一种利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂的方法

摘要

本发明公开了一种利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂的方法，属于农药筛选方法领域。本发明以质量百分比为20～40％的普朗尼克F127溶液为基质，将待测药剂和线虫液加入到基质中，在室温下放置48～72h，然后插入甘薯茎，培养3～15d，取出甘薯茎，对侵入甘薯茎的线虫计数，计算防效。与浸渍法相比，本发明方法能够综合评价待测药剂对线虫的致死作用，以及对线虫的活动能力与侵入能力的抑制作用，筛选准确度高，可靠性强；其次，本发明方法所用的甘薯茎以及马铃薯腐烂茎线虫易于在室内扩繁，材料易得，适宜大量药剂筛选；此外，本发明方法以植物寄生线虫为测试对象，与常用的秀丽小杆线虫相比，其检测结果更准确、可靠。

说明书

技术领域

本发明属于农药筛选方法领域，具体涉及一种利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂的方法。

背景技术

植物线虫是农业生产的主要病原物之一，每年给世界农业生产造成的经济损失约1000亿美元。植物线虫的防治方法包括抗病品种、轮作、水淹、曝晒、生物防治等(Roland N.P.等.Plant Nematology，CABI Publishing.2013.)，但化学防治依然是快速、经济有效的防治方法，深受农民的青睐。

传统的杀线虫剂筛选多以秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)为测试对象，评价供试药剂对该线虫的毒力(Ohba K等.Journal of Pesticide Science,1984,9:91-96)。目前商品化的杀线虫剂均是以该筛选模式进行初筛获得的，在初筛的基础上进一步以植物寄生线虫为测试对象，分别以浸渍法、盆栽法以及田间试验等进行复筛与验证。

杀线虫剂对线虫的作用方式有多种(Kearn J等.Pesticide Biochemistry andPhysiology.2014)，但由于线虫的抗逆性较强，对药剂多不敏感，一般情况下杀线虫剂对线虫的致死作用较差，杀线虫剂主要通过抑制卵孵化、抑制线虫迁移、控制线虫侵入、抑制线虫发育等复合作用来达到控制线虫的目的(邹雅新等.河北农业大学学报,2011,34(5):78-81)。浸渍法是筛选杀线虫剂的主要方法，也是我国测试杀线虫剂生物活性的标准方法(NY/T 1833.1-2009)。但浸渍法仅能够测试药剂对线虫的致死作用，而无法评价药剂对线虫卵的抑制作用、以及对线虫活动能力、侵入能力的作用，因此浸渍法会造成对线虫具有活性物质的漏筛。

普朗尼克F127(英文名称：Pluronic F127，化学式为：(C₃H₆O.C₂H₄O)x，又名嵌段式聚醚、聚醚、环氧丙烷与环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯、聚乙二醇接枝聚丙二醇、泊洛沙姆、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物、泊洛沙姆407等)在医学、制药以及化妆领域均有广泛的应用。20％～25％的普朗尼克F127在低温环境下呈液态，在常温下成半固态。由于该基质透明，线虫可在该基质内自由活动，适宜用于线虫行为研究(Ko M.P.等.Journal of Nematology,1988,20:478-485)。Ohba K等认为普朗尼克F127是适宜替代琼脂观察线虫行为的基质(Ohba K等.Journal of Pesticide Science,1984,9:91-96)；Congli等利用该基质研究番茄、拟南芥等植物对根结线虫的吸引活性(Congli W等,Nematology,2009,Vol.11(3),453-464；Ko M.P.等.Journal of Nematology,1988,20:478-485)。

经检索，没有发现利用普朗尼克F127进行杀线虫剂筛选的研究报道。

发明内容

针对现有的筛选杀线虫剂方法中存在的容易造成漏筛的问题，本发明目的在于提供一种利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂的方法，包括如下步骤：

(1)、按照质量百分比为20～40％的比例将普朗尼克F127放入蒸馏水中，置于0～6℃低温下过夜溶解，得普朗尼克F127母液；

(2)、用蒸馏水将马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor thorne)配制成10～1000头/mL的液体，得线虫液；

(3)、依据待测药剂的极性用丙酮或水将待测药剂溶解，然后用水稀释为质量体积比为1～20g/L的待测药剂溶液；

(4)、用质量百分比为0.1％的吐温80对步骤(3)所得的待测药剂溶液进行梯度稀释，然后和步骤(2)所得的线虫液一起加入到步骤(1)所得的普朗尼克F127母液中，使普朗尼克F127的终浓度为18～30％(质量百分比)，使线虫液的含量为5～100条/mL；缓慢振荡混匀，并倒入9cm培养皿中，室温下放置48～72h；

(5)、在培养皿中央插入长度为0.5～2.0cm的甘薯茎段，室温下培养3～15d，然后将甘薯茎段取出，采用浅盘法分离其中的线虫，计数；以不添加药剂处理为对照；计算待测药剂的防治效果，在待测药剂的防治效果大于20％时，即说明待测药剂在该测试浓度下对线虫具有活性；

防治效果(％)＝(对照处理侵入线虫数量-药剂处理侵入线虫数量)/对照处理侵入线虫数量×100％。

上述方法步骤(1)中所述的低温优选为0～4℃。

上述方法步骤(3)中所述的待测药剂是指化学药剂或生物代谢产物等。

上述方法步骤(4)中所述的普朗尼克F127的质量百分比优选为23％。

上述方法步骤(4)或(5)中所述的室温为20～30℃。

上述方法步骤(4)中所述的放置时间优选为48h。

上述方法步骤(5)中所述的甘薯茎段长度优选为1.0cm。

上述方法步骤(5)中所述的培养时间优选为5d。

与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明方法所用的基质普朗尼克F127具有在低温下呈液态、常温下呈固态的特性，可以模拟土壤环境进行杀线虫剂的筛选，将线虫可在放有寄主的普朗尼克F127中有效完成迁移、侵入、发育等过程；与传统的浸渍法相比，本发明方法能够综合评价待测药剂对线虫的致死作用，以及对线虫的活动能力与侵入能力的抑制作用，筛选准确度高，可靠性强。(2)本发明方法所用的甘薯茎以及马铃薯腐烂茎线虫易于在室内扩繁，材料易得，适宜大量药剂筛选。(3)本发明方法以植物寄生线虫马铃薯腐烂茎线虫为测试对象，由于植物寄生线虫与腐生线虫在食性与生活史上具有较大差异，因此，与以传统的秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)为测试对象相比，其结果更准确、可靠。

具体实施方式

实施例1利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂对比试验

(一)、试验设计：选用常规杀线虫剂80％涕灭威(山东华阳农药化工集团有限公司)、95％阿维菌素(河北威远生化农药有限公司)、90％丁硫克百威(江苏嘉隆化工有限公司)为供试化学药剂，以不添加药剂的处理作为对照。

(二)、试验方法：

(1)、将35g普朗尼克F127放入100ml蒸馏水中，置于4℃低温下过夜溶解，得普朗尼克F127母液。

(2)、用蒸馏水将马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)配制成100头/mL的液体，得线虫液。

(3)、将80％涕灭威、95％阿维菌素、90％丁硫克百威原药3种药剂分别用丙酮溶解，然后用水稀释成重量体积比为10g/L的母液。

(4)、用质量百分比为0.1％的吐温80分别将步骤(3)所得的涕灭威、阿维菌素、丁硫克百威母液进行梯度稀释，然后和步骤(2)所得的线虫液一起分别加入到步骤(1)所得的普朗尼克F127母液中，使普朗尼克F127的终浓度为为23％(质量百分比)，使线虫含量为50条/mL，使涕灭威、阿维菌素、丁硫克百威的浓度分别为320、160、80、40、20和10ug/ml；以不添加药剂的处理作为对照；缓慢振荡混匀，并向每个9cm培养皿倒入20ml，室温下放置48h；

(5)、在培养皿中央插入长度为1.0cm的甘薯茎段，测试品种为冀薯98，25℃黑暗培养箱内放置72h；然后将甘薯茎段取出，采用浅盘法分离其中的线虫，计数，根据药剂处理与对照处理的侵入线虫数量计算不同药剂处理对线虫侵入的防治效果；防治效果的计算公式为：

防治效果(％)＝(对照处理侵入线虫数量-药剂处理侵入线虫数量)/对照处理线虫侵入量×100％

浸渍法：将涕灭威、阿维菌素、丁硫克百威3种药剂用丙酮溶解，然后用水稀释成重量百分比为10g/L的母液；再用质量百分比为0.1％的吐温80依次将各药剂稀释成320、160、80、40、20和10ug/ml，以不添加药剂的处理作为对照处理，加入到9cm培养皿中，并添加线虫液混匀，使得线虫数量为50条/mL。25℃黑暗恒温培养箱内放置5d，检查不同处理的线虫数量，并依据药剂处理与对照处理的死亡率，计算防治效果。

结果(见表1)采用冀薯98(感病品种)为线虫寄主，在所有药剂浓度处理中本发明方法获得的防效均高于浸渍法；此外，两种方法均显示阿维菌素对线虫的毒力最高，在相同浓度处理条件下其防效显著高于涕灭威和丁硫克百威。上述结果说明本发明方法所得筛选结果比浸渍法所更灵敏，更准确。

表1不同测试方法对不同药剂浓度防效的试验结果

实施例2本发明利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂对比试验

(一)、供试药品：选用常规杀线虫剂涕灭威、阿维菌素、丁硫克百威为供试药剂，比较不同检测时间对药效评价的影响。

(二)、具体操作步骤同实施例1，分别在药剂与线虫接触5d、6d、7d、8d后检查药剂防效。即在本发明方法中插入冀薯98(感病品种)的甘薯茎段3d、4d、5d、6d后检查，在浸渍法中处理5d、6d、7d、8d后检查,上述供试药剂涕灭威、阿维菌素、丁硫克百威的测试浓度均为200ug/mL。以不添加药剂的处理作为对照。

结果(见表2)在所有测试时间，本发明方法获得的防效均高于浸渍法获得的防效；此外，两种方法均显示阿维菌素对线虫的毒力最高，在相同浓度处理条件下其防效显著高于涕灭威和丁硫克百威处理。另外，在所有药剂处理中，随着处理时间的延长，各药剂对线虫的防效均呈上升趋势。上述结果说明本发明方法对各药剂防效的筛选鉴定结果更准确、可靠。

表2不同测试时间对不同药剂浓度防效的影响

实施例3利用普朗尼克F127和不同品种的甘薯茎筛选杀线虫剂对比试验

(一)试验设计：选用常规杀线剂涕灭威、阿维菌素、丁硫克百威为供试药剂，以不添加药剂的处理作为对照处理。比较选用不同甘薯品种对药效评价的影响。

(二)试验方法：具体操作步骤同实施例1，分别选用冀薯98、冀薯4号、徐薯18、徐薯25的甘薯茎作为寄主，第5天检查结果；上述供试药剂涕灭威、阿维菌素、丁硫克百威的测试浓度均为150ug/mL，以不添加药剂的处理作为对照。

结果(见表3)选用不同的甘薯品种对于药效的评价结果趋势相同，采用本发明方法获得的线虫防效高于采用传统的浸渍法获得的防效，但选用抗性较强的品种如冀薯4号和徐薯25获得的防效低于选用感病品种冀薯98、徐薯18获得的防效。说明本发明方法应采用对马铃薯腐烂线虫较为敏感的甘薯品种作为测试材料。

表3不同甘薯品种对不同药剂浓度防效影响的对比试验