重组人脑利钠肽注射剂及其制备方法

摘要

本发明提供了一种人脑利钠肽液体制剂的配方，其包含如下组分：人脑利钠肽0.5 mg/ml，缓冲液体系，多元糖醇，氨基酸，盐化合物。发明还公开了人脑利钠肽液体制剂的制备方法。发明通过对辅料的选择，使得重组人脑利钠肽液体制剂具有良好的稳定性和活性，保证了用药的安全性和有效性。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种重组人脑利钠肽注射液制剂的处方及其制备方法。

背景技术

蛋白的不稳定性主要包括化学不稳定性和物理不稳定性，化学不稳定性通过键的形成或断裂导致蛋白的修饰，主要包括脱酰胺化、消旋、水解、氧化、β-消除和二硫键断裂或交换等，物理不稳定性不会导致蛋白的共价变化，而是包含蛋白的更高级结构（二级结构及以上）变化，主要包括变性、吸附、聚集和沉淀等。蛋白类药物制剂处方研究目的是在维持蛋白天然的、具有药学活性的结构基础上，稳定延长蛋白药物的储存时间，以保证蛋白药物可接受的贮存期限。

重组人脑利钠肽（Recombined Human Brain Natriuretic Peptide，rhBNP）由32个氨基酸残基组成，是心力衰竭时人体分泌的作为代偿功能的一种内源性多肽。其目前作为急性心力衰竭的治疗药物具有作用靶点明确，特异性强，非强制性地增强心肌的收缩能力，且没有目前扩血管药和利尿药物对血压和心率改变的副作用；该药物不论从其不良反应的控制或者疗效等方面考虑均明显优于传统的药物，目前已被临床上广泛应用。

目前已上市的药物为冻干粉针剂。冻干粉制剂是在无菌环境下将药液冷冻成固态，抽真空将水分升华干燥而成的无菌粉注射剂。水针剂是指已经溶解了药物的注射液。与水针剂型相比较，冻干粉剂型存在临床使用较繁琐，需要溶媒进行溶解，操作过程可能产生二次污染等缺点；同时重组人脑利钠肽在使用过程中需要根据体重调节药物的静脉冲击剂量和静脉滴注速率，因此在给药过程中对产品剂量准确性有较高的要求，此外该产品为心力衰竭的急救药物，对产品的使用过程的便捷性也应加以考虑。

本发明旨在通过对不同辅料组合，进行处方筛选保证重组人脑利钠肽产品稳定性和活性的基础上，开发重组人脑利钠肽预灌封注射液水针剂型，以解决目前该类药品在液体状态下的稳定性较差等问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种重组人脑利钠肽液体制剂，其包含如下组分：重组人脑利钠肽0.5 mg/ml、缓冲液体系、多元糖醇、氨基酸和盐化合物。

本发明所述缓冲液体系可包括磷酸盐缓冲液体系，柠檬酸盐缓冲液体系或醋酸盐缓冲液体系，优选情况下为柠檬酸缓冲液体系或醋酸缓冲液体系，缓冲液浓度为20-100 mM，pH值为3-6。进一步优选地，本发明所述缓冲液体系为柠檬酸盐缓冲液体系，浓度为20 mM，pH值为3-4。

本发明所述多元糖醇选自甘露醇、甘油、蔗糖或海藻糖的一种或多种。优选情况下为甘油或蔗糖或海藻糖，浓度分别为甘油1-10 mg/ml或蔗糖10-30 mg/ml或海藻糖20-60 mg/ml。

本发明所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、精氨酸，浓度为1-5 mg/ml。优选情况下，所述氨基酸为精氨酸或组氨酸，浓度为1-5 mg/ml。

本发明所述的盐化合物为可以维持人体液平衡和离子浓度的盐化合物或者以非特异性方式与蛋白结合，增加蛋白的热稳定性，防止蛋白变性的盐化合物，优选为氯化钠，浓度为9 mg/ml。

具体来讲，本发明所述的重组人脑利钠肽液体制剂可以为：

处方1：重组人脑利钠肽500 μg/ml，柠檬酸16 mM，柠檬酸钠4 mM，蔗糖10 mg/ml，组氨酸5 mg/ml，氯化钠9 mg/ml；

处方2：重组人脑利钠肽500 μg/ml，柠檬酸13 mM，柠檬酸钠7 mM，甘油1 mg/ml，组氨酸2.5 mg/ml，氯化钠9 mg/ml；

处方3：重组人脑利钠肽500 μg/ml，柠檬酸16 mM，柠檬酸钠4 mM，甘油1 mg/ml，组氨酸5 mg/ml，氯化钠9 mg/ml；

处方4：重组人脑利钠肽500 μg/ml，柠檬酸16 mM，柠檬酸钠4 mM，蔗糖10 mg/ml，精氨酸5 mg/ml，氯化钠9 mg/ml

处方5：重组人脑利钠肽500 μg/ml，柠檬酸13 mM，柠檬酸钠7 mM，甘油1 mg/ml，精氨酸2.5 mg/ml，氯化钠9 mg/ml； 或

处方6：重组人脑利钠肽500 μg/ml，柠檬酸16 mM，柠檬酸钠4 mM，甘油1 mg/ml，精氨酸5 mg/ml，氯化钠9 mg/ml。

本发明还提供了该重组人脑利钠肽液体制剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）取处方量的人脑利钠肽、缓冲液、多元糖醇、氨基酸、盐化合物，用注射用水溶解，溶液备用；或

（2）取处方量的缓冲液、多元糖醇、氨基酸、盐化合物，溶解于含有处方量的人脑利钠肽的溶液中，所得溶液备用；

（3）将步骤（1）或（2）所得溶液滤过后灌封。

本发明的有益效果：本发明通过对辅料的优选，包括对缓冲液体系、多元糖醇、氨基酸、盐化合物的优选，使得重组人脑利钠肽在液体制剂中具有良好的稳定性和活性，并且达到使用方便和用药准确的效果。

附图说明

图1. 制剂处方1在4℃ 放置18个月的高效液相色谱法测定结果。

图2. 制剂处方1在4℃ 放置18个月的活性测定结果。

以下将通过具体实施方式对本发明的内容进行详细说明。然而应当理解，具体实施例仅用于说明本发明，并不能理解为对本发明的保护范围的限制。基于本发明公开的技术手段，利用本领域公知常识和惯用手段进行的各种常规的替换、变更等都属于本发明的范围。

具体实施方式

1. 剂量选择:

本产品采用静脉推注与持续静脉滴注相结合的给药方式，首先以1.5 μg/kg静脉冲击后，以0.0075 μg/kg/min的速度连续静脉滴注24 h；负荷剂量:1.5-2 μg/kg，维持剂量速率：0.0075-0.01 μg/kg/min。本专利根据国内患者平均体重与给药方式计算，并且参考已上市产品规格最终选择500 μg/ml (剂量)。

2. 缓冲体系筛选：

主要考察不同缓冲液、不同pH值与不同缓冲液浓度对重组人脑利钠肽稳定性的影响，将500 μg重组人脑利钠肽置于1 ml不同类型的缓冲液之中，缓冲体系分别采用磷酸盐缓冲体系，醋酸盐缓冲体系与柠檬酸盐缓冲体系，各缓冲体系浓度分别为20 mM、50 mM与100 mM，pH范围根据不同缓冲液的最适缓冲范围确定，上述所有样品于25℃放置1个月，通过高效液相色谱法检测产品浓度变化情况，实验方案与结果见表1。结果表明，醋酸与柠檬酸缓冲液在pH值为4和5时产品稳定性最佳，且整体试验结果与磷酸缓冲液相比较好，柠檬酸缓冲液在同等条件下结果略好于醋酸缓冲液，同时不同浓度的醋酸与柠檬酸缓冲体系之间未见显著差异。

表1. 缓冲体系筛选试验结果

3. 稳定剂筛选：

3.1 多元糖醇

主要考察不同的多元糖醇与浓度对重组人脑利钠肽稳定性的影响，将500 μg 重组人脑利钠肽置于1 ml不同类型的多元糖醇之中，稳定剂选择为常规注射用多元糖醇，分别为甘露醇、甘油（丙三醇）、蔗糖与海藻糖，上述所有样品于25℃放置1个月，通过高效液相色谱法检测产品浓度变化情况，多元糖醇筛选方案与试验结果见表2。结果表明，甘油与蔗糖条件下产品稳定性与甘露醇和海藻糖相比较好，甘油与蔗糖之间结果基本一致，同时不同浓度的多元糖醇之间未见显著差异。

3.2. 氨基酸

当用作制剂辅料时，氨基酸会减少蛋白二级结构的改变，主要考察不同氨基酸与浓度对重组人脑利钠肽稳定性的影响，将500 μg 重组人脑利钠肽置于1 ml不同类型的氨基酸之中，氨基酸选择为甘氨酸，组氨酸与精氨酸，上述所有样品25℃放置1个月，通过高效液相色谱法检测产品浓度变化情况，氨基酸浓度与结果见表3。结果表明，精氨酸与组氨酸条件下产品稳定性与甘氨酸相比较好，此外由于组氨酸与精氨酸均属于碱性氨基酸，其加入会导致溶液中pH值升高，其所加入量对稳定性影响应综合两种因素进行考虑。

3.3. 盐化合物：

盐化合物是蛋白制剂中常见的添加剂，通过以非特异性方式结合蛋白和增加热稳定性，防止蛋白变性，根据该产品生产工艺，获得重组人脑利钠肽中含有氯化钠，钠和氯是机体重要的电解质，主要存在于细胞外液，对维持正常的血液和细胞外液的容量和渗透压起着非常重要的作用，根据药物的给药方式与人体的需求，因此制剂中加入终浓度为9 mg/ml氯化钠。

4. 处方组合：

将以上单因素考察所得结果较好的处方进行组合，配制成1 ml/支的注射液，所有样品25℃放置1个月，通过高效液相色谱法检测产品浓度变化，肉眼观察注射液外观变化情况，处方组合方案与试验结果见表4至表11，因精氨酸与组氨酸为碱性氨基酸，精氨酸与组氨酸的加入会导致缓冲体系pH值升高，因此为使最终药液维持此前缓冲体系筛选时获得最稳定pH值，将缓冲体系的pH值根据此前的筛选结果调节至3.5与4.0，在加入精氨酸与组氨酸后使药液最终pH值维持在4.0-5.0之间。结果表明，柠檬酸缓冲液条件下样品初步稳定性结果略好于醋酸缓冲液，甘油与蔗糖稳定性基本一致，不同浓度之间未见明显差异，组氨酸与精氨酸稳定性基本一致，样品稳定性随精氨酸与组氨酸浓度增加显示有所提升，但受到体系内pH变化影响，两者影响导致的稳定性变化趋势需综合考虑。

二、制剂稳定性试验

1.制剂处方：

根据处方组合筛选结果，选择稳定性较好的6组处方进行稳定性试验，制剂处方如表12所示。

2. 样品制备

产前准备：

将所用管道、器材、包装材料按GMP要求处理，原辅料准备，器具灭菌。

药液配制：

稀释缓冲液的配制：按处方所需量称取柠檬酸，柠檬酸钠加入终体积60%的注射用水、分别加入甘油（蔗糖）、精氨酸（组氨酸）与氯化钠搅拌溶解，测定pH4.5±0.5，定容，冷却，用0.22 μm滤膜精滤，备用。

半成品的配制：将原液与稀释液按比例混合，定容至终体积，制剂终浓度为500 μg/mL，0.22 μm滤膜过滤除菌。

所需稀释缓冲液体积计算公式： c=V－dV/a；V=b+c；dV =ab

a:原液浓度； b:所需原液体积；c:稀释液体积；

d:终浓度（500 μg/mL）；V:分装量

半成品检测：检测药液的pH、产品含量，内毒素，无菌。

分装：在局部百级条件下，拆除注射器与胶塞外包装，手动分装，1 ml/支。

加塞：在局部百级条件下分装完毕后，手动加塞。

灯检：目测观察无可见异物，贴签。

产品全检合格后，包装，入库。

3. 稳定性方案

稳定性方案根据药品注册申报标准制定，主要考察注射液制剂处方在长期、加速与高温条件下的产品稳定性，具体试验方案见表13。

4. 质量标准

制剂处方稳定性考察的质量标准参照药品申报稳定性相关指导原则，《中国药典》2010版第三部，已上市产品质量标准及其它相关生物制品质量标准制定，具体质量标准见表14。

5. 稳定性试验结果

稳定性试验结果见表15-20，根据稳定性试验结果显示，在长期试验（4℃±2℃）条件下放置18个月该6组制剂处方各项指标均能够满足质量标准的要求，产品在冷藏储存条件下放置其效期不低于18个月；在加速试验（25℃±2℃）条件下6组制剂处方放置1个月产品各项指标均能够满足质量标准的要求，放置2个月时6组制剂处方产品纯度已低于质量标准要求的≥95%，证明蛋白对于温度较为敏感，这6组制剂处方在室温下放置时间不能超过1个月；在高温试验（37℃±2℃）条件下放置5天时6组制剂处方各项指标均能够满足质量标准的要求，放置10天时6组制剂处方产品纯度已低于质量标准要求的≥95%，证明该产品制剂在高温下放置时间不能超过5天。综合以上数据显示，此6种制剂处方稳定性受温度影响较大，冷藏储存（4℃±2℃）条件下所涉及6组制剂处方稳定性较好，有效期不低于18个月，常温储存（25℃±2℃）保存不能超过1个月，高温储存（37℃±2℃）保存不能超过5天，提示依据该6组制剂处方所制备的产品在运输程中应尽量在冷藏条件下储存，药液在使用时也不应再室温及高温条件下长期放置。

三、测定方法：

1. 含量与纯度测定法（高效液相色谱法）：

原理：参照《中国药典》2010版三部附录Ⅲ B高效液相色谱法。

仪器设备：高效液相色谱仪（Waters 2695-2998，美国Waters公司）。

试剂耗材：Xbridge^TM>

试剂配制：

流动相A：含0.1% TFA的100%水溶液；

流动相B：含0.1% TFA的100%乙腈溶液；

检测条件：柱温40℃，215 nm紫外检测，对照品与待测样品分别上样20 μl；洗脱梯度：0-30 min，B：0%-60%；30-40 min，B：60%-100%，40-42 min，B：100%-0%；42-45 min，B：0%；流速：1 ml/min，采用外标法计算待测样品含量，面积归一化法计算待测样品纯度

含量计算方法：

C_X=C_R×A_X/A_R

C_X为待测样品含量；

C_R为待测样品峰面积；

A_X为对照样品含量；

A_R对照样品峰面积；

纯度计算方法：采用面积归一化法计算各杂质峰面积及其总和，并求出占总峰面积的百分率，溶剂峰不计算在内。

2. 活性测定法（细胞为基础的竞争性ELISA法）：

原理：本法系根据重组人脑利钠肽与其受体GC-A结合后可以催化GTP转化为cGMP，采用竞争ELISA法检测cGMP含量来测定重组人脑利钠肽的生物学活性。

仪器设备：酶标仪（Multiskan FC 美国Thermo公司）

试剂耗材：检定细胞293GCAC3购自中国食品药品检定研究院，DMEM培养基购自Hyclone公司，胰蛋白酶购自Hyclone公司，G418购自Ameresco公司，抗生素购自Hyclone公司，IBMX购自Sigma公司，cGMP一抗购自Abcam公司，cGMP-HRP购自Genscript公司，TMB显色底物购自KPL公司，Protein G预包被酶标板购自Pierce公司，其它试剂均为国产分析纯。

试剂配制：选择培养基：DMEM+10% 胎牛血清+1% 双抗+ 200 μg/ml G418；

样品稀释液：PBS+0.2% BSA + 1mM IBMX；

PBST洗液：PBS + 0.05% Tween-20；

ELISA稀释液：PBST + 0.5% BSA；

TMB终止液：0.5 M硫酸；

IBMX浓缩液（100 mM）：溶于DMSO；

标准品：取脑利钠肽活性对照品（制备方法参照“一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法和应用”，申请号201410139968.2）用样品稀释液复溶并稀释至0.625 μg/ml，2倍比稀释，共8个稀释度，每个稀释度做3个孔；

供试品：取供试品用样品稀释液按标示量稀释至0.625 μg/ml，2倍比稀释，共8个稀释度，每个稀释度做3个复孔；

测定方法：（1） 取对数生长期的293GCAC3细胞，消化离心，用DMEM+5%胎牛血清+1%双抗+ 200 μg/ml G418重悬后，计数，调整细胞浓度至1.5×10⁵/ml，180>

（2） 用样品稀释液将活性对照品和供试品稀释至0.625 μg/ml，2倍比稀释，共8个稀释度，每个稀释度做3个孔。取20 μl/孔转移至细胞板中，放入培养箱内孵育1.5 h；

（3） 取出Protein G预包被酶标板，PBST洗液250 μl/孔，清洗4次；用ELISA稀释液按1：6000稀释cGMP一抗，100 μl/孔加入酶标板，室温震荡1 h；倒掉一抗包被液， PBST洗液250 μl/孔，清洗4次；

（4） 配制HRP-cGMP工作液：用ELISA稀释液按1：1000稀释HRP-cGMP；

（5） 取细胞上清和HRP-cGMP工作液各50 μl同时加入包被好的酶标板中，室温震荡2 h；

（6） 倒掉酶标板中的液体，用PBST洗液 250 μl/孔，清洗4次；

（7） 加入TMD 100 μl/孔，反应约20 min，加入终止液100 μl/孔；

（8） 酶标仪450 nm/620 nm波长测定吸光度，记录测定结果。

结果计算

实验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算结果

供试品生物学活性(IU/ml)=Pr×(Ds×Es)/(Dr×Er)

Pr为标准品生物学活性，IU/ml；

Ds 为供试品预稀释倍数；

Dr 为标准品预稀释倍数；

Es 为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

Er 为标准品半效稀释倍数。

3. 其它检测

其余检测方法均参照《中国药典》2010版三部附录中相应检测方法。