丝聚蛋白基因表达促进剂

摘要

本发明提供参与提高皮肤的保湿功能的、新的促进丝聚蛋白基因表达的物质。发现丝聚蛋白基因以约24小时周期的节律性而表达增减，添加候选物质后，在表达变成最大的时间筛选候选物质，将花椒提取物、3-(1’-哌啶)-丙酸、天竺葵油、柏木油、玫瑰油、白松香油、胡椒油、罗勒油、邻甲基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯、邻甲氨基苯甲酸甲酯确定为丝聚蛋白基因表达促进剂。

说明书

技术领域

本发明涉及化妆品和皮肤外用剂，更具体而言，涉及参与提高皮肤的 保湿功能的丝聚蛋白基因的表达促进剂。

背景技术

皮肤的角质层覆盖生物体并进行水分的保持、和/或对异物入侵的防御。 角质层由表皮角质形成细胞产生的角蛋白(keratin)、丝聚蛋白(filaggrin) 等蛋白质、脂质等各种各样的物质构成。丝聚蛋白在将角蛋白纤维束成层 状而制作被称为角蛋白模型的结构的过程中承担重要的作用，从由丝聚蛋 白基因(FLG)编码的前体物质丝聚蛋白原，伴随角化而产生丝聚蛋白， 使角蛋白纤维凝聚。进一步地，丝聚蛋白在角质上层被分解而形成被称为 天然保湿因子的低分子肽和/或氨基酸，参与保湿和/或紫外线吸收。

这样，丝聚蛋白深入地参与皮肤角质层的保湿、屏障功能，丝聚蛋白 产生的降低与寻常性鱼鳞病、特应性皮炎、老年性干皮症等干燥性皮肤疾 病的发病相关(非专利文献1)。要维持健康美丽的肌肤状态，必须使丝 聚蛋白适当地产生，并使角化以适当的周期继续。

出于这样的背景，关于促进丝聚蛋白合成的物质进行了研究，到目前 为止，作为具有丝聚蛋白合成促进效果的物质，已知野生百里香提取物、 丁香提取物、鼠尾草提取物等植物提取物等(专利文献1)。另外，也已 知某些细菌为了调节渗透压而蓄积的ECTOINE抑制由干燥导致的丝聚蛋 白降低(专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特许第4768238号公报

专利文献2:日本特许第4540872号公报

非专利文献

非专利文献1:Morar N.et.al.Filaggrin mutations in children with  severe atopic dermatitis.Journal of Investigative Dermatology,127, 1667-1672,2007

非专利文献2:Akashi,M.,et al.Noninvasive method for assessing the  humancircadian clock using hair follicle cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 107(35),15643-15648,2010.

发明内容

发明要解决的课题

如上所述，消费者对于具有更高的丝聚蛋白合成促进效果的物质的要 求强烈，要求开发新的丝聚蛋白合成促进剂。因此，本发明的课题在于提 供新的促进丝聚蛋白基因的表达的物质。

用于解决课题的方法

本发明者们关于丝聚蛋白基因的表达进行了深入研究，惊人地首次发 现，丝聚蛋白基因以约24小时周期的节律性而表达增减。因此发现，为了 像现有技术中进行的那样，促进丝聚蛋白产生而维持健康正常的皮肤状态， 重要的是不仅要单纯地提高丝聚蛋白产生、和/或抑制由干燥导致的丝聚蛋 白产生降低，而且要考虑节律性地促进丝聚蛋白产生。于是，考虑节律性 而对于候选物质关于丝聚蛋白基因表达促进作用进行了筛选，结果发明了 本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂。

作为具有丝聚蛋白基因表达促进效果的药剂，由本发明者们筛选出花 椒提取物、3-(1’-哌啶)-丙酸、天竺葵油、柏木油、玫瑰油、白松香油、胡 椒油、罗勒油、邻甲基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯和邻甲氨基苯甲酸 甲酯。

因此，本发明涉及丝聚蛋白基因表达促进剂，包含选自花椒提取物、 3-(1’-哌啶)-丙酸、天竺葵油、柏木油、玫瑰油、白松香油、胡椒油、罗勒 油、邻甲基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯和邻甲氨基苯甲酸甲酯中的一 种以上。

本发明的另一方式中，本发明涉及促进丝聚蛋白基因表达的方法，包 括对需要促进丝聚蛋白基因表达的对象施与丝聚蛋白基因表达促进剂，所 述丝聚蛋白基因表达促进剂选自花椒提取物、3-(1’-哌啶)-丙酸、天竺葵油、 柏木油、玫瑰油、白松香油、胡椒油、罗勒油、邻甲基苯甲酸甲酯、邻氨 基苯甲酸甲酯和邻甲氨基苯甲酸甲酯中的一种以上。

本发明的另一方式中，本发明也涉及选自花椒提取物、3-(1’-哌啶)-丙 酸、天竺葵油、柏木油、玫瑰油、白松香油、胡椒油、罗勒油、邻甲基苯 甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯和邻甲氨基苯甲酸甲酯中的一种以上用于制 造丝聚蛋白基因的表达促进剂的用途。

并且，基于丝聚蛋白基因以约24小时周期的节律性而表达增减的间接， 本发明还涉及丝聚蛋白基因的表达促进方法或美容方法，按照使丝聚蛋白 基因表达量的生物体节律、与通过施与丝聚蛋白基因表达促进剂而产生的 丝聚蛋白基因表达量的节律同步的时间安排，来施与丝聚蛋白基因表达促 进剂。并且，本发明也涉及一种丝聚蛋白基因表达促进剂，其特征在于， 以如下方式使用：按照使丝聚蛋白基因表达量的生物体节律、与通过施与 丝聚蛋白基因表达促进剂而产生的丝聚蛋白基因表达量的节律同步的时间 安排，来施与该丝聚蛋白基因表达促进剂；和/或一种丝聚蛋白基因表达促 进剂，其特征在于，以如下方式使用：对丝聚蛋白基因表达量的生物体节 律紊乱的对象，通过施与丝聚蛋白基因表达促进剂，从而按照使丝聚蛋白 基因表达量的节律恢复的时间安排，来施与该丝聚蛋白基因表达促进剂。

发明的效果

本发明所涉及的丝聚蛋白基因表达促进剂具有以下列举的效果：

促进丝聚蛋白基因的表达；

增强皮肤屏障功能；以及

保湿

之中至少一个以上的效果。

附图说明

图1是显示在添加了皮质醇的培养基中暂时培养而得的培养角质形成 细胞中丝聚蛋白基因表达以24小时的节律而增减的图。

图2是显示在添加了皮质醇的培养基中暂时培养而得的培养角质形成 细胞中，丝聚蛋白基因、以及时钟基因BMAL1和PER3的表达以24小时 的节律而增减的图。

图3是显示关于候选药剂的丝聚蛋白基因表达促进作用的结果的图。

图4是显示关于使用3-(1’-哌啶)-丙酸、花椒提取物、以及他们的组合 作为候选药剂的情况下的丝聚蛋白基因表达促进作用的结果。

具体实施方式

本发明涉及丝聚蛋白基因表达促进剂，包含选自花椒提取物、3-(1’- 哌啶)-丙酸、天竺葵油、柏木油、玫瑰油、白松香油、胡椒油、罗勒油、 邻甲基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯和邻甲氨基苯甲酸甲酯中一种以上。 作为丝聚蛋白基因表达促进剂，可以将上述列举出的物质单独使用，也可 以组合使用。更优选选择花椒提取物作为本发明的丝聚蛋白基因表达促进 剂。进一步更优选选择花椒提取物与3-(1’-哌啶)-丙酸的组合作为丝聚蛋白 基因表达促进剂。

另一方式中，本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂可以进一步包含已知 的其他具有丝聚蛋白基因表达促进效果的药剂，例如野生百里香提取物、 丁香提取物、鼠尾草提取物或ECTOINE。

本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂能够通过促进丝聚蛋白基因的表达 来促进丝聚蛋白的合成。如果更详细地记载，则通过丝聚蛋白基因的表达， 丝聚蛋白原的合成被促进，丝聚蛋白原受到磷酸化，然后在角化时经过去 磷酸化以及由肽酰基精氨酸脱亚胺酶催化的水解，从而合成丝聚蛋白。因 此，丝聚蛋白基因表达促进剂也有时称为丝聚蛋白原基因表达促进剂，也 可以是介由促进丝聚蛋白基因表达而促进丝聚蛋白的合成的丝聚蛋白合成 促进剂。

本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂能够促进丝聚蛋白合成，进一步引 起作为丝聚蛋白分解而产生的天然保湿因子(NMF)的主成分的氨基酸的 增加。因此，本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂可以是天然保湿因子增强 剂或保湿剂，并且由于增强天然保湿因子而也可以是皮肤屏障功能增强剂， 能够配合在化妆品中。进而，通过本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂和/ 或丝聚蛋白基因表达促进方法，能够治疗干燥肌肤，以及干燥性的肌肤疾 病、例如老年性干皮症、特应性皮炎、寻常性鱼鳞病等皮肤疾病。

本发明的一个方式中，本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂可以通过任 意途径施与，可以通过口服或非口服(例如，透皮、经粘膜、皮下、静脉 内、腹腔内、经肺、肌肉内)的任一方式施与。作为口服施与，丝聚蛋白 基因促进剂可以制剂化成片剂、胶囊剂等而施与，也可以作为饮料和/或添 加物施与。作为透皮施与，可以通过配合在化妆品或皮肤外用剂中、涂布 于皮肤上而施与。作为经肺施与，可以通过制成溶解有丝聚蛋白基因促进 剂的溶液的雾，或者通过使其气化吸入来施与，例如以芳香疗法的方式施 与。从促进表皮细胞中的丝聚蛋白基因表达的观点考虑，优选将丝聚蛋白 基因表达促进剂透皮施与。

本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂不仅可以对需要促进丝聚蛋白基因 表达的对象、例如希望保湿和/或增强皮肤屏障功能的对象施与，还可以对 丝聚蛋白基因表达量的生物体节律紊乱的对象施与。作为需要促进丝聚蛋 白基因表达的对象，例如可以举出干燥肌肤，患有干燥性的肌肤疾病、例 如老年性干皮症、特应性皮炎、寻常性鱼鳞病等皮肤疾病的对象。

本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂是指化妆品、药品、准药品、适用 于外皮的制品，因此，其剂型也可以采取水溶液体系、增溶体系、乳化体 系、粉末体系、凝胶体系、软膏体系、乳霜、水-油双层体系、水-油-粉末 三层体系等广泛的形态。例如作为化妆品，可以在例如化妆水、霜、乳液、 凝胶、美容液、软膏、面膜、入浴剂、沐浴皂、香波、清洗剂、粉底等中 应用。如果是药品或准药品，则可以以各种软膏、霜等形态应用。

在本发明的化妆品和/或皮肤外用剂中，可以包含能够在化妆品和/或 皮肤外用剂的制造中通常使用的有效成分和/或赋形剂，例如可以包含水、 醇、甘油、透明质酸等基质、表面活性剂、保湿剂、增稠剂、pH调节剂、 紫外线吸收剂、稳定剂、抗菌剂、香料等。

如图1所示，在角质形成细胞的培养细胞体系中，丝聚蛋白基因以约 24小时周期的节律而表达增减，认为该节律相当于昼夜节律。所谓昼夜节 律，特别是指通过由CLOCK、BMAL1、CRY、PER等时钟蛋白质构成 的反馈回路控制的、约24小时周期的周期节律，已知在生物体中，睡眠/ 清醒、激素分泌、体温、细胞周期等各种生理现象受其影响。

认为丝聚蛋白基因在体内(in vivo)也按照昼夜节律进行表达增减， 因而本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂通过与昼夜节律相配合地施与、更 具体而言通过以丝聚蛋白表达的最大时期或最小时期同步的方式施与，可 以更有效地促进丝聚蛋白合成。

本发明的另一方式中，本发明也涉及美容方法，按照丝聚蛋白基因表 达量的生物体节律、与通过施与丝聚蛋白基因表达促进剂而产生的丝聚蛋 白基因表达量的节律同步的时间安排，来施与丝聚蛋白基因表达促进剂。 在本发明中，所谓美容方法，不仅是对个人进行的方法，也可以在提供与 美容相关的商品时，作为适合顾客的化妆品的处方提供，可以由除医生以 外的化妆品售货员和/或美容师提供。

本发明的另一方式中，本发明涉及丝聚蛋白基因表达促进剂，其特征 在于，以如下方式使用：按照丝聚蛋白基因表达量的生物体节律、与通过 施与丝聚蛋白基因表达促进剂而产生的丝聚蛋白基因表达量的节律同步的 时间安排来施与。

在又另一方式中，本发明涉及丝聚蛋白基因表达促进方法，其中，对 需要促进丝聚蛋白基因表达的对象，按照丝聚蛋白基因表达量的生物体节 律、与通过施与丝聚蛋白基因表达促进剂而产生的丝聚蛋白基因表达量的 节律同步的时间安排，来施与丝聚蛋白基因表达促进剂。该丝聚蛋白基因 表达促进方法也是干燥肌肤，以及干燥性的肌肤疾病、例如老年性干皮症、 特应性皮炎、寻常性鱼鳞病等皮肤疾病的治疗方法。

所谓按照同步的时间安排来施与，是以丝聚蛋白基因的表达量在生物 体节律中的峰值、与通过施与丝聚蛋白基因表达促进剂而产生的丝聚蛋白 基因表达量的增减的峰值重叠的方式进行施与，是指在例如丝聚蛋白基因 表达量变成最大的16～22小时、更具体而言为17～21小时、进一步具体 而言为18～20小时之前，施与丝聚蛋白基因表达促进剂。实际上对于人而 言，推定丝聚蛋白基因表达的峰值在上午5时～11时左右，更具体而言在 上午6～10时，进一步具体而言在上午7时～9时，因此考虑优选在例如 其16～22小时、更具体而言17～21小时、进一步具体而言18～20小时之 前，施与丝聚蛋白基因表达促进剂。考虑优选在例如相当于16～22小时之 前的“上午7时～下午1时左右”～“下午1时～下午7时左右”之间施与。

如本发明中阐明那样，丝聚蛋白按照生物钟的节律而表达，认为如果 由于年龄增加和/或压力、熬夜和/或生活节奏的紊乱等一些原因而生物钟 的节律紊乱，则与其相应地丝聚蛋白的表达节律偏离和/或表达量减少。因 此，能够期待通过按照适当的时间安排来施与本发明的丝聚蛋白基因表达 促进剂，从而促进丝聚蛋白的表达节律的恢复，和/或使表达量增加。于是， 本发明的另一方式中，以按照适当的时间安排来施与为特征的本发明的丝 聚蛋白基因表达促进剂，也能够作为丝聚蛋白的表达节律的改善或恢复剂 使用。关于适当的时间安排，例如对于人来说，估计丝聚蛋白基因表达的 峰值在上午5时～11时左右，更具体而言在上午6～10时，进一步具体而 言在上午7时～9时，因此考虑优选在其16～22小时、更具体而言17～21 小时、进一步具体而言18～20小时之前，施与丝聚蛋白基因表达促进剂。

丝聚蛋白基因具有约24小时的周期性而增减，因而丝聚蛋白基因表达 促进剂的筛选中，针对培养角质形成细胞等培养细胞，将施与候选药剂后 约0～10小时、优选2～8小时、更优选4～6小时的表达最小期的丝聚蛋 白基因表达量、与16～22小时、优选17～21小时、更优选18～20小时的 表达最大期的丝聚蛋白基因表达量进行比较，由此可以更高精度地筛选丝 聚蛋白基因表达促进剂。在又另一方式中，可以以表达最大期的丝聚蛋白 基因表达量作为指标来筛选丝聚蛋白基因表达促进剂。在又另一方式中， 还可以以第2周期以后的表达最大期、例如40～48小时、64～72小时等 作为指标来筛选丝聚蛋白基因表达促进剂。

作为本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的有效药剂之一的天竺葵油， 是来自香叶天竺葵(Pelargonium graveolens)等天竺葵属的全草的精油， 例如是将上述天竺葵属的全草进行水蒸气蒸馏而得的精油。

作为本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的有效药剂之一的柏木油，是 来自意大利柏木(Cupressus sempervirens)的精油，例如是将柏木的枝叶 等进行水蒸气蒸馏而得的精油。

作为本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的有效药剂之一的玫瑰油，是 来自洋蔷薇(Rosa centifolia L)、突厥蔷薇(Rosa damascena Mill.)等 蔷薇属的花瓣的精油，例如是将上述蔷薇属的花瓣进行水蒸气蒸馏而得的 精油。

作为本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的有效药剂之一的白松香油， 是来自从伞形科的古蓬阿魏(Ferula galbaniflua)以及亲缘种的叶和/或芽 中渗出的胶状渗出物的精油，例如是进行水蒸气蒸馏而得的精油。

作为本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的有效药剂之一的胡椒油，是 来自作为属于胡椒科的多年生植物的胡椒(Piper nigrum L.)的浆果的精 油，例如是将浆果进行水蒸气蒸馏而得的精油。

作为本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的有效药剂之一的罗勒油，是 来自作为唇形科一年生草本植物的罗勒(Ocimum basilicum L.)的地上部 全草的精油，例如是将地上全草进行水蒸气蒸馏而获得的精油。

作为本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的有效药剂之一的花椒提取物， 是芸香科花椒属的花椒(Zanthoxylum piperitum)的提取物。本发明花椒 提取物可以通过常规方法得到，例如可以将花椒的叶、茎、根、花、果实、 果皮、果核、全草或它们的混合物与提取溶剂一同浸渍或加热回流后，过 滤、浓缩而得到。作为提取溶剂，只要是通常用于提取的溶剂，就能够任 意使用，例如可以将水、甲醇、乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇、甘油等醇类、 含水醇类、三氯甲烷、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷等有 机溶剂等分别单独使用或者组合使用。另外，也可以根据需要直接使用上 述溶剂提取而得的提取液，或者使用将上述提取液浓缩而得的提取物使用 吸附法、例如离子交换树脂而除去杂质而得的物质，或者使用使上述提取 液用吸附在多孔聚合物(例如Amberlite XAD-2)的柱上之后、用甲醇或 乙醇溶出并浓缩而得的物质。另外，也可以使用通过分配法、例如水/乙酸 乙酯提取而得的提取物等。从在直接适用于皮肤的化妆品或药品、例如皮 肤外用剂等中使用的观点考虑，优选使用低刺激性的溶剂，例如水、1,3- 丁二醇、甘油等提取而得的提取物。

所谓精油，是植物中包含的对水不溶～难溶性的有机化合物的混合物， 通常包含挥发性的有机化合物，与原料相应地具有芳香性。由于精油是植 物中包含对水不溶～难溶性的有机化合物的混合物，因此通常经水蒸气蒸 馏而生成。但是，在本发明中，精油并不是限于经水蒸气蒸馏而生成的混 合物，而是也包含以植物体的一部分为原料用有机溶剂提取的、对水不溶～ 难溶性的提取物。即，在本发明中，所谓“精油”，是通过用作原料的植物 (以及根据情况有时是其部位)而特定的有机化合物的混合物，是指具有 本发明所希望的效果、即丝聚蛋白基因表达促进作用的有机化合物的混合 物。

作为本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的有效药剂之一的邻甲基苯甲 酸甲酯(Methyl o-toluate，英语别名METHYL 2-METHYLBENZOATE)， 是分子式为C₉H₁₀O₂、分子量为150.17、常温下为液体的化合物。

作为本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的有效药剂之一的邻氨基苯甲 酸甲酯(Methyl anthranilate，英语别名METHYL 2-AMINOBENZOATE)， 是分子式为C₈H₉O₂N、分子量为151.17、常温下为液体的化合物。

作为本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的有效药剂之一的邻甲氨基苯 甲酸甲酯(Methyl N-METHYL ANTHRANILATE，英语别名2-Methyl  AMINO METHYL BENZOATE)是分子式为C₉H₁₁O₂N、分子量为165.20、 常温下为液体的化合物。

作为本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的有效药剂之一的3-(1’-哌 啶)-丙酸(3-(1’-piperidine)-propionic acid：1PP)是分子式为C₈H₁₅NO₂、 分子量为157.21、常温下为固体的化合物。

实施例

实施例1：来自人皮肤的角质形成细胞中的丝聚蛋白基因表达的研究

将市售的来自正常成人皮肤的角质形成细胞(Cellntec社)以3×10³个/cm²接种在培养板上，在上皮细胞用培养基(CnT-BM.1，Cellntec社) 中于37℃、5％CO₂气氛下培养。3天后，换成包含皮质醇50ng/mL的培 养基，于37℃、5％CO₂下进行同步培养。2小时后，换成通常培养基继续 培养，经时地采取细胞。利用市售的RNA提取-cDNA合成试剂盒(FastLane  Cell cDNA Kit，Qiagen社)由采取的细胞提取RNA，制备cDNA。利用 该cDNA通过定量PCR(QPCR)法测定丝聚蛋白基因的表达量。同时， 测定时钟基因PER3和BMAL1的表达量，与丝聚蛋白基因的表达节律进 行比较。QPCR法使用市售的QPCR试剂盒(BrilliantⅢUltra-Fast SYBR  Green QPCR Kit，Agilent社)和QPCR测定装置(MX-3000P Real-time  Quantitative PCR System，Agilent社)。将作为持家基因的RPLP0基因 的表达量进行定量而作为内标，计算出相对于RPLP0的相对表达量作为 丝聚蛋白基因表达量。PCR用引物使用市售的丝聚蛋白、PER3、BMAL1、 RPLP0用引物(Perfect Real Time Primer，タカラバイオ社)。表1显示 所使用的引物序列。

表1引物序列

将结果示于图1和图2。发现：在角质形成细胞的培养细胞体系中， 丝聚蛋白基因以约24小时周期的节律而表达增减，培养角质形成细胞中， 从利用皮质醇的同步培养开始，在约18小时后，丝聚蛋白基因的表达量变 成最大。考虑该节律相当于昼夜节律。另外，丝聚蛋白基因的表达节律与 时钟基因PER3的表达节律同相位，与BMAL1反相位。实际上对于人， 报告了PER3的表达峰值在上午5～11时、更具体而言在上午6～10时、 进一步具体而言在上午7～9时左右(非专利文献2)。由图2中记载的PER3 的表达峰值时间与丝聚蛋白基因的表达峰值时间的比较推测，人的丝聚蛋 白基因的表达峰值与PER3的表达峰值基本相同。

实施例2促进丝聚蛋白基因表达的药剂的筛选

将市售的来自正常成人皮肤的角质形成细胞(Cellntec社)以3×10³个/cm²接种在培养板上，在上皮细胞用培养基(CnT-BM.1，Cellntec社) 中于37℃、5％CO₂下培养。3天后，换成以1％的浓度添加了各种候选药 剂的培养基，于37℃、5％CO₂下继续培养，在2小时后和18小时后采取 细胞。作为候选药剂，添加花椒提取物(丸善制药社)、天竺葵油(香荣 兴业社)、柏木油(ビオランド社)、玫瑰油(ビオランド社)、白松香 油(ビオランド社)、胡椒油(ビオランド社)、罗勒油(ビオランド社)、 邻甲基苯甲酸甲酯(アルドリッチ社)、邻氨基苯甲酸甲酯(东京化成工 业社)、邻甲氨基苯甲酸甲酯(东京化成工业社)、丁香花蕾油(ビオラ ンド社)、山金车(香荣兴业社)。以未添加药剂作为对照，以皮质醇(培 养基中浓度50ng/mL)作为阳性对照。

利用市售的RNA提取-cDNA合成试剂盒(FastLane Cell cDNA Kit， Qiagen社)由采取的细胞提取RNA，制备cDNA。利用该cDNA通过定 量PCR(QPCR)法测定丝聚蛋白基因的表达量。QPCR法使用市售的 QPCR试剂盒(BrilliantⅢUltra-Fast SYBR Green QPCR Kit，Agilent 社)和QPCR测定装置(MX-3000P Real-time Quantitative PCR System， Agilent社)。将作为持家基因的RPLP0基因的表达量进行定量而作为内 标，计算出相对于RPLP0的相对表达量作为丝聚蛋白基因表达量。PCR 用引物序列使用表1所示的序列。

图3中显示了添加各种候选药剂2小时后、18小时后的丝聚蛋白基因 的表达量。显示了花椒提取物、天竺葵油、柏木油、玫瑰油、白松香油、 胡椒油、罗勒油、邻甲基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯、邻甲氨基苯甲 酸甲酯与对照相比，促进18小时后的丝聚蛋白基因的表达。另一方面，丁 香花蕾以及山金车中，虽然18小时丝聚蛋白基因增加，但其增加量与对照 组没有有意义的差异。

实施例3促进丝聚蛋白基因的表达的药剂

将市售的来自正常成人皮肤的角质形成细胞(Cellntec社)以3×10³个/cm²接种在培养板上，在上皮细胞用培养基(CnT-BM.1，Cellntec社) 中于37℃、5％CO₂下培养。3天后，换成添加了0.1％浓度的3-(1’-哌啶)- 丙酸(1PP：有机合成工业社)的培养基、添加了0.1％浓度的花椒提取物 的培养基、以及添加了0.1％浓度的1PP和0.1％的浓度的花椒提取物的培 养基，于37℃、5％CO₂下继续培养，在18小时后采取细胞。使用未添加 药剂作为对照。

利用市售的RNA提取-cDNA合成试剂盒(FastLane Cell cDNA Kit， Qiagen社)由采取的细胞提取RNA，制备cDNA。利用该cDNA通过定 量PCR(QPCR)法测定丝聚蛋白基因的表达量。QPCR法使用市售的 QPCR试剂盒(BrilliantⅢUltra-Fast SYBR Green QPCR Kit，Agilent 社)和QPCR测定装置(MX-3000P Real-time Quantitative PCR System， Agilent社)。将作为持家基因的RPLP0基因的表达量进行定量而作为内 标，计算出相对于RPLP0的相对表达量作为丝聚蛋白基因表达量。PCR 用引物序列使用表1所示的序列。将结果示于图4。1PP以0.1％具有与0.1％ 的花椒提取物同等的丝聚蛋白基因的表达促进效果，并且通过将花椒提取 物与1PP并用，进一步促进了丝聚蛋白基因的表达。

配合例

以下，显示本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的配合例，但本发明的 实施不限定于以下配合例。

香氛

室内香氛

熏香

入浴剂

按摩用凝胶

按摩霜

芳香性纤维

在铜铵纤维素溶液(纤维素浓度10重量％，铵浓度7重量％，铜浓度 3.6重量％)中，相对于纤维素重量，以0.1～20重量％的范围内添加、混 和内含有本发明的丝聚蛋白基因表达促进剂的微囊(粒径50μm以下，在 微囊中所占的药剂的比例为50重量％)后，按照通常的湿式纺丝方法进行 纺丝，经过精炼工序、干燥工序，制得芳香性纤维。

颗粒

锭剂(可咀嚼型)

片剂

糖果

口香糖

化妆水

乳液