基于普朗尼克F127的Il-1Ra热敏凝胶缓释制剂及其对糖尿病的药效学研究

摘要

在世界范围内2型糖尿病在各类疾病中占有很大比例，它被认为是一种自身炎症综合症，它的特点是具有渐变性β-细胞功能紊乱和胰岛素抵抗，其中β-细胞功能紊乱是影响胰岛分泌胰岛素不足的主要因素，而胰岛素抵抗又是组织特异性炎症的诱因，导致其不能满足机体高血糖和代谢的需求。这里我们主要研究引发2型糖尿病的炎症机制，包括能够诱导炎症，胰岛素抵抗，降低胰岛素分泌和β细胞功能紊乱的机制。各种促进炎症发生的介质在2型糖尿病的病理过程中扮演着重要角色，因此深入研究2型糖尿病的炎症响应机制可能为了解进而更好的治疗2型糖尿病提供一种新的途径。传统抗糖尿病药物有很大的缺陷，因为其有多种潜在的副作用，如急性低血糖、体重增加、心脏和肝脏损伤、胃并发症、呼吸道和尿路感染等，因此希望能够开发更好的药物进入临床。2型糖尿病是一种自身炎症综合征，因此，许多抗炎疗法能够有效治疗2型糖尿病，其中白介素1受体拮抗剂(IL-1Rα)被认为是一种有效的抗糖尿病药物，它是一种天然抗炎剂。尽管IL-1Rα具有广谱抗炎和抗糖尿病活性，但由于其半衰期较短（6-8小时），导致其应用受到限制。考虑到研究2型糖尿病的的方法学限制，不可能直接将糖尿病患者作为实验对象，因此各种具有2型糖尿病典型特征的糖尿病动物模型被建立，用于2型糖尿病研究的相关实验。GK大鼠被认为是最好的非肥胖性2型糖尿病动物模型之一，特别是其用在关于病理生理机制研究方面。目前，GK大鼠已经被专门用于研究各种各样具有潜在2型糖尿病疗效的化合物的研究。
　　本研究对GK大鼠中与2型糖尿病相关的多种病理特征，包括涉及2型糖尿病多种发病机理作了全面的总结。GK大鼠是一种具有多种病理特点的动物模型，这些特点多或少在糖尿病患者中普遍存在并且具有功能性。这种动物模型被认为是研究2型糖尿病各种病理机制的最佳模型。IL-1受体拮抗剂广谱的抗炎作用已被用于对各种自身免疫性疾病的研究。尽管IL-1受体拮抗剂有着优异的广谱抗炎作用，但它的生物半衰期只有4～6小时，目前改善这一问题的策略主要是:延长半衰期或者延长IL-1受体拮抗剂在靶标位点的释放时间。为了解决延长IL-1受体拮抗剂的治疗持续时间的问题，首先我们对所有已经报到过的方法进行了综述。这些方法考察了IL-1受体拮抗剂的体外释放特性，药代动力学参数以及药效学评价。嵌段式聚醚Pluronic F127(PF127)是一种有效运送蛋白药物的重要生物材料。治疗蛋白被嵌入基于PF127的热敏凝胶中后，这些蛋白药物的热稳定性、生物利用度、生物相容性和疗效都得到了提高。通过对那些应用PF127作为热敏凝胶进行药物缓释的方法进行总结后没有发现已知毒副作用。我们得出的结论是，PF127对蛋白及多肽药物有很好的缓释作用。综上所述，我们可以预期应用PF127的药物在临床上是很有潜力。我们还比较了不同蛋白转运策略（与蛋白融合及可生物降解聚合物结合）对IL-1受体拮抗剂生物活性的影响。为了克服IL-1Rα半衰期短的缺点以及研究其在实验性大鼠模型（GK大鼠）中治疗2型糖尿病效果，我们首先比较了人类IL-1Rα和大鼠IL-1Rα的氨基酸序列，并且计算了它们与大鼠受体的结合情况。这项研究的目的是了解人类IL-1Rα和大鼠IL-1Rα的氨基酸序列、结构和配体之间连接相似性的关系。我们利用分子模拟技术进行结构测定、序列对比、结构修饰以及和相关蛋白的对接。最后，我们还利用AutoDock程序对大鼠受体(IL-1RI)的配体之间进行了对接。结果显示，人类IL-1Rα和大鼠IL-1Rα序列和结构的相似性和统一性分别是85.4％和73.6％。从蛋白对接的结果中，我们发现三个受体中有两个，即LYS290和ASP259在大鼠受体IL-1RI两种配体的结合中是一样的。两种配体结合位点明显的相似性说明两种配体可能拥有相同的治疗效果。以上研究还排除了一个物种的IL-1Ra用于另一物种时可能出现的不确定因素。
　　本研究发现人类IL-1Ra与大鼠IL-1Rα相似性以后，利用GK大鼠进一步研究IL-1Rα对2型糖尿病的治疗效果。我们给GK大鼠皮下注射IL-1Rα（10mg/kg、每天两次）一个月。同时，我们也给GK大鼠和Wistar大鼠注射生理盐水一个月，从而比较实验组与对照组的差别。在治疗期间，我们持续监控每组大鼠的体重和食物摄取量，同时每周对大鼠进行2-3次血糖水平测定。在治疗结束前，我们分别对大鼠进行绝食8小时测定其ITT以及绝食过夜后测定IPGTT。胰岛素抵抗和β-细胞的功能利用HOMA和QUICKI模型和做ITT和IPGTT之前测定的空腹胰岛素和葡萄糖水平计算。IL-1Rα在GK大鼠治疗期间没有影响大鼠的体重和/或食物摄入量。整个治疗期间，每组中GK大鼠的体重都持续增加，同时每组GK大鼠的平均进食量也持续增加，我们并未发现给药组的GK大鼠和对照组的Wistar大鼠和GK大鼠有任何显著差异。在治疗之前，GK大鼠（两组）和Wistar大鼠的血糖含量有显著差异。在利用IL-1Ra以及生理盐水治疗的初期，对GK大鼠连续12天注射IL-1Ra，给药组和对照组的血糖含量没有明显差异，提示IL-1Ra并未显著改善其血糖水平。同时，GK大鼠（两组）和Wistar大鼠之间的血糖含量仍然存在显著差异。后来，由于持续注射IL-1Ra，12天以后，GK大鼠给药组的血糖含量开始下降，在治疗后期GK大鼠给药组和对照组的血糖含量出现显著差异。同时发现实验组GK大鼠和Wistar大鼠的血糖含量没有显著差异，而GK大鼠对照组的血糖含量明显高于Wistar大鼠对照组的血糖含量。ITT和IPGTT结果表明对GK大鼠持续注射IL-1Rα明显改善了其胰岛素敏感性和葡萄糖耐量，这表明IL-1Ra具有改善胰岛素敏感性和保护β-细胞的功能。此外，在治疗后期，我们考察了多种代谢物在血清中的水平，血清中胰岛素原、胰岛素和胰岛素原/胰岛素比率在GK大鼠实验组中显著降低，同时IL-1Rα在GK大鼠实验组中也展现了其对各种血脂水平和肾功能生物标志物的显著疗效。免疫组织化学分析显示，与对照组相比，在经过IL-1Ra治疗的GK大鼠中，胰岛细胞中只存在最少量的吞噬细胞，这表明胰岛内炎症的减少。我们研究的结果表明IL-1Rα在GK大鼠中具有广谱治疗潜力，因为它通过改善糖耐量和胰岛素敏感性从而显著降低IL-1β与IL-1依赖的促炎介质的不良反应。但由于较短的生物半衰期（6-8小时）而需要高剂量、频繁给药。因此，有必要开发一种缓释制剂延长它的半衰期。为了应对IL-1Ra生物半衰期短的问题，到目前为止，已经建立了许多策略延长其半衰期和延长IL-1Ra从其靶点的稳定持续释放。所有的方法要么通过融合蛋白技术将IL-1Ra与其他蛋白融合以延长其半衰期，要么通过使用各种生物降解聚合物开发新的剂型以延长其在靶点的稳定持续释放时间。这些方法已经进行了体外释放特征和IL-1Ra的药代动力学和药效学参数的考察。但是这些方法都未曾在糖尿病动物模型中去考察其对2型糖尿病的效果。除此之外，这些方法也存在一些局限性。在本研究中，我们利用生物降解聚合物PF127用于IL-1Ra的缓释。PF127曾被报道能延长多种蛋白药物的缓释过程及其血清半衰期。因此，我们延伸此法用以克服IL-1Ra生物半衰期短的问题，我们第一次利用基于PF127的热敏凝胶制成了IL-1Ra的新剂型，并研究其在体内和体外延长半衰期的效果。我们利用冷法准备了三种浓度(20％，25％和30％)的PF127凝胶，考察了多种流变性特征(GT和粘度)并利用非膜溶解法进行体外药物释放动力学研究。我们用SDS-PAGE分析了载IL-1RaPF127凝胶剂型的体外稳定性。在此基础上，我们还利用20％和25％的PF127凝胶在wistar大鼠上进行体内研究以及25％的载药PF127进行IL-1Ra生物活性的体内研究。从结果中，我们发现GT和PF127的浓度呈反相关，而粘度和PF127的浓度呈正相关。IL-1Ra从PF127凝胶中的体外释放模式遵循零级释放动力模型。我们还用AIC计算释放动力模型的R2值，进而预测IL-1Ra体外释放的最佳拟合模型，零级释放动力模型因其与其它模型相比具有最低的R2值而被认为是最佳拟合模型。根据Korsmeyer-Peppas方程，IL-1Ra从PF127凝胶中的释放机理取决于PF127凝胶的侵蚀性和浓度。SDS-PAGE证明了在体外释放时的IL-1Ra稳定性。当与IL-1Ra水溶液直接相比时，载药PF127凝胶在体内和体外释放IL-1Ra的时间延长，同时对降低血糖和抑制IL-6的IL-1β刺激产物也表现出更好的效果。IL-1Ra在体内的吸收和IL-1Ra在25％和PF127凝胶中的释放相关性良好，其相关系数达到R2=0.9952.
　　本文研究了在在不同温度(4℃、25℃和40C)下储存三个月的PF127凝胶剂型中IL-1Ra的稳定性。定期采集样本用于研究其体外药物释放动力学。结果发现，在整个过程中，4C条件下PF127凝胶剂型中IL-1Ra的GT、粘度和体外释放模式保持相同。差示扫描量热仪(DSC)的结果显示PF127凝胶剂型可以提高其中IL-1Ra的热稳定性。在整个FTIR光谱中IL-1Ra没有明显变化，表明在IL-1Ra结构中没有聚合物效应。此外FTIR的结果也表明在整个研究期间没有药物-聚合物相互作用，而SDS-PAGE结果证明了在PF127中IL-1Ra的稳定性。这些结果为下面的结论提供了证据:PF127是一种理想的聚合物，不仅有利于IL-1Ra的持续性运输，而且在延长半衰期的同时保持了其结构稳定性。利用GK大鼠研究25％的PF127中IL-1Rα的长期抗糖尿病效果。我们给GK大鼠皮下注射载IL-1Ra的25％PF127凝胶剂型（10mg/kg/天）一个月，同时在Wistar大鼠和GK大鼠中注射正理盐水一个月进行对照。在治疗期间，每周对大鼠进行2-3次体重监测和血糖含量测定。在治疗结束之前，对大鼠进行空腹过夜后测定其IPGTT。我们还利用HOMA-IR，HOMA-β，FIGR和QUICKI模型和空腹胰岛素和葡萄糖水平计算了胰岛素抵抗、胰岛素敏感和β-细胞的分泌功能。载IL-1Rα的25％PF127凝胶剂型在GK大鼠实验组中表现出持续性、长期性的降血糖效应并且在治疗期间对GK大鼠的体重没有影响。治疗之前，Wistar大鼠和GK大鼠（两组）的血糖含量有明显区别。给药后的前15天，GK大鼠实验组和对照组的血糖含量没有明显差异，说明此时载IL-1Rα的25％PF127凝胶剂型没有改变GK大鼠的血糖含量，而Wistar大鼠和GK大鼠（两组）的血糖含量仍然明显区别。继续进行给药治疗后，GK大鼠实验组的血糖含量从治疗的第15天开始下降并且在治疗结束时发现实验组和对照组的血糖含量有明显差异。同时在治疗后期，我们也发现GK大鼠实验组和Wistar大鼠的血糖含量没有显著差异，而GK大鼠对照组的血糖含量明显高于Wistar大鼠对照组的血糖含量。IPGTT结果表明载IL-1Ra的25％PF127凝胶剂在被治疗的动物中能增加其葡萄糖耐受量，同时增加胰岛素敏感性和β-细胞的分泌功能。GK大鼠实验组和Wistar大鼠在给予葡萄糖刺激后分泌的胰岛素含量明显高于GK大鼠对照组。基于空腹血糖和胰岛素水平，我们还利用多种模型估计了胰岛素抵抗、胰岛素敏感和β-细胞分泌功能。HOMA-IR，HOMA-β,FIGR和QUICKI模型的结果显示，载IL-1Ra的25％PF127凝胶剂型降低了胰岛素抵抗和β-细胞分泌功能。此外，在治疗后期，我们考察了多种代谢物的血清水平，血清中胰岛素原、胰岛素和胰岛素原/胰岛素比率在GK大鼠实验组中显著降低，同时IL-1Ra在GK大鼠实验组中也展现了其对各种血脂水平和肾功能生物标志物的显著疗效。与生理盐水治疗的GK大鼠相比，用载IL-1Ra的25％PF127凝胶剂治疗后，免疫组织化学分析显示胰岛细胞中只含有微量的巨噬细胞。同时，在被治疗的动物的皮肤和肾脏中没有发现PF-127诱导的病理性变化。因此，我们得出结论:载IL-1Ra的PF127凝胶剂在GK大鼠中具有缓解2型糖尿病症状的广谱抗炎作用。我们相信将IL-1Ra制成PF127缓释剂型有可能成为最佳剂型之一，达到临床治疗所需的效果而不需要大剂量、频繁给药。我们的研究对安全有效的利用生物降解聚合物PF127持续性释放IL-1Ra以及其在GK大鼠中皮下注射1个月的应用提供了进一步的了解。因此，利用PF127进行药物的持续性释放是解决IL-1Ra生物半衰期短的一种途径。

目录

声明

Acknowledgments

Table of Contents

List of figures

List of tables

Abstract

摘要

Part Ⅰ：Study background and review of literature

Chapter #1 Type 2 diabetes mellitus and its treatment strategy

Abstract

1．1 Introduction

1．2 Mechanisms of inflammatory responses for pathogenesis of T2DM

1．3 Role of pro-inflammatory mediators for dissemination of T2DM

1．4 Factors that potentiate tissue-specific inflammation in T2DM

1．5 Treatment strategies for T2DM

1．6 Recent advances for treatment of T2DM and implications of IL-1Ra

1．7 Conclusion

References

Chapter #2 GK-rats：a non-obese spontaneous type 2 diabetic animal model

Abstract

2．1 Introduction

2．2 Animal-modelling for T2 DM investigation

2．3 GK-rats

2．4 Conclusion

References

Chapter #3 IL-1Ra and its delivery strategies

Abstract

3．1 Introduction

3．2 Development of therapeutic proteins

3．3 Current delivery strategies for IL-1Ra

3．4 Future perspectives

3．5 Conclusion

References

Part Ⅱ：Experimental work

Chapter #4 Sequence comparison，structure similarity and computational docking of human IL-1Ra and rat IL-1Ra on rat receptor

Abstract

4．1 Introduction

4．2 Materials and Methods

4．3 Results

4．5 Discussion

4．6 Conclusion

References

Chapter #5 IL-1Ra improves normoglycemia and insulin sensitivity in diabetic GK-rats

Abstract

5．1 Introduction

5．2 Materials and methods

5．3 Results

5．4 Discussion

5．5 Conclusion

References

Chapter #6 Sustained delivery of IL-1Ra from pluronic F127-based thermosensitive gel prolongs its therapeutic potentials

Abstract

6．1 Introduction

6．2 Materials and methods

6．3 Results and discussion

6．4 Conclusion

References

Chapter #7 Stability studies of IL-1Ra loaded in PF127 gel during the stability-study period

Abstract

7．1 Introduction

7．2 Materials and Methods

7．3 Results

7．4 Discussion

7．5 Conclusion

References

Chapter #8 Sustained delivery of IL-1Ra from PF127-based thermosensitive gel reduces hyperglycemia in diabetic GK-rats

Abstract

8．1 Introduction

8．2 Materials and methods

8．3 Results

8．4 Discussion

8．5 Conclusion

References

Chapter #9 Key findings and future perspectives

9．1 Key findings

9．2 Future perspectives

Author biography