置 275处由丙氨酸置换异亮氨酸、在位置282处由丙氨酸置换精氨酸、 在位置287处由丙氨酸或苯丙氨酸置换组氨酸、在位置293处由丙氨 酸置换丝氨酸、在位置295处由丙氨酸置换天冬酰胺、在位置299处 由由丙氨酸置换谷氨酸盐、在位置300处由丙氨酸置换甲硫氨酸、在 位置303处由丙氨酸置换苏氨酸、在位置305处由丙氨酸置换脯氨酸、 在位置306处由丙氨酸置换异亮氨酸、以及在位置308处由丙氨酸置 换苏氨酸，或者其中所述蛋白质包括所引用的取代和/或缺失的任何 组合。eHTP’s在SEQ ID NO:2的氨基酸残基或者在SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO:182或SEQ ID NO:184的对应氨基酸位置处包含至少 一个氨基酸取代、一个氨基酸添加或一个氨基酸缺失，所述对应氨基 酸位置选自由以下组成的组：(i)具有至少约15％到至少约36％的相对 溶剂可及性(solvent-accessibility)的氨基酸残基；以及(ii)位于来自具有 至少约15％到至少约36％相对溶剂可及性的氨基酸的约3个连续残基 距离内的氨基酸残基。本发明的eHTP在选自由SEQ ID NO:2的以 下组成的组的氨基酸残基处包含至少一个氨基酸取代、添加或缺失： Thr93、Ser95、Ser97、Phe147、Gln149、Ser151、Asn180、Thr182、 Val251、Gln253以及Ser255。任何上述eHTP’s可在选自由SEQ ID  NO:2的以下各项组成的组的氨基酸残基或者SEQ ID NO:8、SEQ  ID NO:182或SEQ ID NO:184的对应氨基酸残基位置处包含至少一 个额外的氨基酸取代、添加或缺失：Val10、Ile14、Asn22、Asn23、 Gly24、Ile25、Gln26、Gly27、Phe30、Gln38、Ile39、Asp40、Thr41、 Ile43、Ser193、Thr194、Glu195、His196、Tyr197、Ser198、His199、 Tyr200、Ser201、Gly202、Tyr203、Pro204、Ile205、Leu206、Thr20 7、Trp208、Ile209、Ser210、Tyr216、Ser217、Gly218、Pro219、Pro 220、Met221、Ser222、Trp223、Tyr224、Phe225、Asn239以及Val2 44。任何上述eHTP’s可包含选自由以下组成的组的一个或多个修饰： S95A、F147A、Q149E、V251A、P219R、以及来自SEQ ID NO:2 中所列出的氨基酸残基196-201的任何三个连续氨基酸的缺失。可进 一步修饰本发明的任何eHTP’s，以与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:182或SEQ ID NO:184中任一项所列出的潜在天然 发生的苏云金芽孢杆菌蛋白相比展示增加的溶解度，其中eHTP相对 于SEQ ID NO:2中所列出的氨基酸序列包含至少一个或多个氨基酸 序列修饰。一个或多个修饰在限定为SEQ ID NO:2中的58、59、19 8、199、201或202的一个或多个氨基酸位置处包含至少一个赖氨酸 取代；在限定为SEQ ID NO:2中的198、248或301的一个或多个氨 基酸位置处包含谷氨酸残基取代；或者在限定为SEQ ID NO:2的24 6、250或253的一个或多个氨基酸处包含精氨酸残基取代。具有选 自由以下组成的组的氨基酸序列的eHTP为本发明的优选实施方案： SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、 SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、 SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、 SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、 SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、 SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、 SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、 SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、 SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、 SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、 SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、 SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、 SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、 SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、 SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、 SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、 SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、 SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、 SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ I D NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、 SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ I D NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、 SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ I D NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、 SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ I D NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、 SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ I D NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、 SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ I D NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、 SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ I D NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、 SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO: 202以及SEQ ID NO:204，或者其昆虫抑制片段。通过本发明的eH TP’s抑制的目标半翅目害虫种类包括至少豆荚草盲蝽、美国牧草盲蝽 (Lygus lineolaris)、马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae)和苯甲醛对叶蝉 (Amrasca devastans)、以及系统发生地彼此相关或者使用刺入和吸吮 方法摄食植物的半翅目内的其它害虫。

还提供通过使害虫与半翅目抑制量的本发明的eHTP以及包含至 少半翅目控制量(或半翅目抑制量)的一种或多种本发明的eHTP’s的 昆虫抑制组合物接触来控制半翅目害虫的方法。在某些实施方案中， 提供包含任何本文所公开的eHTP’s的昆虫抑制组合物。在这些方法 的某些实施方案中，半翅目害虫处于棉田、大豆田或者苜蓿田中。半 翅目毒性或者半翅目控制组合物可包含至少一种或多种eHTP连同选 自由以下组成的组的补充剂：昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子 和昆虫抑制化学物质。这些试剂中的每一种均可展示半翅目控制特 性，可展示用于控制与半翅目种类无关的害虫如鳞翅目种类或鞘翅目 种类的特性，或者可展示双重模式的作用特性，在所述作用特性中能 同时控制一种或多种半翅目种类和一种或多种鳞翅目或鞘翅目种类。

提供编码本发明的eHTP’s的重组多核苷酸。还提供包含本发明 的多核苷酸的微生物，并且此类微生物内的此类多核苷酸官能定位于 设计成从可操作地连接的官能基因调控元件表达本发明的eHTP’s的 表达盒中。微生物意图包括细菌细胞以及转基因植物细胞。此类转基 因植物细胞可再生到全株植物或者也包含重组多核苷酸的植物部分 中。提供通过使害虫暴露于微生物(无论细菌细胞或转基因植物细胞、 植物或植物部分，每一种均表达半翅目抑制量的eHTP)来控制半翅目 害虫的方法。重组多核苷酸可包含选自由以下组成的组的核苷酸序 列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ  ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID  NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID  NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID  NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID  NO:188、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:191、SEQ ID  NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID  NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID  NO:200、SEQ ID NO:201以及SEQ ID NO:203，或者可组装来编码本 发明的一种或多种蛋白质的其它序列。在某些实施方案中，重组多核 苷酸可进一步包含编码与由重组多核苷酸编码的eHTP不同的一种或 多种昆虫抑制试剂的核苷酸序列。转基因植物部分为种子、圆荚、叶、 花、花粉、茎、根或其任何部分。转基因植物部分可为种子、圆荚、 叶、花、茎或根的不可再生部分。还提供控制半翅目害虫的方法，所 述方法包括将转基因微生物、细菌、植物细胞、植物或植物部分暴露 于目标害虫，其中所述微生物、细菌、植物细胞、植物或植物部分表 达半翅目抑制量的由重组多核苷酸编码的eHTP。

还提供包含可检测量的编码eHTP或其任何区分的半翅目控制部 分的重组多核苷酸的处理的植物产品。此类处理的产品包括但不限于 植物生物质、油、膳食、动物饲料、面粉、玉米片、糠、皮棉、果壳 以及处理的种子。处理的产品可为不可再生的。

还提供通过将重组多核苷酸引入植物细胞中并且选择表达昆虫 抑制量的由所述重组多核苷酸编码的eHTP的转基因植物来制备转基 因植物的方法。所述方法包括将编码本文所提供的任何eHTP’s的重 组多核苷酸引入到植物细胞中以及选择表达昆虫抑制量的由所述重 组多核苷酸编码的eHTP的转基因植物。

本发明的其它实施方案、特征和优点通过以下详述、实施例和权 利要求书将为显而易见。

附图简述

图1示出针对eHTP蛋白质浓度绘图的草盲蝽属种类的死亡率。 图1A示出与包含天然发生的TIC807蛋白质的对照样品相比，响应 于各种浓度的四种不同eHTP’s的豆荚草盲蝽群体的死亡率。图1B 示出与包含天然发生的TIC807蛋白质的对照样品相比，响应于各种 蛋白质浓度的三种不同eHTP’s的美国牧草盲蝽群体的死亡率。

图2示出本发明的半翅目毒性蛋白的原子结构的带状图，其显示 所得有效变化的相对位置与TIC807或相关蛋白质内的相同氨基酸位 置的相对位置相比，增大毒性作用和/或扩大宿主范围特异性。两个 曲面片(surface patch)由带状图的原子结构内的球体环绕的特定残基 位置所示出：[1]一个球体相对于S95的β碳原子(相对于SEQ ID NO:2 中所列出的S95位置)具有约9.2埃至约12.2埃的原子半径；[2]另一 个球体相对于P219的β碳原子(相对于SEQ ID NO:2中所列出的P219 位置)具有约9.2埃至约12.2埃的原子半径。与在特定位置具有天然 发生的氨基酸的蛋白质相比，对属于这些球体内的带状结构中的氨基 酸的变化有效地引起毒性特性增强和宿主范围毒性作用扩大。

图3为示出彼此相比并且与天然发生的TIC807蛋白质相比，对 于十三种不同eHTP’s，草盲蝽属种类的群体死亡率的图表视图。

详述

本申请描述eHTP’s(工程化半翅目种类毒性蛋白)。本发明的 eHTP’s区别于蛋白质如TIC807、TIC853、Cry51Aa1和AXMI-171， 这些蛋白质为本领域已知的并且并不被认为处于术语eHTP的范围或 定义中，因为现有技术蛋白质未工程化为展示针对一种或多种半翅目 害虫种类的改进的毒性特性并且没有展示广泛宿主范围水平的抑制 活性。eHTP’s惊人地且意外地展示针对半翅目和相关害虫种类的高 水平毒性活性。发现这些eHTP’s甚至更意外和惊人的额外特征为， 与为本发明的eHTP’s提供基本基础的祖蛋白相比，这些蛋白质展示 更广泛的宿主范围的毒性特征。基础或基线支架毒素蛋白如TIC807 (SEQ ID NO:2)、Cry51Aa1(SEQ ID NO:8)、TIC853(SEQ ID NO:184) 以及AXMI-171(SEQ ID NO:206)不展示生物抗半翅目活性的宽度和 范围或者本发明的eHTP蛋白质的宿主范围。

测试超过2000种源于苏云金芽孢杆菌的半翅目毒性蛋白的不同 氨基酸序列变体，以确定本文所述的特定氨基酸插入、取代或缺失， 这些与基线支架蛋白TIC807、TIC853和Cry51Aa1的谱和活性相比， 赋予扩大半翅目种类宿主范围抑制谱并且还提供显著增大的半翅目 种类抑制活性。确定基线支架蛋白内的氨基酸残基以使得：(a)可进行 修饰以相对于一种或多种支架蛋白产生增大的半翅目抑制谱和/或提 高的草盲蝽抑制活性；(b)在展示一种或多种支架蛋白的折叠结构的折 叠昆虫抑制蛋白的曲面片中积累；和/或(c)在一种或多种支架蛋白氨 基酸序列的特定位置中发生，这有效引起用于控制半翅目种类和扩大 由eHTP蛋白质影响的半翅目种类的范围的所得eHTP蛋白平均有效 剂量减小。

半翅目害虫种类意图意指通过划破或刺入目标植物的表面来摄 食植物和植物组织，并且然后通过吸吮或吸入合并的渗出物来消耗在 划破或刺入位置合并的浸渍的植物渗出物的昆虫。此类昆虫包括成虫 和蛹，包括但不限于以下列出的植物臭虫：盲蝽科族、来自蝉科族的 蝉、来自叶蝉科族的叶蝉(例如，小绿叶蝉某些种(Empoasca spp.)芒果 叶蝉某些种(Amrasca spp.))、来自蜡蝉总科和飞虱科族的飞虱、来自 角蝉科族的角蝉、来自木虱科族的木虱、来自粉虱科族的粉虱、来自 蚜科族的蚜虫、来自根瘤蚜科的葡萄根瘤蚜、来自粉蚧科族的粉蚧、 来自介壳虫科、盾蚧科和硕介壳虫科族的介壳虫、来自网蝽科族的网 蝽、来自椿象科族的椿象、来自长蝽科族的美洲谷长蝽(cinch bug)(例 如，土长蝽属某些种(Blissus spp.))和其它长春、来自沫蝉科族的沫蝉、 来自缘蝽科族的南瓜虫、以及来自红蝽科族的红蝽和污棉虫。来自半 翅目的其它害虫包括拟绿蝽(Acrosternum hilare)(稻绿蝽)、南瓜缘蝽 (Anasa tristis)(南瓜虫)、美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterus  leucopterus)(美洲谷长蝽)、棉方翅网蝽(Corythuca gossypii)(棉网椿)、 Cyrtopeltis modesta(番茄椿)、Dysdercus suturellus(污棉虫)、Euschistus  servus(布朗椿象)、Euschistus variolarius(单点椿象(one-spotted stink  bug))、红腺长椿象某些种(Graptostethus spp.)(长蝽复合体)、 Leptoglossus corculus(缘蝽松子科(leaf-footed pine seed bug))、美国牧 草盲蝽(美国牧草盲蝽)、豆荚草盲蝽(豆荚草盲蝽(Western tarnish plant  bug))、稻绿蝽(Nezara viridula)(稻绿蝽(southern green stink bug))、美 洲稻蝽(Oebalus pugnax)(麦蝽(rice stink bug))、马利筋长蝽(Oncopeltus  fasciatus)(大马利筋长蝽)以及棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)(棉 跳盲蝽(cotton fleahopper))。更确切地说，叶蝉科族包括但不限于小绿 叶蝉族族，例如二点小绿叶蝉(Amrasca biguttula)、苯甲醛对叶蝉、 Austroasca viridigrisea、Asymmetrasca decedens、Empoasca decipiens、 Empoasca distinguenda、Empoasca dolichi、马铃薯小绿叶蝉(Empoasca  fabae)、Empoasca kerri、Empoasca kraemeri、Empoasca onukii、 Empoasca sakaii、Empoasca smithi、假眼小绿叶蝉(Empoasca vitis)、 Jacobiasca lybica、Sonasasca Solana；斑叶蝉族，例如，Empoascanara  nagpurensis、Thaiaassamensis、Zygnidia quyumi；Nirvaniae族，例如， Sophonia rufofascia；飞虱科族，例如，褐飞虱科(Nilapoarvata lugens)、 白背飞虱(Sogatella furcifera)、白脊飞虱(Unkanodes sapporonus)；以 及短足蜡蝉科族，例如，Zophiuma lobulata。

本发明的eHTP’s与一种或多种支架蛋白相比在七十二(72)个不 同氨基酸位置上包含氨基酸残基的一个或多个氨基酸序列修饰，包括 取代和缺失。此类修饰提供在与一种或多种支架蛋白相比时针对半翅 目昆虫具有增加的毒性和/或增大的抑制谱的eHTP’s，所述支架蛋白 包括但不限于TIC807(SEQ ID NO:2)或者相关蛋白如TIC807_M2 (SEQ ID NO:8)、Cry51Aa1(SEQ ID NO:182)以及TIC853(SEQ ID  NO:184)。eHTP’s包括但不限于在任何这七十二个位置上的至少一个 氨基酸取代或一个氨基酸缺失的修饰(在SEQ ID NO:180所列出的氨 基酸序列中被称为“X”)，但是不包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO:182或SEQ ID NO:184的氨基酸序列。本发明的eHTP’s 在与基线蛋白或者支架蛋白的谱和活性相比时还展示增大的半翅目 抑制谱和/或提高的半翅目抑制活性。

eHTP’s包括TIC807(SEQ ID NO:2)的相对位置的至少一个氨基 酸修饰，如以上段落[0009]所列出的。eHTP’s还可包括上述这些氨基 酸取代和/或缺失中的至少两个、三个、四个或更多个并且还可包括 这些氨基酸取代和/或缺失中的至少两个、三个、四个或更多个以及 在SEQ ID NO:2残基196-201内的任何三个连续氨基酸的缺失。因此， eHTP’s包括如下所列出的蛋白质：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ  ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID  NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID  NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID  NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID  NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID  NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID  NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID  NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID  NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID  NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID  NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID  NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID  NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID  NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID  NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID  NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID  NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID  NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID  NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID  NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID  NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID  NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID  NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID  NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID  NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID  NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID  NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID  NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID  NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID  NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID  NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID  NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID  NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID  NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID  NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID  NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID  NO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID  NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID  NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:202以及SEQ ID NO:204，或 者其昆虫抑制片段。

本发明的eHTP’s展示在至少一个氨基酸位置上不同于一种或多 种支架蛋白(包括SEQ ID NO:2(TIC807))的任何氨基酸序列，其中不 同氨基酸残基(i)与任何一种或多种支架蛋白中的相同残基位置相比 具有至少从约15％到至少约36％的相对氨基酸溶剂可及性；和/或(ii) 位于从与一种或多种支架蛋白的初始氨基酸序列内的对应氨基酸残 基位置相比具有至少从约15％到至少约36％相对溶剂可及性的氨基 酸的约3个连续氨基酸残基的距离内，并且在与一种或多种支架蛋白 相关联的活性相比时展示扩大的半翅目抑制谱和/或增大的半翅目抑 制活性。单词“增大的谱”意图意指，参照展示对特定单一害虫的毒性 作用的两种不同蛋白质，展示增大的谱的蛋白质展示对该特定单一害 虫以及处于相同系统发生目的一种或多种其它害虫以及在不同于特 定单一害虫所属的目的一种或多种不同系统发生目中的一种或多种 其它害虫的毒性作用。单词“增大的半翅目抑制活性”意图意指在标准 条件下，展示此类增大的活性的特定蛋白质需要比对照蛋白质更低量 的该蛋白质实现特定的影响，如死亡率、生长缓慢、发病率、进食停 止或者对特定单一害虫的另一种可测量的表型作用。

eHTP’s展示在位于折叠昆虫抑制蛋白的两个不同曲面片中的至 少一个内的至少一个氨基酸残基中不同于一种或多种支架蛋白(具体 包括TIC807)的氨基酸序列(参见图2和表3数据)。一个曲面片被限 定为包括涵盖于球体(图2，球[1])内的氨基酸残基，所述球体在该蛋 白质在生理条件下被折叠到三维结构中时相对于SEQ ID NO:2所列 出的Ser95β碳(Cb)原子具有约9.2埃至约12.2埃的原子半径；所述 氨基酸残基包括残基Thr93、Ser95、Ser97、Phe147、Gln149、Ser151、 Asn180、Thr182、Val251、Gln253以及Ser255。如本文所用短语“Cb 原子”是指氨基酸残基侧链上的β碳原子。因此，所述Cb原子为蛋白 质侧链中的第一个碳，其存在于所有氨基酸残基中，除Glycyl残基 之外。参照图1，eHTP’s可包括但不限于一种或多种支架蛋白、具体 为SEQ ID NO:2(TIC807)内的曲面片[1]氨基酸残基T93、S95、S97、 F147、Q149、S151、N180、T182、V251、Q253以及S255或者等效 氨基酸的一个或多个保守或非保守的取代。eHTP’s可包括但不限于 曲面片[1]氨基酸残基的一个或多个取代，如：T93A；S95A、S95V、 S95L或S95I；F147T、F147C、F147D、F147G、F147E、F147Y、F147M、 F147N、F147Q、F147H、F147R、F147W、F147P、F147A、F147V、 F147L或F147I；Q149A、Q149C、Q149F、Q149E或Q149D；S151A； N180D；T182A；V251E或V251A；和/或Q253R。其它或第二曲面 片已确定为接受有效地赋予提高的半翅目抑制生物活性的修饰的氨 基酸残基(本发明的eHTP’s形式)，所述第二曲面片当在生理条件下可 应用的支架蛋白中任一种折叠到三维结构中时，被限定为包括涵盖于 球体内的氨基酸残基，所述球体相对于一种或多种支架蛋白(具体地 为SEQ ID NO:2所列出的)的Pro219β碳原子或等效氨基酸位置具有 约9.2埃到约12.2埃的原子半径(图2，球体[2])，所述氨基酸残基包 括残基Val10、Ile14、Asn22、Asn23、Gly24、Ile25、Gln26、Gly27、 Phe30、Gln38、Ile39、Asp40、Thr41、Ile43、Ser193、Thr194、Glu195、 His196、Tyr197、Ser198、His199、Tyr200、Ser201、Gly202、Tyr203、 Pro204、Ile205、Leu206、Thr207、Trp208、Ile209、Ser210、Tyr216、 Ser217、Gly218、Pro219、Pro220、Met221、Ser222、Trp223、Tyr224、 Phe225、Asn239以及Val244。此类eHTP’s可包括但不限于在SEQ ID  NO:2(TIC807)的曲面片[2]内的一个或多个保守或非保守的氨基酸残 基取代和/或一个或多个氨基酸缺失，包括Val10、Ile14、Asn22、Asn23、 Gly24、Ile25、Gln26、Gly27、Phe30、Gln38、Ile39、Asp40、Thr41、 Ile43、Ser193、Thr194、Glu195、His196、Tyr197、Ser198、His199、 Tyr200、Ser201、Gly202、Tyr203、Pro204、Ile205、Leu206、Thr207、 Trp208、Ile209、Ser210、Tyr216、Ser217、Gly218、Pro219、Pro220、 Met221、Ser222、Trp223、Tyr224、Phe225、Asn239以及Val244。eHTP’s 可包括但不限于位于曲面片[2]内的氨基酸残基的一个或多个取代和/ 或缺失，如：序列中的任何三个连续氨基酸残基的缺失His196、 Tyr197、Ser198、His199、Tyr200、Ser201；Ser217Asn、Ser217Gln、 Ser217Arg；和/或Pro219Arg、Pro219Asn、Pro219Gln。eHTP’s可包 括但不限于曲面片[2]内的一个或多个氨基酸残基取代和/或缺失，如： 序列中的任何三个连续HisTyrSer残基的缺失His196、Tyr197、Ser198、 His199、Tyr200、Ser201；Ser217Asn、Ser217Gln、Ser217Arg；和/ 或Pro219Arg、Pro219Asn、Pro219Gln。eHTP可在折叠昆虫抑制蛋白 的两个上述曲面片中的每一个中具有至少一个氨基酸修饰。eHTP可 在相对于SEQ ID NO:2(TIC807)的残基T93、S95、F147、Q149、S151、 N180、T182、H196、Y197、S198、H199、Y200、S201、W208、S217、 P219、W223、N239、V244或V251处具有一个修饰或者多于一个修 饰的组合。可通过用相同类型的另一种氨基酸取代酸性、碱性、中性 极性或中性非极性类型的氨基酸进行保守氨基酸改变。可通过用不同 类型的氨基酸取代酸性、碱性、中性极性或中性非极性氨基酸类型进 行非保守氨基酸改变。此外，在表4B所列出的eHTP蛋白质中，所 有267都为在与一种或多种支架蛋白、包括支架蛋白TIC807比较时 对草盲蝽属某些种展示增大的毒性的氨基酸序列变体。与位于两个参 考曲面片之外的一种或多种支架蛋白相比，这些氨基酸序列变体中仅 十种展示修饰的氨基酸残基。

现有技术教导与支架蛋白有关的溶解性问题。eHTP’s与支架蛋 白相比展示提高的溶解度并且与观察到的一种或多种支架蛋白的溶 解度特性相比，大体上在小于9.0的pH下展示增大的溶解度。当eHTP 在大肠杆菌、植物细胞、植物细胞细胞质、植物细胞质外体或在植物 细胞的质体内表达或者靶向输入到植物细胞的质体中时，在更生理的 pH下，此增大的溶解度为明显的。相对于一种或多种支架蛋白、包 括SEQ ID NO:2(TIC807)提高溶解度的氨基酸修饰包括但不限于，在 一个TIC807的以下氨基酸位置中的一个或多个位置上的赖氨酸氨基 酸残基或者在任何其它支架蛋白中可应用的残基的取代：58、59、198、 199、201或202；或者在氨基酸位置198、248或301中的一个或多 个位置上的谷氨酸氨基酸残基的取代；或者在氨基酸位置246、250 或253中的一个或多个位置处的精氨酸氨基酸残基的取代。

还提供包含上述eHTP’s的昆虫抑制组合物。此类组合物可进一 步包括至少一种不同于组合物所包含的eHTP的另外的昆虫抑制剂。 昆虫抑制剂选自任何数目的昆虫抑制剂，包括昆虫抑制蛋白、昆虫抑 制dsRNA分子以及适用于控制昆虫害虫的一种或多种化学剂。另外 的抑制剂实例包括但不限于，TIC1415蛋白质、针对半翅目直系同源 的褐飞虱V-ATP酶-E的dsRNA、21E01、针对半翅目直系同源的肌 动蛋白直系同源的dsRNA、ADP/ATP移位酶、α-微管蛋白、核糖体 蛋白L9(RPL9)或者V-ATP酶A亚基、AXMI-171(US20100298207 A1)、Cry3A、Cry4Aa、Cry11Aa以及Cyt1Aa、DIG11、DIG5、Cry7、 eCry3.1Ab、mCry3A、Cry8、Cry34/Cry35、Cry3、DIG2、Cry1、Cr y1A.105、Cry2、Cry1F、VIP3、5307以及Cry9。适用于控制半翅目 种类的化学剂包括但不限于，除虫菊素和合成的除虫菊素；二嗪衍生 物；氯代烟碱基；硝基胍衍生物；三唑；有机磷酸酯；吡咯；吡唑； 苯基吡唑；双酰肼；生物/发酵产品；以及氨基甲酸酯。属于这些类 别的已知杀虫剂列出在The Pesticide Manual,第11版,C.D.S.To mlin,Ed.,British Crop Protection Council,Farnham,Surry,UK(19 97)中。

适用于本组合物的拟除虫菊酯包括除虫菊素和合成的除虫菊素。 优选用于本方法中的除虫菊素包括而不限于，2,2-二甲基-3-(2甲基丙 烯基)-环丙烷羧酸的2-烯丙基-4-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮酯和/或 (2-甲基-1-丙烯基)-2-甲氧基-4-氧代-3-(2丙烯基)-2-环戊烯-1-基酯以 及其顺式和反式异构体的混合物(化学文摘社登记号(“CAS RN”) 8003-34-7)。

优选用于本发明的合成的拟除虫菊酯包括4-氯α(1-甲基乙基)苯 乙酸(s)-氰基(3-苯氧基苯基)甲酯(氰戊菊酯，CAS RN 51630-58-1)、 (S)-4-氯-α-(1-甲基乙基)苯乙酸(S)-氰基(3-苯氧基苯基)甲酯(高氰戊菊 酯，CAS RN 66230-04-4)、(+)顺式-反式-3-(2,2-二氯乙烯基)-2,2-二甲 基环丙烷羧酸(3-苯氧基苯基)-甲酯(苄氯菊酯，CAS RN 52645-53-1)、 (+)-顺式,反式-3-(2,2-二氯乙烯基)-2,2-二甲基-环丙烷羧酸(±)α-氰基 -(3-苯氧基苯基)甲酯(氯氰菊酯，CAS RN 52315-07-8)、(β-氯氰菊酯， CAS RN 65731-84-2)、(θ氯氰菊酯，CAS RN 71697-59-1)、(±)顺式/ 反式3-(2,2-二氯乙烯基)2,2二甲基环丙烷羧酸S-氰基(3-苯氧基苯基) 甲酯(ζ-氯氰菊酯，CAS RN 52315-07-8)、(1R,3R)-3-(2,2-二溴乙烯 基)-2,2-二甲基环丙烷羧酸(s)-α-氰基-3-苯氧基苄酯(溴氰菊酯，CAS  RN 52918-63-5)、2,2,3,3,-四甲基环丙烷羧酸α-氰基-3-苯氧基苄酯(甲 氰菊酯，CAS RN 64257-84-7)、(R)-2-[2-氯-4-(三氟甲基)苯胺基]-3-甲 基丁酸(RS)-α-氰基-3-苯氧基苄酯(τ-氟胺氰菊酯，CAS RN 102851-06-9)、(2,3,5,6-四氟-4-甲基苯基)-甲基-(1α,3α)-(Z)-(±)-3-(2-氯 -3,3,3-三氟-1-丙烯基)-2,2-二甲基环丙烷羧酸酯(七氟菊酯，CAS RN 79538-32-2)、(±)-4-(二氟甲氧基)-α-(1-甲基乙基)苯乙酸(±)-氰基(3-苯 氧基苯基)甲酯(氟氰戊菊酯，CAS RN 70124-77-5)、3-[2-氯-2-(4-氯苯 基)乙烯基]-2,2-二甲基环丙烷羧酸氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲酯(氟氯 苯菊酯，CAS RN 69770-45-2)、3-(2,2-二氯乙烯基)-2,2-二甲基-环丙烷 羧酸氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲酯(氟氯氰菊酯，CAS RN 68359-37-5)、(β氟氯氰菊酯，CAS RN 68359-37-5)、(四氟苯菊酯， CAS RN 118712-89-3)、(Z)-(IR-顺式)-2,2-二甲基-3-[2-(2,2,2-三氟-三氟 甲基-乙氧基羰基)乙烯基]环丙烷羧酸(S)-α-氰基-3-苯氧基苄酯(氟丙 菊酯，CAS RN 101007-06-1)、-3-(2,2二氯乙烯基)-2,2-二甲基环丙烷 羧酸α-氰基-3-苯氧基苄酯(α-氯氰菊酯，CAS RN 67375-30-8)的(IR顺 式)S和(IS顺式)R对映体异构体对、[IR,3S)3(1'RS)(1',2',2',2'-四溴乙 基)]-2,2-二甲基环丙烷羧酸(s)-α-氰基-3-苯氧基苄酯(四溴菊酯，CAS  RN 66841-25-6)、2,2-二氯-1-(4-乙氧基苯基)环丙烷羧酸氰基-(3-苯氧 基苯基)甲酯(乙氰菊酯，CAS RN 63935-38-6)、3-(2-氯-3,3,3-三氟-1- 丙烯基)-2,2-二甲基环丙烷羧酸[1α,3α(Z)]-(±)-氰基-(3-苯氧基苯基)甲 酯(氯氟氰菊酯，CAS RN 68085-85-8)、3-(2-氯-3,3,3-三氟-1-丙烯 基)-2,2-二甲基环丙烷羧酸[1α(s),3α(z)]-氰基(3-苯氧基苯基)甲酯(λ 氯氟氰菊酯，CAS RN 91465-08-6)、3-(2-氯-3,3,3-三氟-1-丙烯基)-2,2- 二甲基-环丙烷羧酸(2-甲基[1,1'-二苯基]-3-基)甲酯(联苯菊酯，CAS  RN 82657-04-3)、5-1-苄基-3-呋喃基甲基-d-顺式(1R,3S,E)2,2-二甲基 -3-(2-氧代-2,2,4,5四氢硫代亚环己二烯基甲基)环丙烷羧酸酯(噻嗯菊 酯，RU15525,CAS RN 58769-20-3)、2,2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基) 环丙烷羧酸[5-(苯甲基)-3-呋喃基]-3-呋喃酯(苄呋菊酯，CAS RN 10453-86-8)、2,2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)环丙烷羧酸(1R-反 式)-[5-(苯基甲基)-3-呋喃基]甲酯(生物苄呋菊酯，CAS RN 28434-01-7)、3,4,5,6-四氢-苯二甲酰亚氨基甲基-(IRS)-顺式-反式-菊酸 酯(胺菊酯，CAS RN 7696-12-0)、3-苯氧基苄基-d,l-顺式,反式2,2-二 甲基-3-(2-甲基丙烯基)环丙烷羧酸酯(苯醚菊酯，CAS RN 26002-80-2)；(烯炔菊酯，CAS RN 54406-48-3)；(苯氰菊酯；CAS RN 39515-40-7)、(炔丙菊酯，CAS RN 23031-36-9)、(炔咪菊酯，CAS RN 72963-72-5)、(RS)-3-烯丙基-2-甲基-4-氧代环戊-2-烯基-(1A,3R； 1R,3S)-2,2-二甲基-3-(2-甲基丙-1-烯基)环丙烷羧酸酯(丙烯菊酯，CAS  RN 584-79-2)、(生物丙烯菊酯，CAS RN 584-79-2)以及(ZXI8901,CAS  RN 160791-64-0)。认为一种或多种上述合成的拟除虫菊酯的混合物也 可用于本发明。特别优选的合成的拟除虫菊酯为七氟菊酯、λ氯氟氰 菊酯、联苯菊酯、苄氯菊酯以及氟氯氰菊酯。甚至更优选的合成的拟 除虫菊酯为七氟菊酯和λ氯氟氰菊酯，并且更优选为七氟菊酯。

噁二嗪衍生物的杀昆虫剂适用于本发明。优选用于本发明的噁二 嗪衍生物为美国专利号5,852,012中所确定的那些衍生物。更优选的 噁二嗪衍生物为5-(2-氯吡啶-5-基甲基)-3-甲基-4-硝基亚氨基全氢化 -1,3,5-噁二嗪、5-(2-氯噻唑-5-基甲基)-3-甲基-4-硝基亚氨基全氢化 -1,3,5-噁二嗪、3-甲基-4-硝基亚氨基-5-(1-氧化-3-吡啶基甲基)全氢化 -1,3,5-噁二嗪、5-(2-氯-1-氧化-5-吡啶剂甲基)-3-甲基-4-硝基亚氨基全 氢化-1,3,5-噁二嗪；以及3-甲基-5-(2-甲基吡啶-5-基甲基)-4-硝基亚氨 基全氢化-1,3,5-噁二嗪。甚至更优选为噻虫嗪(CAS RN 153719-23-4)。

氯烟酰杀昆虫剂也适用于本发明。优选用于主题组合物中的氯烟 酰描述于美国专利号5,952,358中并且包括啶虫脒((E)-N-[(6-氯-3-吡 啶基)甲基]-N'-氰基-N-亚甲基咪唑酰胺(imidamide)，CAS RN 135410-20-7)、吡虫啉(1-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-硝基-2-咪唑二胺， CAS RN 138261-41-3)以及烯啶虫胺(N-[(6-氯-3-吡啶)甲基]-N-乙基 -N'-甲基-2-硝基-1,1-乙二胺，CAS RN 120738-89-8)。

硝基胍杀昆虫剂适用于本发明。此类硝基胍可包括美国专利号 5,633,375、5,034,404和5,245,040所述的那些。

适用于本发明的吡咯、吡唑和苯基吡唑包括美国专利5,952,358 所述的那些。优选的吡唑包括溴虫腈(4-溴-2-(4-氯苯基)-1-乙氧基甲基 -5-三氟甲基吡咯-3-甲腈，CAS RN 122453-73-0)、唑螨酯((E)-1,1-二 甲基乙基-4[[[[(1,3-二甲基-5-苯氧基-1H-吡唑-4-基)亚甲基]氨基]氧代] 甲基]苯甲酸酯，CAS RN 111812-58-9)以及吡螨胺(4-氯-N[[4-1,1-二甲 基乙基)苯基]甲基]-3-乙基-1-甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺，CAS RN 119168-77-3)。优选的苯基吡唑为氟虫腈(5-氨基-[2,6-二氯-4-(三氟甲 基)苯基]-4-[(1R,S)-(三氟甲基)亚磺酰基]-1H-吡唑-3-甲腈，CAS RN 120068-37-3)。

适用于本发明的双酰肼包括氯虫酰肼(4-氯苯甲酸酯-2-苯甲酰 -2-(1,1-二甲基乙基)-酰肼，CAS RN 112226-61-6)、甲氧虫酰肼 (RH-2485；N-叔-丁基-N'-(3-甲氧基-邻-甲苯酰)-3,5-木酰肼，CAS RN 161050-58-4)以及虫酰肼(3,5-二甲基苯甲酸1-(1,1-二甲基乙基)-2,(4- 乙基苯甲酰)酰肼，CAS RN 112410-23-8)。

三唑如氨基三唑(CAS RN 61-82-5)和唑蚜威适用于本发明的方 法。优选的三唑为唑蚜威([[1-[(二甲基氨基)羰基]-3-(1,1-二甲基乙 基)-1H-1,2,4-三唑-5-基]硫代]乙酸乙酯，CAS RN 112143-82-5)。

生物/发酵产品如阿维菌素(阿巴克丁，CAS RN 71751-41-2)和 多杀菌素(XDE-105，CAS RN 131929-60-7)适用于本发明。

有机磷酸酯杀昆虫剂也适用作本发明的组分之一。优选的有机磷 酸酯杀昆虫剂包括乙酰甲胺磷(CAS RN 30560-19-1)、毒死蜱(CAS RN 2921-88-2)、甲基毒死蜱(CAS RN 5598-13-0)、二嗪农(CAS RN 333-41-5)、苯线磷(CAS RN 22224-92-6)以及马拉硫磷(CAS RN 121-75-5)。

此外，氨基甲酸酯杀昆虫剂适用于本发明。优选的氨基甲酸酯杀 昆虫剂为涕灭威(CAS RN 116-06-3)、甲萘威(CAS RN 63-25-2)、卡巴 呋喃(CAS RN 1563-66-2)、杀线威(CAS RN 23135-22-0)以及硫双威 (CAS RN 59669-26-0)。

在本文描述化学杀昆虫剂时，应理解，该描述意图包括杀昆虫剂 的盐形式以及展示与所述杀昆虫剂形式相同的杀昆虫活性的杀昆虫 剂任何同分异构和/或互变异构形式。

适用于本发明的化学杀昆虫剂可为市场上销售的此类杀昆虫剂 的任何级别或纯度。在本发明和组合物中可容忍在商用制剂中作为杂 质伴随着杀昆虫剂的其它材料，只要此类材料不会使组合物不稳定或 者不会显著减少或损害任何杀昆虫剂组分或转基因事件对一种或多 种目标害虫的活性。杀昆虫剂生产领域的普通技术人员可容易确定可 容忍的那些杂质和不可容忍的那些杂质。

eHTP’s与氨基酸修饰有关，以使得修饰的蛋白质与母本蛋白质 TIC807相比展示针对草盲蝽属某些种、小绿叶蝉属某些种和/或芒果 叶蝉属某些种的增大的半翅目抑制谱和/或提高的半翅目抑制活性。 短语“更大活性的”、“提高的活性”、“增大的特异性”、“增加的毒性效 力”、“增加的毒性”、“提高的半翅目抑制活性”、“增大的半翅目抑制 活性”、“提高的草盲蝽属、小绿叶蝉属和/或芒果叶蝉属抑制活性”、“更 大的草盲蝽属、小绿叶蝉属和/或芒果叶蝉属抑制活性”、“更大的半翅 目抑制活性”以及“增大的草盲蝽属、小绿叶蝉属和/或芒果叶蝉属抑制 谱”和“增大的半翅目抑制谱”是指eHTP针对半翅目害虫的活性与 TIC807(SEQ ID NO:2)、TIC807_M2(SEQ ID NO:8)、Cry51Aa1(SEQ  ID NO:182)、TIC853(SEQ ID NO:184)和/或AXMI-171(SEQ ID  NO:206)蛋白质的活性比较，其中归因于本发明的eHTP的活性大于 归因于由TIC807蛋白质(SEQ ID NO:2)、TIC807_M2(SEQ ID NO:8)、 Cry51Aa1(SEQ ID NO:182)、TIC853(SEQ ID NO:184和/或AXMI-171 (SEQ ID NO:206)蛋白质的活性。本文所提供的eHTP’s在与SEQ ID  NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:184的苏云金芽 孢杆菌蛋白相比时，展示增大的半翅目抑制谱和/或提高的或更大的 半翅目抑制活性，其中半翅目害虫种类包括豆荚草盲蝽、美国牧草盲 蝽、马铃薯小绿叶蝉以及苯甲醛对叶蝉。苯甲醛对叶蝉也被称为 Amrasca biguttula biguttula。可通过很多不同方法确定与TIC807相比 展示增大的昆虫抑制谱和/或提高的昆虫抑制活性的eHTP’s。通常， 用于确定eHTP蛋白质的示例性和非限制性方法可包括：

(1)在控制的测定条件下向测试昆虫施用相同量的测试eHTP和 对照TIC807(SEQ ID NO:2)、TIC807_M2(SEQ ID NO:8)、Cry51Aa1 (SEQ ID NO:182)、TIC853(SEQ ID NO:184)和/或AXMI-171(SEQ ID  NO:206)蛋白质；以及测量和比较测试蛋白与对照蛋白的效力；和/ 或，

(2)确定在控制的测定条件下引出等效昆虫群体响应的测试 eHTP和对照TIC807(SEQ-ID NO:2)、TIC807_M2(SEQ ID NO:8)、 Cry51Aa1(SEQ ID NO:182)、TIC853(SEQ ID NO:184)和/或 AXMI-171(SEQ ID NO:206)蛋白质的蛋白质剂量(例如，食物中的蛋 白质浓度)(即，获得剂量响应曲线)。

在第二种方法中，用于比较的统计学上强剂量响应值可为杀死 50％测试群体所需要的半数致死浓度(LC50)。然而，在某些实施方案 中，可使用其它值，包括但不限于引起50％测试群体生长抑制所需要 的中间抑制浓度(“IC50”)。在此背景下，“生长抑制”可包括使半翅目 发育生长缓慢和/或抑制半翅目发育。

如本文所用短语“昆虫抑制量”是指包含一种药剂的组合物的量， 所述量有效于实现任何可测量的昆虫生存力、生长、昆虫发育、昆虫 繁殖、昆虫进食行为、昆虫交配行为的抑制和/或任何可测量的由昆 虫摄食包含所述药剂的组合物所引起的副作用的减少。类似地，“半 翅目抑制量”是指单独或者与其它药剂一起靶向可应用的半翅目种类 以进行控制的本发明的蛋白质的量，所述量引起任何可测量的属于半 翅目的涉及生存力、生长、发育、繁殖、进食行为、交配行为的目标 昆虫的抑制和或任何可测量的由半翅目昆虫摄食植物所引起的副作 用的减少。同样地，“草盲蝽属、小绿叶蝉属和/或芒果叶蝉属抑制量” 是指包含一种或多种本发明的蛋白质即eHTP’s或其它药剂的组合物 的量，所述量引起任何可测量的抑制、生存力、生长、发育、繁殖、 进食行为、交配行为和/或任何可测量的由草盲蝽属、小绿叶蝉属和/ 或芒果叶蝉属摄食包含该eHTP的组合物所引起的副作用的减少。如 本文在eHTP背景下所用的，“增大的半翅目抑制活性”或“更大的增大 的半翅目抑制活性”相对于使用一种或多种支架蛋白、包括TIC807、 Cry51Aa1(SEQ ID NO:182)、TIC853(SEQ ID NO:184)和/或AXMI-171 (SEQ ID NO:206)蛋白质观察到的对应抑制活性，是指任何可测量的 半翅目生存力、生长、发育、繁殖、进食行为、交配行为的抑制的增 加和/或任何可测量的通过半翅目摄食包含该eHTP的组合物所引起 的副作用的减少。同样地，“增大的草盲蝽属、小绿叶蝉属和/或芒果 叶蝉属抑制活性”或者“更大的增大的草盲蝽属、小绿叶蝉属和/或芒果 叶蝉属抑制活性”相对于使用仅包含可应用量的一种或多种支架蛋白 (包括但不限于TIC807(SEQ ID NO:2)、Cry51Aa1(SEQ ID NO:182)、 TIC853(SEQ ID NO:184)和/或AXMI-171(SEQ ID NO:206)蛋白质)的 等效组合物或植物所观察到的对应抑制活性，是指任何可测量的生存 力、生长、发育、繁殖、进食行为、交配行为的抑制的增加和/或任 何可测量的由一种或多种本发明的eHTP在提供于草盲蝽属、小绿叶 蝉属和/或芒果叶蝉属食物中的组合物或植物中的存在所引起的副作 用的减少。

如本文在eHTP背景下所用的，“增大的草盲蝽属、小绿叶蝉属 和/或芒果叶蝉属抑制谱”相对于使用TIC807蛋白质所观察到的特定 草盲蝽属某些种、小绿叶蝉属某些种和/或芒果叶蝉属某些种的对应 抑制，是指任何可测量的特定草盲蝽属某些种、小绿叶蝉属某些种和 /或芒果叶蝉属某些种生存力、生长、发育、繁殖、进食行为、交配 行为的抑制的增加和/或任何可测量的由草盲蝽属某些种、小绿叶蝉 属某些种和/或芒果叶蝉属某些种摄食植物所引起的副作用的减少。 在某些实施方案中，本文所提供的eHTP相对于TIC807展示增大的 草盲蝽属抑制谱，即那些eHTP’s可提供增加的美国牧草盲蝽抑制。

本文所提供的eHTP可展示比SEQ ID NO:2(TIC807)、SEQ ID  NO:8(TIC807_M2)、SEQ ID NO:182(Cry51Aa1)、SEQ ID NO:184 (TIC853)和SEQ ID NO:206(AXMI-171)蛋白质大约2倍至约260倍的 针对草盲蝽属、小绿叶蝉属和/或芒果叶蝉属害虫种类的草盲蝽属、 小绿叶蝉属和/或芒果叶蝉属抑制活性。本文所提供的eHTP可展示比 SEQ ID NO:2(TIC807)、SEQ ID NO:8(TIC807_M2)、SEQ ID NO:182 (Cry51Aa1)、SEQ ID NO:184(TIC853)和SEQ ID NO:206(AXMI-171) 蛋白质大约3倍、4倍、5倍、7倍、8倍、10倍、12倍、15倍、20 倍、25倍、27倍、30倍、38倍、46倍、50倍、52倍、54倍、66 倍、91倍、122倍、186倍、243倍或262倍的针对草盲蝽属、小绿 叶蝉属和/或芒果叶蝉属害虫种类的草盲蝽属、小绿叶蝉属和/或芒果 叶蝉属抑制活性。

eHTP’s可通过引起以下死亡率展示超过SEQ ID NO:2(TIC807)、 SEQ ID NO:8(TIC807_M2)、SEQ ID NO:182(Cry51Aa1)、SEQ ID  NO:184(TIC853)和/或SEQ ID NO:206(AXMI-171)的增大的目标害 虫抑制谱和/或提高的目标害虫抑制活性：

(i)在约0.3μg/mL至约70μg/mL剂量下，针对豆荚草盲蝽昆虫 种类；

(ii)在约0.85μg/mL至约100μg/mL剂量下，针对美洲牧草盲蝽 昆虫种类；

(iii)在约0.3μg/mL至约70μg/mL的LC50值下，针对豆荚草盲 蝽测量；

(iv)在约0.85μg/mL至约100μg/mL的LC50值下，针对美洲牧 草盲蝽测量；或者

(v)在低于TIC807、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:182(Cry51Aa1)、 SEQ ID NO:184(TIC853)和/或SEQ ID NO:206(AXMI-171)的LC50 值超过两倍的LC50值下，针对草盲蝽属某些种、小绿叶蝉属某些种 和/或芒果叶蝉属某些种测量；或者

(vi)在约0.69μg/mL至约500μ/mL的剂量下，针对苯甲醛对叶 蝉或马铃薯小绿叶蝉昆虫种类；或者

(vii)在约3.5μg/mL至约15μg/mL的LC50值下，针对苯甲醛对 叶蝉和/或马铃薯小绿叶蝉测量。

表4A和表4B用芒果叶蝉属和草盲蝽某些种死亡率数据将本发 明的示例性eHTP’s制成表格。可用于草盲蝽某些种和芒果叶蝉属某 些种的死亡率数据被报道为(a)μg/mL LC50值或者(b)％死亡率，对于 豆荚草盲蝽为在约1μg/mL至约3μg/mL剂量下，或者对于美洲牧草 盲蝽为在约100μg/mL蛋白质下并且对于苯甲醛对叶蝉为约0.69 μg/mL至500μg/mL。为示例性eHTP’s提供与TIC807(SEQ ID NO:2) 和TIC807_M2(SEQ ID NO:8)相比成倍增加的毒性，其中LC50值为 确定的。

本发明的eHTP’s与支架蛋白相比特别适用于控制半翅目昆虫。 美洲牧草盲蝽需要高剂量的TIC807蛋白质(例如，超过100μg/mL) 以引起死亡率。本发明的一种eHTP的剂量反应曲线，TIC807_M8 (SEQ ID NO:16)为展示针对美洲牧草盲蝽和豆荚草盲蝽二者的显著 提高的毒性作用的eHTP，但是针对美洲牧草盲蝽，所述eHTP展示 计算的223μg/mL的LC50值。以前不可能实现针对美洲牧草盲蝽种 类可引起大于50％死亡率的蛋白质浓度毒性剂量，因为在食物中提供 超过1000μg/mL的相当大剂量的TIC807和TIC807_M2蛋白质为不 可能的。因此，没有确定TIC807和TIC807_M2(SEQ ID NO:8)蛋白 质针对美洲牧草盲蝽的LC50值，而是估计为大于(>)223μg/mL(参 见表1和表3、实施例4和图1B)。

迭代设计是指用于开发和选择eHTP’s的半随机方法，包括工程 化、测试和选择的组合(不需要以该顺序)(参见实施例1至4)。单词“工 程化”意图包括确定修饰的相关残基、克隆和表达本文所述的eHTP’s。 单词“测试”意图是指比较eHTP的半翅目活性与支架蛋白如TIC807 (SEQ ID NO:2)、TIC807_M2(SEQ ID NO:8)、Cry51Aa1(SEQ ID  NO:182)和/或TIC853(SEQ ID NO:184)的活性；或者比较本发明的 eHTP与另一种蛋白质如AXMI-171(SEQ ID NO:206)。单词“选择”意 图是指识别本发明的改进的变体蛋白(即eHTP’s)和可应用的氨基酸 残基以进行工程化的行为。

迭代设计包括说明本发明的蛋白质的原子结构(例如，如图2所 列出的)和使用原子结构引导并补充“选择”氨基酸残基进行修饰以“工 程化”的半随机方法，并且在此情况下，包括识别在折叠的昆虫抑制 支架蛋白如TIC807、TIC853和Cry51Aa1的环和表面暴露区域内的 氨基酸残基，所述支架蛋白可进行修饰以赋予提高的昆虫抑制谱和活 性。选择在环内和表面暴露区域内的此类氨基酸残基用于“工程化”。 在此情况下，迭代设计包括识别在具有相关氨基酸残基积累的支架蛋 白的三维结构内的两个不同区域，所述支架蛋白在修饰成包含不同于 出现在天然发生的支架蛋白的那些位置上的那些氨基酸残基的氨基 酸残基时形成本发明的一种或多种eHTP蛋白质。

最初，将支架蛋白TIC807(SEQ ID NO:2)用于此迭代设计的过程 中，并且发现267种不同eHTP’s与支架蛋白TIC807相比展示增加的 草盲蝽属某些种的抑制活性。在设计过程的早期轮次发现TIC807_M8 (SEQ ID NO:16)。随后轮次的迭代工程化测试选择引起其它eHTP蛋 白质的发现，这些eHTP蛋白质在与支架蛋白相比时展示针对草盲蝽 属种类的更大水平的毒性并且也展示更广泛的毒性作用宿主范围。七 种变体(eHTP’s)在与TIC807相比时展示针对草盲蝽属种类(豆荚草盲 蝽和美洲牧草盲蝽)的显著更高水平的增加的毒性。确定针对豆荚草 盲蝽和美洲牧草盲蝽的这七种和本文所构建的其它eHTP’s的LC50 值，并且将其与支架蛋白、特别为TIC807的LC50值进行比较。表1 示出结果并且图3为以图表方式示出表1所列出的结果的条形图。

表1.选择的eHTP’s与TIC807相比的LC50值

ND＝未确定。通过向新孵化的草盲蝽若虫群体提供8至10种不 同蛋白质浓度，允许若虫进食5天并且然后对超过所提供的剂量范围 的死亡率进行评分来确定LC50值。

*毒性使用观察到的TIC807 LD50作为基线值1，根据与针对豆 荚草盲蝽观察到的水平相比多个增加的活性显示。超过1000μg/mL 的显著大量的蛋白质不能提供在草盲蝽属食物中，以便完成响应于豆 荚草盲蝽的高毒性剂量范围。因此，没有确定TIC807或TIC807_M2 的LC50值。相反，在低范围内进行4-剂量LC50评估，证明预期的 TIC807和TIC807_M2的LC50值大于223μg/mL。

参照表1，迭代设计过程提供用于识别展示不仅针对豆荚草盲蝽 而且针对美洲牧草盲蝽的提高的毒性特征的蛋白质的手段。

还提供编码eHTP’s的重组多核苷酸组合物。在某些实施方案中， 可用重组DNA构建体表达eHTP’s，在所述构建体内具有开放阅读框 的多核苷酸分子可操作地连接至在所述构建体意图的系统内的表达 中起作用的元件如启动子和任何其它调节元件。例如，植物功能启动 子可以可操作地连接至可应用的eHTP编码序列，以使蛋白质在植物 中表达。在细菌内起作用的启动子也涵盖用于表达盒内。在可应用细 菌例如大肠杆菌或苏云金芽孢杆菌种类中起作用的启动子可以可操 作地连接至eHTP编码序列中，以使可应用蛋白质在可应用细菌菌株 内表达。可以可操作地连接至eHTP编码序列的其它有用元件包括但 不限于，增强子、内含子、前导序列、编码的蛋白质固定标签(HIS- 标签)、编码的亚细胞易位肽(即，质体转运肽、信号肽)、翻译后修饰 酶的编码的多肽位点、核糖体结合位点以及设计用作RNAi触发物以 抑制植物或特定目标害虫种类内的一种或多种基因的区段。

本文所提供的示例性重组多核苷酸分子包括但不限于，SEQ ID  NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189、SE Q ID NO:190、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:1 93、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ I D NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、 SEQ ID NO:35以及SEQ ID NO:201。这些序列编码各自具有以下 所列出的氨基酸序列的对应蛋白质：SEQ ID NO:4(TIC807_4)、SE Q ID NO:6(TIC807_M1)、SEQ ID NO:8(TIC807_M2)、SEQ ID  NO:10(TIC807_M3)、SEQ ID NO:12(TIC807_M4)、SEQ ID NO: 14(TIC807_M5)、SEQ ID NO:16(TIC807_M8)、SEQ ID NO:18(T IC807_M6)、SEQ ID NO:20(TIC807_M7)、SEQ ID NO:22(TIC80 7_22)、SEQ ID NO:24(TIC807_24)、SEQ ID NO:26(TIC807_26)、 SEQ ID NO:28(TIC807_M9)、SEQ ID NO:30(TIC807_M10)、SE Q ID NO:32(TIC807_M11)、SEQ ID NO:36(TIC807_M12)以及SE Q ID NO:34(TIC807_M13)。由于遗传密码的冗余性，编码本发明的 蛋白质的重组多核苷酸分子的密码子可被同义密码子取代(也称为沉 默取代)；并且处于本发明的范围内。因此提供编码本文所公开的任 何eHTP’s的重组多核苷酸。

包含eHTP编码序列的重组DNA构建体还可进一步包括编码一 种或多种昆虫抑制剂的DNA区域，所述昆虫抑制剂可配置成连同编 码可应用eHTP(为不同于eHTP的蛋白质)或者昆虫或植物基因抑制 dsRNA分子的DNA序列共表达。可组装重组DNA构建体，以使得 设计成从特定构建体表达的所有药剂从一个启动子表达或者以使得 单独的药剂各自处于单独的启动子控制下或者其一些组合。本发明的 蛋白质可由多基因表达系统表达，在所述表达系统中一种或多种蛋白 质由共同核苷酸区段表达，在所述核苷酸区段上根据所选择的表达系 统类型也包含其它开放阅读框和/或启动子。

可通过载体例如质粒、杆状病毒、人工染色体、病毒体、粘粒、 噬菌粒、噬菌体或病毒载体将包含eHTP编码序列的重组核苷酸或重 组DNA构建体递送到宿主细胞内。此类载体可用于实现eHTP编码 序列在宿主细胞内的稳定或瞬时表达；并且如果可能，随后表达成多 肽。包含eHTP编码序列并且引入到宿主细胞内的外源性重组多核苷 酸或重组DNA构建体在本文中也被称为“转基因”。

因此还提供包含任何重组多核苷酸(即，转基因)的表达任何一种 或多种eHTP编码序列的转基因细菌、转基因植物细胞、转基因植物 以及转基因植物部分。意图在于，“细菌细胞”或“细菌”可包括但不限 于，土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属、埃希氏菌属 (Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)或 者根瘤菌属(Rhizobium)细胞。意图在于，“植物细胞”或“植物”包括苜 蓿、巴旦杏(almont)，香蕉、大麦、豆、甜菜、西兰花菜、包菜、 芸苔、茄子、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、 芹菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗 松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、瓜尔豆、啤酒花、韭葱、豆科 植物、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、油桃、坚果、燕麦、秋葵、橄榄、 洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、木瓜、豌豆、桃、花生、胡椒、木 豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根 茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、 糖甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、 番茄、黑小麦、草坪草、西瓜以及小麦植物细胞或植物。在某些实施 方案中：提供由转基因植物细胞生成的转基因植物和转基因植物部 分；转基因植物可从转基因种子获得；转基因植物部分可通过切割、 咬断、磨碎或以其它方式使所述部分从植物中分离来获得；所述植物 部分可为种子、圆荚、叶子、花、茎、根或其任何部分；并且本文所 提供的转基因植物部分为转基因植物部分的不可再生部分。如在此背 景下所用的，转基因植物部分的“不可再生”部分为不能诱导来形成全 植物或者不能诱导来形成能够有性和/或无性繁殖的全植物的部分。 植物部分的不可再生部分为转基因花粉、胚珠、种子、圆荚、叶、花、 茎或根的部分。

本文还提供制备包含昆虫或草盲蝽属和/或芒果叶蝉属抑制量的 eHTP的转基因植物的方法。此类植物可通过将编码本文所提供的任 何eHTP的重组多核苷酸引入到植物细胞内并且选择源于所述植物细 胞的表达昆虫或半翅目抑制量的eHTP’s的植物来制备。植物可通过 再生、种子、花粉或分生组织转化技术而来源于植物细胞。

提供表达昆虫或半翅目抑制量的eHTP以控制昆虫或半翅目侵染 的转基因植物和宿主细胞。任何上述植物种类可用于保护植物使其免 于本文所提供的昆虫或半翅目侵染的影响，只要用设计为表达可应用 的eHTP的多核苷酸构建体转化所述植物。

本发明的其它方面包括抗体、试剂盒、用于检测编码eHTP’s或 其区分片段的多核苷酸或者eHTP’s或其区分片段的方法、用于识别 本发明的蛋白质属的其它昆虫抑制成分的方法、用于控制昆虫生长和 /或侵染的制剂和方法以及用于对植物和其它受体宿主提供此类控制 的方法。每种组合物、构建体、细胞、植物、制剂、方法或试剂盒例 如通过经由商业使用任何这些蛋白质抑制昆虫来增大植物产量，从而 提供本发明的蛋白质的工业应用。

除种子或果实或蔬菜之外的植物产品意图用作通过商业移动并 且源于转基因植物或转基因植物部分的商品或其它产品，其中所述商 品或其它产品可通过检测与本发明的eHTP对应并且产生于或者保持 于从中获得所述商品或其它产品的植物或植物组织或部分中的核苷 酸区段、RNA或蛋白质进行商业追踪。此类商业商品或其它产品包 括但不限于，植物部分、生物质、油、膳食、糖、动物饲料、面粉、 玉米片、糠、皮棉、处理的种子以及种子。植物部分包括但不限于， 植物种子、圆荚、叶、花、茎、花粉或根。在某些实施方案中，植物 部分可为所述种子、圆荚、叶、花、茎、花粉或根的不可再生部分。 还提供包含eHTP’s的棉花和亚麻树花粉以及其不可再生部分。

因此还提供包含可检测量的eHTP、其昆虫抑制片段或其任何区 分部分的处理的植物产品。在不希望受到理论约束的情况下，认为在 某些实施方案中，包含可检测量的一种或多种本文所提供的eHTP’s 的此类处理的植物产品显示可由半翅目传送的不希望的微生物的减 少和/或此类微生物的不希望的副产品的减少。在某些实施方案中， 其区分部分可包括SEQ ID NO:180所列出的至少约20个至约100个 或更多个连续氨基酸的任何多肽，具体地为其中所述多肽不包含存在 于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:182或SEQ ID NO:184 中的连续氨基酸的对应多肽，并且其中所述多肽在SEQ ID NO:2所列 出的对应氨基酸序列中包含至少一个氨基酸取代、添加或缺失。此类 取代、缺失或添加为以上段落[0009]中所列出的那些。

提供包含可检测量的编码eHTP的重组多核苷酸、eHTP或其昆 虫抑制片段或其任何区分部分的处理的植物产品。所述处理的产品选 自由以下组成的组：植物生物质、油、膳食、动物饲料、面粉、玉米 片、糠、皮棉、果壳以及处理的种子。

通过在农作物中提供编码本发明的一种或多种eHTP’s的重组多 核苷酸序列来控制农作物的半翅目侵染。此类转基因作物产生或者经 过处理来包含昆虫或半翅目抑制量的可应用eHTP，并且通过以下各 项用足够的eHTP渗透此类作物：(i)将包含或编码eHTP的任何组合 物应用于植物或生成植物的种子；和/或(ii)用编码eHTP的多核苷酸 转化植物或者生成种子并最终生成植物的植物细胞。所述植物可为包 含表达昆虫或半翅目抑制量的eHTP的转基因的瞬时或稳定转化的转 基因植物。所述植物可为包含eHTP的组合物所应用的非转基因植物。 在此类方法中，所述植物为双子叶植物，并且更确切地说可为棉花、 大豆或苜蓿植物。半翅目昆虫包括成虫和若虫，例如但不限于以上段 落[0020]所列出的臭虫列表。

优选地，草盲蝽属某些种为豆荚草盲蝽或美洲牧草盲蝽，小绿叶 蝉属某些种为马铃薯小绿叶蝉并且芒果叶蝉属某些种为苯甲醛对叶 蝉。

本发明的其它特征和优点通过以下详述、实施例和权利要求书将 为显而易见。

实施例

根据上述内容，本领域技术人员应了解，在不脱离本发明的精神 和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的特定方面 中做出改变。因此，本文所公开的特定详情将不被解释为限制性的。 本申请要求其优先权的权益的美国临时申请序列号61/621,436、段落 [0002]中引用的序列表、以及本发明公开和要求保护的所有参考材料、 具体地为本申请中引用的参考文献和公开的专利申请以引用的方式 整体并入本文。

实施例1：迭代工程化-测试-选择方法

此实施例示出用于识别和描述昆虫抑制蛋白的迭代工程化-测试- 选择方法的随机、组合和发明方面(也可称为“递归”)，所述昆虫抑制 蛋白与TIC807(SEQ ID NO:2)相比展示半翅目和/或杀线虫活性或者 增加的对半翅目昆虫种类的毒性。若干种设计方法用于工程化具有较 大针对草盲蝽属种类的抑制活性的eHTP’s；方法包括但不限于半随 机修饰、在TIC807与其它天然Bt蛋白质的比对中变异的定向修饰以 及结构/功能辅助设计。进行多轮工程化和测试(连续地和同时地)以选 择展示增加的毒性的TIC807蛋白质变体。在收集数据时调整设计方 法。此迭代工程化-测试-选择方法还包括但不限于包括以下的步骤： 克隆、表达、纯化以及生物测定测试与eHTP’s相比的TIC807对照蛋 白。

大约267种示例性的与TIC807相比展示增加的草盲蝽属毒性的 eHTP’s从超过2000组测定提高的昆虫抑制活性的候选eHTP’s(即“测 试”蛋白)中获得。测试的候选eHTP’s的实际总数目远远超过2000， 因为测试包括编码多种源于库诱变(在选择过程中没有测序)的候选 eHTP’s的重组核苷酸区段。

根据测试目的和所需测试生产量制备不同数量和纯度的蛋白质 储备。例如，制备较低量和较低纯度的蛋白质制剂以用于在生物测定 中选择较高数目的变体。为高能生物测定制备大量的和较高纯度的蛋 白质储备。说明作为改进的变体的主要相关的残基位置的倾向于高能 生物测定的测试。最初，对豆荚草盲蝽测试约2000种变体。基于来 自豆荚草盲蝽的数据，设计大约600种变体并且然后对美洲牧草盲蝽 进行进一步测试。这些变体中约267种变体(表4B)在与TIC807相比 时证明针对豆荚草盲蝽和/或美洲牧草盲蝽的增加的毒性。这267种 变体包括已确认实针对两种草盲蝽属种类的增加的毒性的二十二种 (22)变体。另外的确认和剂量反应测试使选择变窄至七种(7)变体，这 些变体随后使用8-剂量重复生物测定确定针对两种草盲蝽属种类的 LC50值来表征。

选择方法包括动态更新测试数据、不断调整工程化方法以及进行 迭代轮次。同时地，采用劳动密集型克隆、蛋白质表达、蛋白质纯化 以及生物测定实验来测试候选eHTP’s。

实施例2：工程化方法

基于比对的方法

Cry51的蛋白质组成的多个序列比对：Cry51Aa1(SEQ ID  NO:182)、TIC853(SEQ ID NO:184)和TIC807(SEQ ID NO:2)用于确 定可变性区域，例如相对于SEQ ID NO:2(TIC807)的位置195至201 和位置211至219。这些区域通过使用编码这些区域内的任意氨基酸 残基的简并寡核苷酸引物来靶向饱和诱变。制备构建体库以用于随后 在宿主细胞内进行蛋白质表达。

Cry51Aa1(SEQ ID NO:182)、TIC853(SEQ ID NO:184)和TIC807 (SEQ ID NO:2)的多次序列比对与BLOSUM 80替代矩阵结合来用于 计算TIC807的每个位置变体的平均成对距离。使用编码特定氨基酸 残基的简并寡核苷酸引物使具有较低平均成对距离的残基位置用替 代氨基酸残基取代，所述替代氨基酸残基例如G28X、G31X、F46X、 E125X、F138X、F147X、S167X、Y216X、P218X、G234X、T247X、 D268X以及T308X，。制备构建体库以用于随后在宿主细胞内进行蛋 白质表达。

扫描方法

多核苷酸构建体被工程化为在SEQ ID NO:2(TIC807)全长的每 个可能的位置上表达单一丙氨酸取代或双丙氨酸取代(丙氨酸-<母本 丙氨酸>-丙氨酸)。对于假设的实施例，参见表2。

表2.单一丙氨酸和双丙氨酸的假设实施例在包含氨基酸序列X XXXAXX的支架蛋白上扫描。

  单一丙氨酸扫描 双丙氨酸扫描 1 AXXXaXX AXAXaXX 2 XAXXaXX XAXAaXX 3 XXAXaXX XXAXSXX 4 XXXAaXX XXXAaAX 5 XXXXSXX XXXXSXA 6 XXXXaAX - 7 XXXXaXA -

X＝母本残基

a＝母本残基为丙氨酸残基

A＝对丙氨酸残基进行修饰

S＝对丝氨酸残基进行修饰

在丙氨酸残基已存在于TIC807中的情况下，反而取代丝氨酸。 通过在赋予增加的毒性的那些丙氨酸取代的残基中组合诱变和饱和 诱变来进一步测试与TIC807相比展示增加的毒性的蛋白质变体。还 在具有来自先前迭代轮次的工程化-测试-选择的积累的修饰的改进的 组合变体、例如具有突变F46S、Y54H、S167R、S217N的TIC807_M2 (SEQ ID NO:8)上进行扫描方法，并且通过另一轮次的单一丙氨酸取 代对残基范围196-201内的连续三重缺失进行进一步工程化，以对改 进的TIC807_M2进行进一步改进。确定主要相关的残基并且通过组 合诱变和饱和诱变进行进一步测试(例如，A150X、E125X、E155X、 F147X、I134X、N157X、Q149X、T133X、E135X以及N137X)。通 过这些组合方法工程化的变体与TIC807相比展示对增加的毒性的进 一步提高并且与利用TIC807(SEQ ID NO:2)原子结构的其它设计方 法进一步组合。

表面暴露的残基

在迭代工程化-测试-选择方法中间确定本发明的蛋白质的原子结 构；并且使用Molsoft’s ICM-Browser(Molsoft L.L.C.,11199Sorrento  Valley Road,S209,San Diego,CA 92121)确定每个残基的相对溶剂可 及性(％SA)。在表3的列(A)和列(B)中显示，对具有SEQ ID NO:185 (TIC807_L11M)和SEQ ID NO:8(TIC807_M2)所列出的相对氨基酸序 列的蛋白质计算实际％SA。预测的TIC807和TIC853残基的％SA分 别列出在表3的列(A)和列(C)中。总之，表3中报道的％SA值被计算 为通过水分子探测的溶剂可及表面区域的百分比，所述溶剂可及表面 区域大于在原子结构的每个位置上的每个残基的标准伸展构造 (Gly-XXX-Gly)中的最大溶剂可及区域。表3通过在Clustal W比对中 的比对的残基比对每种蛋白质的残基。在每种残基的标准伸展构造 (Gly-XXX-Gly)的最大溶剂可及区域小于由水分子探测的实际溶剂可 及区域时，可出现大于100的％SA。在表中大于100的％SA被报道 为100％。

本文所述的组合工程化-测试-选择方法引起多种主要相关的残 基，所述残基累积于在SEQ ID NO:2(TIC807)的P219的Cb原子周围 具有约9.2埃-12.2埃半径的残基的曲面片(图2的[2])中：SEQ ID NO:2 (TIC807)的V10、I14、N22、N23、G24、I25、Q26、G27、F30、Q38、 I39、D40、T41、I43、S193、T194、E195、H196、Y197、S198、H199、 Y200、S201、G202、Y203、P204、I205、L206、T207、W208、I209、 S210、Y216、S217、G218、P219、F220、M221、S222、W223、Y224、 F225、N239以及V244。至少这些残基的一半展示大于或等于十五(15) 的％SA值。

表3.eHTP’s和支架蛋白的氨基酸的相对％溶剂可及性(SA)。

P1指示图2的曲面片[1]中的氨基酸。

P2指示图2的曲面片[2]中的氨基酸。

*指示本文所述的72个主要相关的氨基酸之一(参见图2)。

示出通过Clustal W比对的TIC807_L11M、TIC807_M2和TIC853 的残基。

用#标记的数字代表至少约36％的％SA。

受体结合

具有大于36％的％SA值的残基或者处于具有大于36％的％SA的 残基的3个残基内的曲面片(图2的[1])(半径相对于SEQ ID NO:2 (TIC807)的S95的Cb原子为约9.2埃至12.2埃)被确定为包含TIC807 蛋白质的区域，所述TIC807蛋白质可进行取代以提供展示增大的草 盲蝽抑制谱和/或提高的草盲蝽抑制活性的eHTP’s，此曲面片可能与 目标昆虫受体结合活性相关联；并且包括SEQ ID NO:2(TIC807)的残 基T93、S95、S97、F147、Q149、S151、N180、T182、V251、Q253 以及S255。eHTP’s可包括但不限于,曲面片1氨基酸残基的一个或多 个取代，如S95A、F147A、Q149E和/或V251A。

本文所述的组合工程化-测试-选择方法确定位于曲面片1中的残 基，所述曲面片1在取代或以其它方式修饰时可提供eHTP’s。这些 残基对于eHTP’s与草盲蝽昆虫肠道内的受体的产生性结合以提供与 TIC807相比增大的草盲蝽抑制谱和/或提高的草盲蝽抑制活性可为重 要的。可提供eHTP’s的曲面片1氨基酸残基的修饰包括提供偏好结 合可见于昆虫糖基化受体中的糖基的芳香基和/或氢键基的取代。

膜结合

从TIC807的原子结构中确定位于蛋白质的β折叠区域中的某些 氨基酸并且用芳香族残基取代。更确切地说，折叠的TIC807β折叠区 域的氨基酸L78、I123、H270、R273、I275用苯丙氨酸、酪氨酸或色 氨酸取代。R273和I275的芳香族氨基酸取代处于提供增大的草盲蝽 抑制谱和/或提高的草盲蝽抑制活性的那些残基中(参见表4，SEQ ID  NO:32、34、68、92和122的数据)。在这些位置中的氨基酸侧链残 基可能与目标害虫的膜相互作用。

蛋白水解活化位点

用丝氨酸取代通常认为涉及蛋白水解的甘氨酸残基，以改变蛋白 水解裂解动力学。甘氨酸残基在环区域内的存在可给予更大的灵活性 和因此对蛋白水解的敏感性，这可增加昆虫抑制活性或者减小昆虫抑 制活性。用甘氨酸残基取代结构确定的区域内的残基，并且没有观察 到改进。用丝氨酸(小残基)取代已为甘氨酸的环中的位置(例如，G18、 G24、G27)，以试图减少蛋白水解的敏感性，并且没有观察到改进。

组合的结构设计方法

TIC807(SEQ ID NO:2)的原子结构用于确定用于库诱变的环区 域，随后测试工程化的变体。对SEQ ID NO:2(TIC807)的氨基酸位置 211-216处的环进行库诱变和测试。对紧密靠近SEQ ID NO:2(TIC807) 的氨基酸位置75-83、161-167和267-276的连续环进行库诱变和测试。

TIC807的原子结构的分析表明在SEQ ID NO:2的残基113-138 处的结构环残基被工程化为使所述环稳定和不稳定。

在跨越由短环连接的两条β链的另一个区域中，两条β链在相对 于SEQ ID NO:2的位置116至121和位置133至138处展示疏水性和 亲水性氨基酸残基的交替模式，其特征为成孔环。对表达库进行工程 化，以用所述库中总计288种可能的变体的对应组合 116V/Y/L/H/F/D、118V/Y/L/H/F/D和120I/D/F/H/L/N/V/Y修饰两条β 链区段置换残基V116、V118和I120。重复此程序：用243种可能的 变体的对应组合117S/A/D/E/G/K/N/R/T、119S/A/D/E/G/K/N/R/T和 121P/S/T修饰残基S117、S119和P121；用252种可能的变体的对应 组合133I/D/F/N/V/Y、135A/D/F/H/L/V/Y和137F/D/H/L/V/Y修饰残 基I133、A135和F137；以及用486种可能的变体的对应组合 134T/A/D/E/G/K/N/R/S、136E/A/D/G/K/N/R/S/T和138N/A/D/G/S/T 修饰残基T134、E136和N138。增大的草盲蝽抑制谱和/或提高的草 盲蝽抑制活性与表4所示出的这些取代中的一些取代相关。

结构-功能关系

总之，对超过2000种表达TIC807的变体的克隆(包括混合的库 克隆)测试与TIC807相比针对草盲蝽某些种的增大的草盲蝽抑制谱 和/或提高的草盲蝽抑制活性。半随机修饰、定向修饰和预测性结构- 功能修饰(包括结构模型、受体结合可能性、金属结合可能性、低聚 反应可能性、表面电荷分布、孔形成可能性、离子通道功能以及曲面 暴露片的识别)的目的在于确定与TIC807相比具有增大的草盲蝽抑 制谱和/或提高的草盲蝽抑制活性的eHTP’s。对这些克隆进行表达以 用于生物测定测试。

实施例3：TIC807(包括变体和片段)的蛋白质表达和纯化

对照蛋白质TIC807为全长309个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质 可以结晶形式在苏云金芽孢杆菌(Bt)中表达或者以聚集体形式在大肠 杆菌中表达。其测试变体在Bt中重组表达。TIC807和TIC807的变 体的表达特征分别为从Bt和大肠杆菌细胞中提取的主要结晶和聚集 体形式。为了测试草盲蝽生物活性，通过将样品溶解于25mM碳酸 钠缓冲液中并且经由离心作用去除不溶的材料来制备适用于草盲蝽 生物测定的测试样品和对照样品。使用总蛋白质方法，例如Bradford 测定、ELISA方法或类似方法测量测试样品和对照样品中的蛋白质的 量。将凝胶电泳用于确定稳定的重组蛋白质的纯度和储备浓度。对 C-末端HIS-标记的TIC807蛋白质进行工程化，以促进大量TIC807 对照蛋白质的检测、纯化和定量。单独地测定C-末端HIS-标记的 TIC807和未标记的TIC807测试样品并且确认具有针对草盲蝽的等效 活性(参见实施例4、5和6)。

对TIC807_M13(SEQ ID NO:34)进行定点氨基酸取代，以提高 可溶形式的表达。发明人假定本发明的更容易溶解的蛋白质变体可促 进表达和纯化，例如在大肠杆菌宿主细胞表达；并且在植物宿主细胞 内表达时可增加昆虫抑制效力。以三种不同方式对编码TIC807_M13 (SEQ ID NO:34)的重组DNA构建体进行工程化，以反映三种不同的 变体：相对于TIC807_M13，对于变体#1的修饰为：I58K和P59K， 对于变体#2为：S198K和G199K，并且对于变体#3为：S246R、V248E 和Q250R。相对于TIC807(SEQ ID NO:2)，对于变体#1，修饰可以可 选地为如以下所述的：I58K和P59K，对于变体#2为：S201K和G202K， 并且对于变体#3为：S249R、V251E和Q253R；此位置差异由于在 TIC807_M13(SEQ ID NO:34)所反映的SEQ ID NO:2(TIC807)残基范 围196-201中的连续三重缺失而为叠合的。各自对四种工程化重组 DNA构建体进行克隆并且在大肠杆菌内表达。通过coomassie染色的 SDS-PAGE评价来自四种大肠杆菌制备物的可溶部分，这显示 TIC807_M13(SEQ ID NO:34)在可溶部分中为不可检测的；但是，相 反地，变体#1、#2和#3为可溶的。对本发明的蛋白质单独地或者组 合地进行类似氨基酸取代，以提高它们在非-Bt或植物宿主细胞内的 溶解度。对重组DNA构建体进行工程化以编码和表达TIC807_M13 变体#3(改名为TIC807_M14；核苷酸SEQ ID NO:203和氨基酸SEQ  ID NO:204)。阐明制备的大肠杆菌裂解物，并且在一系列柱(包括离 子交换法和凝胶过滤法)上纯化和富集重组蛋白。对合并的蛋白质部 分进行定量并且确定具有针对半翅目昆虫的活性(参见实施例4，表 4B)。

本发明的蛋白质包括但不限于，具有如SEQ ID NO:28、SEQ ID  NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:36所列出的氨基酸序列的蛋白 质，对本发明的蛋白质进行工程化以在宿主细胞内表达时，例如在 Bt、大肠杆菌或植物细胞或者植物细胞隔间内表达时，提高可溶形式 的表达。工程化包括在以下位置58、59、198、199、201或202中的 一个或多个位置处取代赖氨酸氨基酸残基；或者在以下位置198、248 或301中的一个或多个位置处取代谷氨酸；或者，在以下位置246、 250或253中的一个或多个位置处取代精氨酸。

C-末端区域从蛋白质的单体核心突出(参见图2)。对重组DNA构 建体进行工程化以编码和表达具有氨基酸序列SEQ ID NO:202的蛋 白质，所述氨基酸序列为TIC807_M8(SEQ ID NO:16)的蛋白质片段 (氨基酸1至301)；并且对表达的蛋白质进行纯化、定量并且确定具 有针对草盲蝽昆虫的活性(参见实施例4，表4B)。设计重组DNA构 建体以编码和表达TIC807片段，所述片段在对应TIC807位置A281、 G289、S293、A301和S304展示本发明的蛋白质的不同C-末端截短。 对蛋白质片段进行工程化以编码和表达具有如SEQ ID NO:28、SEQ  ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36所列出 的氨基酸序列的蛋白质；并且将表达的蛋白质片段用作针对草盲蝽昆 虫的测试样品。

实施例4：工程化蛋白质的半翅目活性

此实施例说明在提供于半翅目食物中时具有针对半翅目昆虫的 提高的杀昆虫活性和增大的杀昆虫特异性的eHTP’s，所述半翅目昆 虫包括但不限于半翅目盲蝽科的成员，包括草盲蝽属，例如豆荚草盲 蝽和美洲牧草盲蝽；以及叶蝉科，包括芒果叶蝉属，例如苯甲醛对叶 蝉，和小绿叶蝉属，例如马铃薯小绿叶蝉。此实施例用表4B说明用 于确定本发明的Bt表达的重组蛋白针对豆荚草盲蝽和美洲牧草盲蝽 二者的的增大的草盲蝽抑制谱和/或提高的草盲蝽抑制活性的进食测 定。将重组细菌宿主细胞内表达的蛋白质溶解于碳酸盐缓冲液中并且 通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析；并且通过密度 测定法使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准确定蛋白质浓度。将以这种 方式制备的蛋白质储备液(2X)与食物混合以用于进食测定。

使用半翅目种类豆荚草盲蝽和美洲牧草盲蝽的进食测定基于具 有在伸展的与聚酯薄膜之间包囊化的草盲蝽食物的96孔微 滴定板形式。从(Diet F9644B,Frenchtown,NJ) 获得人工食物。在表面无菌的搅拌器中，将高压蒸汽处理的沸水(518 mL)与156.3克食物F9644B混合。添加四个表面无菌的鸡 蛋中的内容物并且搅拌混合物直到平滑，然后调节至一升总体积并且 允许冷却至室温，这为2X食物。通过以1:1比率混合2X食物和2X 样品来制备测试样品。将片(Pechiney Plastic Packing, Chicago,IL)置于设计用于96孔形式的真空歧管(Analytical Research  Systems,Gainesville,FL)上并且应用大约-20毫米汞柱的真空，以足以 引起挤压到孔中。将二十至四十微升的测试样品添加到 挤出物中。将聚酯薄膜片(Clear Lam Packaging,Inc.,Elk  Grove Village,IL)置于样品填充的挤出物上并且用粘合烙铁 (Bienfang Sealector II,Hunt Corporation,Philadelphia,PA)密封，因此形 成食物填充的袋。将这些袋定位于包含悬浮于稀 释琼脂糖溶液中的草盲蝽卵的平底96-孔板上。孵化之后，草盲蝽若 虫通过刺穿食物填充的袋摄食食物。可选地，将新孵化的草 盲蝽若虫而不是卵手动侵染到每个孔中。在第5天确定生长缓慢和死 亡率并且与对照进行比较。使用JMP4统计软件分析数据。对于测试 浓度的每种蛋白质，使三个群体的八只若虫经历此生物测定并且在表 4B中报道死亡率得分。

对于表1和表4B所列出的LC50测定，以8至10个浓度将蛋白 质提供给新孵化的若虫并且允许若虫在剂量范围内在对死亡率评分 之前进食持续5天。对于每个浓度，使三个群体的八只若虫经历此生 物测定，并且将表1和表4B中的所有LC50测定重复至少一次。

对于LC50评估，以4个浓度将蛋白质提供给新孵化的美洲牧草 盲蝽若虫并且允许若虫在剂量范围内在对死亡率评分之前进食持续5 天。对TIC807和TIC807_M2进行美洲牧草盲蝽LC50评估，因为超 过1000μg/mL的显著大量的这些蛋白质不能提供在草盲蝽食物中以 便对美洲牧草盲蝽实现高毒性剂量反应范围，并且因此没有确定 TIC807或TIC807_M2的LC50值。相反，以低范围进行4个剂量的 LC50评估，并且在表1和表4B中报道。评估的TIC807_M14的美 洲牧草盲蝽LC50为4.4μg/mL。对于每个浓度，使三个群体的八只 若虫经历此生物测定。

此实施例用表4A和表4B说明用于确定本文所公开的Bt表达的 重组蛋白针对苯甲醛对叶蝉的增大的抑制谱和/或提高的抑制活性的 进食测定。针对豆荚草盲蝽和/或美洲牧草盲蝽具有提高的杀昆虫活 性或增大的杀昆虫特异性的TIC807变体展示针对苯甲醛对叶蝉的提 高的杀昆虫活性。

将TIC807和TIC807_M13溶解于25mM pH 10碳酸钠缓冲液中。 将苯甲醛对叶蝉卵收集在秋葵叶子上并且在包含2％琼脂的陪替氏培 养皿中孵育。在孵化之后，使用稀释的(1:5)草盲蝽食物将新生虫用于 生物测定。以相等比例混合蛋白质和食物(使蛋白质最终浓度为500 μg/mL)并且将其分配到测试场所。通过将缓冲液与食物混合来制备未 处理的对照。将单个新生虫侵染到测试场地中，在25℃、60％RH下 孵育测定物。对每个浓度的蛋白质测试二十只新生若虫并且以2次重 复进行。用25mM pH 10碳酸钠缓冲液将对照维持在1:5稀释的草盲 蝽食物中。在第五天确定昆虫的死亡率。通过以下公式计算死亡率值： (处理的％死亡率-对照的％死亡率)/(100–对照的％死亡率)x 100。表 4A将5种不同浓度的TIC807和TIC807_M13的芒果叶蝉属活性制成 表格。

表4A.针对芒果叶蝉属种类的TIC807和TIC807_M13死亡率百 分比

在单独的测试中确定TIC807和TIC807_M13的LC50值。SEQ ID  NO:2(TIC807)展示116.79μg/mL的LC50值和437.27μg/mL的LC90。 SEQ ID NO:34(TIC807_M13)展示7.59μg/mL的LC50值和239.8 μg/mL的LC90值。

将如上对于苯甲醛对叶蝉所述的进食测定用于测试eHTP’s针对 马铃薯小绿叶蝉的提高的杀昆虫活性和/或增大的杀昆虫特异性。针 对豆荚草盲蝽和美洲牧草盲蝽具有提高的杀昆虫活性或增大的杀昆 虫特异性的TIC807变体展示针对马铃薯小绿叶蝉的提高的杀昆虫活 性。

对于TIC807(SEQ ID NO:2)、TIC807_M2(SEQ ID NO:8)、 TIC807_M10(SEQ ID NO:30)和TIC807_M13(SEQ ID NO:34)，在一 个测试组中确定Cry51Aa1(SEQ ID NO:182)针对豆荚草盲蝽和美洲 牧草盲蝽的LC50值。TIC807_M2、TIC807_M10和TIC807_M12展 示与Cry51Aa1相比提高的LC50值。

本领域技术人员应清楚，对此程序的改变可存在，并且不应影响 结果。

实施例5：本发明的蛋白质组成的昆虫抑制活性

制备本发明的蛋白质并且测试针对除草盲蝽属之外的之外害虫 的生物活性，所述本发明的蛋白质例如但不限于TIC807_M1(SEQ I D NO:6)、TIC807_M2(SEQ ID NO:8)、TIC807_M3(SEQ ID NO: 10)、TIC807_M4(SEQ ID NO:12)、TIC807_M5(SEQ ID NO:14)、 TIC807_M6(SEQ ID NO:18)、TIC807_M7(SEQ ID NO:20)、TIC8 07_M8(SEQ ID NO:16)、TIC807_M9(SEQ ID NO:28)、TIC807_ M11(SEQ ID NO:32)、TIC807_M13(SEQ ID NO:34)以及TIC807_ M12(SEQ ID NO:36)。

制备蛋白质TIC807_M10(SEQ ID NO:30)、TIC807_M11(SEQ ID  NO:32)、TIC807_M12(SEQ ID NO:36)以及TIC807_M13(SEQ ID  NO:34)并且测试其针对来自半翅目、鞘翅目、异翅目以及同翅目的害 虫的生物活性。制备蛋白质TIC807_M5(SEQ ID NO:14)并且测试其 针对鞘翅目害虫的生物活性。进行生物测定以评价这些蛋白质对如表 5所示的昆虫的作用。对含有杀昆虫蛋白的人工食物进行进食测定。 根据所测试的昆虫，如实施例3所述地制备杀昆虫蛋白并且通常使用 昆虫特异人工食物应用。将毒素悬浮于缓冲液中并且以每孔500 μg/mL样品的速率应用，并且在1000μg/mL TIC807_M5的情况下， 并且然后允许干燥。对每种测试的昆虫种类的三个群体的8只昆虫确 定平均生长缓慢评分(stunting score)和群体死亡率。对于与未处理的 对照相比统计学上显著的昆虫反应如生长缓慢和死亡率，结果表示为 阳性(+)。如果昆虫与UTC类似，即仅应用以上缓冲液的进食食物， 则结果表示为阴性(-)。

表5.eHTP’s表明针对除草盲蝽某些种之外的害虫的额外昆虫抑 制活性。

蛋白质 μg/mL CPB WCR ECB SWCB CEW FAW SGSB NBSB GPA UTC 0 - - - - - - - - - TIC807_M5 1000 + - ND ND ND ND ND ND ND TIC807_M10 500 - - - - - - - - - TIC807_M11 500 + - - - - - - - - TIC807_M12 500 - - - - - - - - - TIC807_M13 500 + - - - - - - - -

UTC＝未处理的对照；ND＝未确定的

CPB＝科罗拉多马铃薯甲虫(科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa  decemlineata))；WCR＝西方玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabrotica  virgifera))；ECB＝欧洲玉米螟(欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis))；西南玉 米秆草螟(西南玉米秆草螟(Diatraea grandiosella))；CEW＝棉铃虫(玉 米穗虫(Helicoverpa zea))；FAW＝秋天行军虫(草地贪夜蛾(Spodoptera  frugiperda))；SGSB＝南部绿色椿象(Nezara virudula)；NBSB＝新热带 区布朗椿象(neotropical brown stink bug)(Euschistus heros)；GPA＝桃蚜 (桃蚜(Myzus persicae))。

还测试本发明的蛋白质针对来自线虫纲的害虫的生物活性。

实施例6：表达本发明的蛋白质的植物展示昆虫抑制活性

此实施例示出本发明的蛋白质在植物中的表达并且证明表达本 发明的蛋白质的棉花植物展示昆虫抑制活性。

根据美国专利号7,741,118所列出的方法制备用于在植物中表达 本发明的蛋白质的多核苷酸区段。例如，，具有如SEQ ID NO:4(TI C807_4)、SEQ ID NO:6(TIC807_M1)、SEQ ID NO:8(TIC807_M2)、 SEQ ID NO:10(TIC807_M3)、SEQ ID NO:12(TIC807_M4)、SEQ  ID NO:14(TIC807_M5)、SEQ ID NO:16(TIC807_M8)、SEQ ID  NO:18(TIC807_M6)、SEQ ID NO:20(TIC807_M7)、SEQ ID NO: 22(TIC807_22)、SEQ ID NO:24(TIC807_24)、SEQ ID NO:26(TI C807_26)、SEQ ID NO:28(TIC807_M9)、SEQ ID NO:30(TIC807 _M10)、SEQ ID NO:32(TIC807_M11)以及SEQ ID NO:34(TIC807 _M13)所列出的氨基酸序列的毒素蛋白分别由设计用于植物中使用 并且编码本发明的蛋白质的多核苷酸区段表达，所述多核苷酸区段包 括如SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ I D NO:189、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、 SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ I D NO:200以及SEQ ID NO:201所列出的多核苷酸序列。

意图在于编码每种变体蛋白或其昆虫抑制片段的多核苷酸区段 (或多核苷酸分子)可单独使用、或者彼此组合使用、或者与其它昆虫 抑制蛋白或昆虫抑制剂如dsRNA介导的基因抑制分子组合使用。此 类组合设计为以与本发明的蛋白质协同或可兼容的机制起作用。这些 组合的意图在于获得受到保护以免受害虫、特别为昆虫害虫侵染的影 响的植物和植物细胞。处于本发明的范围内的特异性变体蛋白包括与 表4B所列出的和提交的申请全文所述的SEQ ID NO相对应的蛋白 质。

将来自SEQ ID NO:188(编码TIC807_M2，SEQ ID NO:8)和来自 SEQ ID NO:192(编码TIC807_M8，SEQ ID NO:16)的多核苷酸区段各 自重组工程化为用于棉花转化的表达构建体。

生成转基因棉花植物(重组棉花植物)并测试其效力。选择低拷贝 数和高对应变体蛋白表达的再生(R0)转基因植物，如通过各种定量和 半定量方法例如PCR、ELISA和蛋白质印迹法确定的。在R0棉花叶 组织中的表达水平范围通常为0.5至500ppm鲜重。将表达高水平的 蛋白质的R0植物转移到土壤中并且进行自花受粉。种植三十颗来自 自花受粉的R0植物的种子并且使转基因的后代纯合子生长至开花。 测试此实施例的每个构建体的每4至5种事件的11至18株植物针对 草盲蝽的效力(表6A、表6B和表6C)。将未转化的棉花栽培植物、 来自合并的阴性分离群体的植物(后代不含有转基因)以及表达 TIC807母本蛋白的植物用作阴性对照。将开花阶段棉花植物的一个 分枝装在由可透气塑料“授粉”筒制成的网袋中(Vilutis and Co.Inc., Frankfort,IL)，并且以类似方式设置多个分枝。使用拧结将每个网袋 固定于茎上。将约4-6只豆荚草盲蝽若虫(孵化后<24小时)置于1.4ml 锥形管(Matrix Technologies Corp.,NH)中。通过将未加盖的锥形管滑 动到网袋中来用若虫侵染网袋内的分枝。在干冰上收集网袋内所有存 活的昆虫之前，允许昆虫进食持续10至11天的一个时段。称量存活 者以获得毛重。计算死亡率百分比和平均存活质量。在死亡率百分比 的死亡率计算在包括失去的昆虫。如表6A、表6B和表6C所示，表 达变体蛋白TIC807_M2和TIC807_M8的棉花植物显著影响豆荚草盲 蝽若虫的生长和发育。基于这些结果，推动这些植物、种子、表达构 建体进一步发育。

表6A.使用表达变体TIC807蛋白TIC807_M2和TIC807_M8的 棉花植物通过开花阶段的草盲蝽进食测定确定的平均％死亡率。

表6B.使用表达变体TIC807蛋白TIC807_M2和TIC807_M8的 棉花植物通过开花阶段的草盲蝽进食测定确定的平均龄期。

表6C.使用表达变体TIC807蛋白TIC807_M2和TIC807_M8的 棉花植物通过开花阶段的草盲蝽进食测定确定的平均存活质量。

Std Dev＝标准偏差

SEM＝平均标准误差

Lo 95％＝95％置信区间的下限

Up 95％＝95％置信区间的上限

T分组＝使用最小显著性差异检验，F值＝101.1756，df＝15、44， Pr<0.0001

在另一个实施例中，在具有天然草盲蝽侵染压力的田间试验中测 试来自表达TIC807_M11的五种转基因事件的棉花植物。这些植物表 明与非转基因受体系(用于转化的DP393种质)相比的田间效力。每种 事件的美洲牧草盲蝽在五株植物上的平均数目显著低于美洲牧草盲 蝽在来自非转基因对照的植物上的平均数目。来自五种事件的植物的 籽棉产量在统计学上可与非转基因对照的籽棉产量相比，例如长季节 的方形保留。

在另一个类似田间试验中，来自表达TIC807_M10的七种转基因 事件的棉花植物表明与非转基因对照相比的田间效力。每种事件的美 洲牧草盲蝽在五株植物上的平均数目显著低于美洲牧草盲蝽在来自 非转基因对照的植物上的平均数目。来自七种事件之三的植物的籽棉 产量显著高于非转基因对照的籽棉产量。

在另一个实施例中，来自表达TIC807_M13的三十四种转基因事 件的棉花植物表明与非转基因对照相比的生长室效力。将网袋置于开 花阶段的全株棉花植物周围(而不是仅在此实施例先前所述的单个分 枝周围)。评价每种事件的五株植物并且记录的每株植物的美洲牧草 盲蝽昆虫(若虫到成虫到第2代草盲蝽)的平均数目显著低于每株非转 基因植物的美洲牧草盲蝽昆虫的平均数目。

使用表达表1以及表4A和表4B所列出的蛋白质的植物进行类 似实验。

实施例7：来自表达本发明的蛋白质的苜蓿植物的组织展示昆虫抑制活性

此实施例示出本发明的蛋白质在苜蓿植物中的表达，并且证明来 自表达本发明的蛋白质的苜蓿植物的组织展示昆虫抑制活性。

将来自SEQ ID NO:192(编码TIC807_M8，SEQ ID NO:16)的多 核苷酸区段重组工程化为三种不同配置的表达构建体，以用于苜蓿转 化。出于数据报告的目的，三种重组构建体为编码的[ER]、[ES]和[ET]。

从异型杂交并且然后自花受粉的转化株中回收转基因苜蓿植物 (重组苜蓿植物)。选择低拷贝数和高TIC807表达的重组苜蓿植物， 如分别通过RT-PCR和半定量蛋白质印迹法确定的。将来自十种单独 事件的苜蓿植物组织合并、冻干、研磨以及重悬于储备缓冲液pH10.5 25mM NaCarb中。制备来自不具有表达TIC807_M8的转基因的苜蓿 的植物组织以用作对照。将储备制备液系列稀释100倍、300倍和900 倍，以用于并入草盲蝽食物中。使用实施例4的进食测定法，在第5 天确定死亡率和生长缓慢得分并且与对照进行比较(参见表7A和表 7B；使用JMP4统计软件分析数据)。对于每种测试样品和每种稀释 液，使三个群体的八只若虫经历此生物测定。生长缓慢得分与目视质 量分级相对应，其中0＝与阴性对照无差异、1＝约25％较少质量、2＝ 约50％较少质量以及3＝约75％较少质量。报道八只若虫的每个群体 的生长缓慢得分的平均值。

表7A.通过草盲蝽进食测定使用并入来自表达变体TIC807蛋白 TIC807_M8的苜蓿植物的组织的食物确定的平均％死亡率。

表7B.通过草盲蝽进食测定使用并入来自表达变体TIC807蛋白 TIC807_M8的苜蓿植物的组织的食物确定的平均生长缓慢。

实施例8：共表达展示草盲蝽种类抑制活性的eHTP和第二昆虫抑制蛋白的植物

制备包含TIC1415和TIC807_M13的不同混合物的蛋白质样品并 且在生物测定中进行测定。TIC1415蛋白质和其它草盲蝽抑制蛋白描 述于PCT专利申请公开号WO 2012/139004。使用生物活性测定将样 品混合物供应给美洲牧草盲蝽。还将单独的TIC1415蛋白质和单独的 TIC807_M13制备为阳性对照。将缓冲液用作阴性对照。来自所有三 种类型的制备液的样品展示针对美洲牧草盲蝽的死亡率并且存活者 生长缓慢。死亡率和生长缓慢得分与摄食缓冲液的昆虫的生物活性得 分相比为重要的(参见表8A)。数据表明没有拮抗作用。对混合物进行 额外生物测定测试以证明协同作用和/或加合作用。

表8A.蛋白质混合物的生物测定数据：TIC1415与TIC807_M13 组合

每个群体8只若虫的5个群体的平均值(平均)。

生长缓慢得分与目视质量分级相对应，其中0＝与阴性对照无差 异、1＝约25％较少质量、2＝约50％较少质量以及3＝约75％较少质 量。报道八只若虫的每个群体的生长缓慢得分的平均值。

*在95％置信区间内。

包含具有转基因DNA的事件的棉花植物被设计为共表达对应蛋 白质TIC1415和TIC807_M13。在用美洲牧草盲蝽侵染的笼内的全株 植物测定中评价此类植物。将各自来自十种事件的五株植物关在笼中 并且用每株植物2对雄性和雌性美洲牧草盲蝽侵染。测定在标准环境 条件下在生长室中进行孵化，以用于棉花植物发育21天。DP393阴 性对照植物以类似方式生长。在3周时段结束之后，对不同发育阶段 的草盲蝽进行计数。计算在每个发育阶段每株植物的豆荚草盲蝽昆虫 的平均数目(参见表8B)。

表8B.蛋白质混合物的植物体内数据：TIC1415与TIC807_M13 组合