一种便于蛋白质谱高效分析表达量差异蛋白的蛋白提取和电泳方法

摘要

本发明公开了一种便于蛋白质谱高效分析表达量差异蛋白的蛋白提取和电泳方法，属于蛋白质谱工程领域。本发明发明能高效的提取黑曲霉的蛋白并充分分离各个蛋白质点。其中，以如下配方的低温破壁液对黑曲霉进行破碎提取蛋白：无水乙醇20g，三氯乙酸5g，醋酸5g，十六烷基吡啶0.02g，十二烷基硫酸钠0.03g，蒸馏水定容至1L，该破壁液能增加蛋白的提取率。本发明的电泳方法为三向电泳，通过三向电泳更有利于黑曲霉的蛋白提取和区分蛋白表达的差异。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质谱工程领域，具体涉及一种便于蛋白质谱高效分析表达量差异蛋白的蛋白提取和电泳方法。

背景技术

纤维素是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年因光合作用产生的纤维素达到100亿吨左右，利用纤维素生产生物能源，是缓解能源危机，实现人类可持续发展的关键。

纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需要外切酶、内切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中内切酶降解长片段的纤维素成为二聚体，是纤维素降解的关键步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色，条件温和，转化率高的特点，但是纤维素较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。

获得高产纤维素酶的菌株，降低纤维素酶的生产成本成为纤维素酶工业化利用的必由之路。纤维素酶的生产菌株主要有黑曲霉。黑曲霉由于其较高的安全性，被认为是生产纤维素酶最有应用前景的菌株之一。构建黑曲霉高产菌种成为降低纤维素酶生产成本的最有效途径之一。现在基因工程技术构建纤维素酶生产菌种一般通过基因敲除某个基因或增强某个基因的表达。这些手段构建的基因工程菌种虽然产量有一定提高，但是产量提高有限。原因基因工程敲除或强化表达的基因相对单一，纤维素酶产量的提高仅仅靠强化几个基因的表达，产量提高有限。要进一步提高基因工程菌种，就需要在已有的操作目的基因以外进行改造。

黑曲霉在诱导环境下下产生纤维素酶，基于二维电泳技术的技术能标识在两种诱导剂诱导下胞外蛋白表达差异的种类，测定有差异蛋白的氨基酸序列，从而对表达有差异的蛋白进行鉴定。这些差异蛋白的鉴定，能为基因工程技术的改造提供新的操作对象，为基因工程菌株的构建提供一个新的改造目标基因。

黑曲霉由于胞壁坚韧，菌丝较长，必须有高效的破壁技术破除细胞壁，而且在细胞壁破除时不破坏蛋白质的肽链。已有的蛋白破壁方法如：研磨破碎要破碎霉菌的细胞壁，所需的巨大剪切力对菌体的蛋白损伤较大，而且破壁性能较差，因此很能使用与精确定量和定性分析的目的；超声波破碎效果非常差，不适宜霉菌；用均浆机破碎时，具有破壁力大，蛋白损伤或损失小的特点，但是由于霉菌的韧性较大，因此很难高效破碎，因此需要一定能增加脆性的方法，使霉菌用均浆机破碎更高效。用低温冷冻液增加霉菌脆性，是一个新的有效的提高破壁效率和蛋白提取率的方法。

同时由于黑曲霉的蛋白组成，不同于细菌、酵母菌，而且也显著不同于其他霉菌。黑曲霉的蛋白种类繁多，而且一些蛋白的理化性质较为接近，已有的蛋白电泳技术不能非常充分的分开黑曲霉的蛋白。因此必须有更高效的电泳方法来充分的分离各个蛋白质点。

同时在电泳时必须尽可能的把各个蛋白质点展开，这样才能高效的分析蛋白在表达量和表达种类的差异。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于破碎细胞壁的低温破壁液，该破壁液能够能增加蛋白的提取率。本发明的目的还在于提供一种蛋白三向电泳方法。本发明的破壁液与电泳方法能高效的提取黑曲霉的蛋白并充分分离各个蛋白质点。

一种用于破碎细胞壁的低温破壁液，其配制为：无水乙醇20g，三氯乙酸5g，醋酸5g，十六烷基吡啶0.02g，十二烷基硫酸钠0.03g，蒸馏水定容至1L；使用前在-20℃预冷24h以上。

一种蛋白三向电泳方法，包括如下步骤：

(1)制备蛋白电泳胶体：把塑料条用蒸馏水涂湿，放置在距制备胶体的盒子底部靠近一端的位置，然后向盒子里面浇注SDS-PAGE胶体液至液体的高度达到1-2cm时候停止浇注，放置一张醋酸纤维薄膜，继续浇注，每升高1-2cm就放置一张醋酸纤维薄膜，直到液面达到5-10cm高，待胶体凝固后取下塑料条，得到一个放置IPG胶条的凹槽。

所述的SDS-PAGE胶体液优选为：50mL的配方：蒸馏水13.3mL，30％Acr-Bis(29:1)16.7mL，1M Tris pH8.819.0mL，10％SDS 0.5mL，10％过硫酸铵0.5mL。

(2)IPG胶条预处理：使用IPG干胶条在电泳平衡液I中浸泡24h以上。

所述的电泳平衡液I的配方优选为：50mmol/L Tris-HCl，6mol/L尿素，30％甘油，40g/LSDS，痕量溴酚蓝，使用前加入10g/L DTT。

(3)第一向电泳：将样品加入IPG胶条进行等电聚焦。

(4)第二、三向电泳：等电聚焦后的IPG胶条先后在平衡液I和平衡溶液中平衡后转移到步骤(1)制备的胶体的凹槽内，再用SDS-PAGE胶体液密封IPG胶条进行第二向电泳；第二向电泳结束后再进行第三向电泳。第二向电泳的方向与IPG胶条长边垂直，第三向电泳的方向与第二向电泳的电泳面垂直。

所述的平衡溶液的配方优选为：50mmol/L Tris-HCl，6mol/L尿素，30％甘油，40g/L SDS，痕量溴酚蓝，25g/L碘乙酰胺。

(5)电泳后的胶体以醋酸纤维薄膜为支撑分成多片，再经过固定、染色和脱色处理后进行扫描和质谱分析。

所述的低温破壁液或蛋白三向电泳方法在分析蛋白表达量和表达种类的差异中的应用。

一种便于蛋白质谱高效分析黑曲霉表达量差异蛋白的蛋白提取和电泳方法，包括如下步骤：

(1)离心收集胞外蛋白：黑曲霉液体发酵的发酵液5000g离心收集菌丝，取4g菌丝用10mL蒸馏水反复冲洗6次，洗涤菌丝的液体和离心收集的液体混合，用来收集胞外蛋白。

(2)低温高压泵破碎细胞提取胞内蛋白：取4g洗涤后的菌丝放入20mL预冷的上述低温破壁液中再加入到高压均浆机里均浆破碎细胞。

(3)提取蛋白的浓缩和冷冻干燥：将步骤2)均浆破碎的细胞液和步骤1)的混合蛋白液体混合均匀，加入10倍体积-20℃预冷的含100g/L三氯乙酸及0.07％巯基乙醇的丙酮溶液，并于-15℃静置过夜；然后50000g、4℃离心30min，弃上清；再加入-20℃预冷的含0.07％巯基乙醇的丙酮溶液，-20℃静置2h，离心条件同上；重复上一步，立即离心，弃上清；将沉淀冷冻干燥，干粉于-20℃放置备用。

(4)裂解和离心：称取干粉0.15g，加入2mL裂解液，30℃水浴保温30min，然后80000g、15℃离心1h，将上清液继续在80000g、10℃离心40min，所得上清液按照上述方法进行蛋白三向电泳。

所述的裂解液的配方优选为：9.5mol/L尿素，20g/L 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，10g/L二硫苏糖醇。

使用本发明的低温破壁液和三向的电泳方法，更有利于蛋白的提取和区分蛋白表达的差异，特别适用于对黑曲霉蛋白的提取和蛋白表达差异的分析。

附图说明

图1是电泳胶体盒示意图。

图2是电泳盒1示意图。

图3是电泳盒2示意图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1蛋白的提取、电泳和扫描及质谱分析

(1)蛋白提取

1)离心收集胞外蛋白：黑曲霉液体发酵的发酵液5000g离心收集菌丝，取4g菌丝用10mL蒸馏水反复冲洗6次，洗涤菌丝的液体和离心收集的液体混合，用来收集胞外蛋白。

2)低温高压泵破碎细胞提取胞内蛋白：①制备低温破壁液：无水乙醇20g，三氯乙酸5g，醋酸5g，十六烷基吡啶0.02g，十二烷基硫酸钠0.03g，蒸馏水定容至1L，在-20℃预冷24h。②取4g洗涤后的菌丝放入20mL预冷的低温破壁液中再加入到高压均浆机(德国APV-2000-4)里均浆破碎细胞，破碎压力为1000bar。

3)提取蛋白的浓缩和冷冻干燥：将步骤2)均浆破碎的细胞液和步骤1)的混合蛋白液体混合均匀，加入10倍体积-20℃预冷的含100g/L三氯乙酸及0.07％巯基乙醇的丙酮溶液，并于-15℃静置过夜；然后50000g、4℃离心30min，弃上清；再加入-20℃预冷的含0.07％巯基乙醇的丙酮溶液，-20℃静置2h，离心条件同上；重复上一步，立即离心，弃上清；将沉淀冷冻干燥，干粉于-20℃放置备用。

4)裂解和离心：称取干粉0.15g，加入2mL裂解液(9.5mol/L尿素，20g/L 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，10g/L二硫苏糖醇)，30℃水浴保温30min，然后80000g、15℃离心1h，将上清转移至另一只离心管继续在80000g、10℃离心40min，上清液即可用于三向电泳。样品的蛋白质浓度用Bradford方法测定。

(2)高效电泳步骤

1)电泳胶体盒的制备：用厚度为0.5cm的PS塑料板制备如图1所示的三向电泳胶体盒。首先用电锯切割制备14cm×14cm的塑料板一块、14cm×6cm的塑料板4块。用东莞市聚力胶粘制品有限公司生产的JL-6287PC塑料粘接专用胶水按照图1所示的粘接好。用厚度为1cm的塑料加工一个14cm×3cm的塑料条。制备胶体时，塑料条放在胶体盒底板(14cm×14cm的板)距离顶部(14cm×6cm的板)2cm的位置，如图1所示。

2)电泳盒制备：用厚度为0.5cm的PS塑料板制造如图2所示的电泳盒1。首先用电锯切割制备14cm×14cm的塑料板一块，14cm×6cm的塑料板2块。用JL-6287PC塑料粘接专用胶水按照图2所示粘接好。

用厚度为0.5cm的PS塑料板制造如图3所示的电泳盒2。首先用电锯切割制备14cm×6cm的塑料板4块。用JL-6287PC塑料粘接专用胶水按照图3所示粘接好。

3)胶体制备：把14cm×3cm×1cm的塑料条用蒸馏水涂湿，放置在距制备胶体的盒子底部距离端面2cm的位置(如图1所示)，然后向盒子里面浇注SDS-PAGE胶体液(50mL的配方：蒸馏水13.3mL，30％Acr-Bis(29:1)16.7mL，1M Tris pH8.819.0mL，10％SDS 0.5mL，10％过硫酸铵0.5mL)到液体的高度达到1.5cm时候停止浇注，放置一张14cm×14cm的醋酸纤维薄膜，继续浇注，每升高1cm就放置一张14cm×14cm的醋酸纤维薄膜，直到液面达到5.5cm高。室温下冷却，直到胶体凝固。然后取下塑料条，得到一个放置胶条的凹槽(14cm×3cm×1cm)

4)IPG胶条预处理：使用IPG干胶条(pH3-10，13cm，非线性)在电泳平衡液I(50mmol/LTris-HCl，6mol/L尿素，30％甘油，40g/L SDS，痕量溴酚蓝，使用前加入10g/L DTT)中浸泡24h。

5)第一向电泳(等电聚焦)：用加样杯上样，样品含100μg蛋白质，样品加入IPG胶条。用Bio-Ral的Protean IEF Cell等电聚焦仪进行等电聚焦，具体为：电泳仪的上槽加入500mL0.1M H₃PO₄，下槽加入500mL 0.1M NaOH，淹没各管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。上槽接正极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压160V，聚焦3小时。

6)第二向电泳：聚焦后的IPG胶条先在平衡液I(50mmol/L Tris-HCl，6mol/L尿素，30％甘油，40g/L SDS，痕量溴酚蓝，使用前加入10g/L DTT)中平衡15min，再在平衡溶液(50mmol/L Tris-HCl，6mol/L尿素，30％甘油，40g/L SDS，痕量溴酚蓝，25g/L碘乙酰胺)中平衡15min。转移到SDS-PAGE胶体(步骤3)制备的胶体)的凹槽内。在凹槽底部放置平展后，用SDS-PAGE胶体液(50mL的配方：蒸馏水13.3mL，30％Acr-Bis(29:1)16.7mL，1M Tris pH8.819.0mL，10％SDS 0.5ml，10％过硫酸铵0.5mL)倒满凹槽，密封胶条。使用郑州博邦仪器有限公司的JY-SPE型电泳仪器进行电泳，然后把胶体放入到电泳盒1内，再放入到电泳仪内，70V电泳到溴酚蓝距离底部2cm停止电泳。第二向电泳的方向与IPG胶条长边垂直，电泳缓冲液为：25mM Tris，192mM glycine，0.1％SDS，溶剂为双蒸水。

7)第三向电泳：电泳的胶体放入到电泳盒2中，然后让14cm×6cm的一个面朝下(第三向电泳的方向与第二向电泳的电泳面垂直)，让胶条所在的14cm×14cm的面靠近正极，然后70V电泳30min。电泳缓冲液为25mM Tris，192mM glycine，0.1％SDS，溶剂为双蒸水。

(3)固定和染色

电泳完备的胶体以每层醋酸纤维薄膜为支撑，分为5片。分片的凝胶立即浸泡在固定液(500mL乙醇，100mL冰醋酸，400mL蒸馏水)中至少30min；将固定后的凝胶在染色液(0.29g考马斯亮蓝溶解在250mL脱色液(250mL乙醇，80mL冰醋酸，加蒸馏水至1L)中，在使用前边搅拌边加热至60℃)中浸泡10min，然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次；多次更换脱色液(250mL乙醇，80mL冰醋酸，加蒸馏水至1L)，直至凝胶背景脱净为止。

每片凝胶用Imagescanner扫描，用Melanie3102软件分析图谱。首先进行点检测，然后选择5个分布较好的点标记并配齐(align)，接着选择一个参考胶，以重叠方式进行自动匹配。分析显示蛋白种类和表达量有差异的点。

(6)差异蛋白鉴定

取目的蛋白质点，用解剖刀沿染色边缘切下蛋白点放在少量Milli2Q水中，用MALDI2TOF质谱仪制备肽质量指纹谱。用含50％乙腈、25mmol/L碳酸氢铵的溶液将凝胶脱色，胶片真空干燥后用胰蛋白酶水解提取肽段，然后与过量的基质混合，加在样品靶盘上，溶剂挥发后蛋白质与基质形成共结晶，再用脉冲激光照射靶点，导致蛋白质电离，经过质量分析器检测，获得多肽混合物的质量。

实施例2

(1)菌株和培养基

黑曲霉(Aspergillus niger)从ATCC购买，菌株编号为ATCC10582。

黑曲霉诱导液体发酵培养基：玉米芯或稻草秸秆碱水解产物5.0g，硫酸铵0.08g，蛋白胨0.075g，葡萄糖1g，酵母浸膏0.03g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钙0.001g，硫酸镁0.001g，硫酸亚铁0.271mg，硫酸锰0.16g，氯化钴0.36g，氯化钙0.08g，蒸馏水定容至100mL，115℃灭菌20min。其中，玉米芯或稻草秸秆碱水解产物的制备为：100g玉米芯或稻草秸秆粉碎60目，100g氢氧化钠，1000mL蒸馏水，30℃水解24h，水解完后，用蒸馏水冲洗至中性，60℃烘干72h至恒重。

黑曲霉非诱导液体发酵培养基：硫酸铵0.08g，蛋白胨0.075g，葡萄糖1g，酵母浸膏0.03g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钙0.001g，硫酸镁0.001g，硫酸亚铁0.271mg，硫酸锰0.16g，氯化钴0.36g，氯化钙0.08g，蒸馏水定容至100mL，115℃灭菌20min。

(2)黑曲霉液体发酵

将保藏的黑曲霉孢子斜面用液体发酵培养基冲洗并用液体发酵培养基调节孢子数目，将50mL含孢子数目为1×10⁸/mL的诱导或非诱导液体发酵培养基装入150mL三角瓶中于28℃、150r/m发酵168h。

(3)蛋白的提取、电泳和扫描及质谱分析

具体方法同实施例1蛋白的提取、电泳和扫描及质谱分析。黑曲霉在诱导液体培养基发酵后提取胞内和胞外蛋白，电泳和染色后，得到的蛋白不同印迹点有1200个，得到的蛋白不同印迹点经分析发现诱导培养基和非诱导培养基有15种表达有差异的蛋白，如表1。

表1

实施例3

(1)菌株和培养基：同实施例2。

(2)黑曲霉液体发酵：同实施例2。

(3)蛋白的提取

1)离心收集胞外蛋白：同实施例1。

2)高压泵破碎细胞提取胞内蛋白：取4g洗涤后的菌丝放入蒸馏水中，加入到高压均浆机(德国APV-2000-4)里均浆破碎细胞，破碎压力为1000bar。

3)提取蛋白的浓缩和冷冻干燥：同实施例1。

4)裂解和离心：同实施例1。

(4)电泳和扫描及质谱分析：同实施例1，蛋白印迹点有1022个，得到表达差异的蛋白种类有7种(见表2).

表2

从实施例1和2的差异可以看出，在其它操作完全相同、仅有低温破壁液是否用于细胞壁破壁的情况下，有差异的蛋白种类差别很大。用低温破壁液提取蛋白的显示的蛋白种类多8种，这说明该低温破壁液能增加蛋白的提取率。

实施例3

(1)菌株和培养基：同实施例2。

(2)黑曲霉液体发酵：同实施例2。

(3)蛋白的提取：同实施例1。

(4)电泳

1)IPG胶条预处理：同实施例1。

2)第一向电泳(等电聚焦)：同实施例1。

3)第二向电泳：聚焦后的IPG胶条先在平衡液I(50mmol/L Tris-HCl，6mol/L尿素，30％甘油，40g/L SDS，痕量溴酚蓝，使用前加入10g/L DTT)中平衡15min，再在平衡溶液(50mmol/LTris-HCl，6mol/L尿素，30％甘油，40g/L SDS，痕量溴酚蓝，25g/L碘乙酰胺)中平衡15min。70V电泳到溴酚蓝距离底部2cm停止电泳。

(4)扫描及质谱分析：同实施例1。诱导的黑曲霉提取的蛋白电泳染色后，得到的蛋白不同印迹点有902个，得到的差异蛋白的种类仅仅有4种(表3)，这说明传统的二维电泳不同充分分离黑曲霉的蛋白，采用本发明电泳方法能充分的把蛋白分离开来。

表3

通过上述实施例表明本发明的低温破壁液和三向的电泳方法，更有利于黑曲霉的蛋白提取和区分蛋白表达的差异。