一种检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心酶联免疫法

摘要

一种检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心酶联免疫法，属于免疫分析领域。本发明用灭活的丁香假单胞杆菌斑点致病变种灭活病菌免疫8周龄BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选得6株产特异性单抗的杂交瘤细胞株。6株抗体分别标记HRP并以丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌为目标物两两配对。以抗体1D3（CGMCCNo.9312单克隆细胞株Q号）和抗体6C6（CGMCCNo.9313单克隆细胞株R号）分别作为包被抗体和酶标抗体，建立了丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心ELISA法，LOD为1.5*105cfu/mL。本发明的ELISA法检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌特异性好，灵敏度高，成本低，可实现对丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌高通量测定。

说明书

技术领域

本发明涉及了一种定量检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心法，属于免疫分析领域。 

背景技术

丁香假单胞杆菌斑点致病变种(Pseudomonas syringae pv. Maculicola)是世界上重要的十字花科蔬菜病菌，主要引起十字花科细菌性黑斑病。该病菌在分类上属于原核生物细菌界、变形杆菌门、假单胞菌科。该菌最适培养温度在25 - 27℃，主要宿主有白菜、萝卜、花椰菜等十字花科蔬菜。 

加强检疫工作，预防带菌种子在非疫区传播是控制该病菌的重要措施。国内外报道主要在致病机理、分离菌株分型等方面，目前还未见有免疫检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的报道。 

发明内容

(一)要解决的技术问题 

  本发明的目的在于建立一种丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心ELISA检测方法，用于特异、灵敏、批量、快速检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌。

(二)技术方案 

实现上述目的，本发明首先应用灭活的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌免疫8周龄的BALB/c小鼠，经过免疫、细胞融合、筛选后得到6株产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。6株抗体分别标记辣根过氧化物酶（HRP）并以丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌为目标物进行两两配对。以抗体1D3和6C6分别作为包被抗体和酶标抗体，建立了丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心ELISA分析方法，LO D为1.5 *10 ⁵cfu/mL。

一种检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心酶联免疫法，是基于单克隆抗体的ELISA法，包被抗体为1D3即CGMCC No.9312单克隆细胞株Q号，检测抗体为6C6即CGMCC No.9313单克隆细胞株R号； 

（1）丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌单克隆抗体的制备：

以丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌灭活菌体（NCPPB1820，菌株来自湖南省进出口检验检疫局）做为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠；经杂交瘤技术融合、筛选得到； 

（2）单克隆抗体的配对筛选：

将纯化后的6株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体2μg/mL；包被液为0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；标品浓度1×10⁸cfu/mL；标品稀释液0.01M、pH7.2的PBS；酶标抗体稀释500倍使用；在此条件下，实验成功得到了6对P/N值>5的配对；

（3）夹心法的建立：选择检测限稳定、灵敏的配对，即以1D3即CGMCC No.9312单克隆细胞株Q号为包被抗体，6C6即CGMCC No.9313单克隆细胞株R号作为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：

包被抗体1D3浓度：5μg/mL；

包被液：0.01M、pH9.6碳酸盐缓冲液；

标品稀释液：0.01M、pH7.2 PBS+0.2% Tween；

酶标抗体6C6-HRP浓度：2μg/mL；

反应时间：包被抗体：封闭37℃，反应2h；标准品：37℃，反应1h；酶标抗体37℃，反应1h；显色时间10min。

所述检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心酶联免疫法的LOD为1.5×10⁵ cfu/mL。 

本发明方法的检测分析原理是： 

酶标板上包被了适量的捕获抗体1D3；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液220μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品和对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体6C6-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色12min。如果样品有足够的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌，那么丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌被捕获抗体捕获并与酶标抗体6C6-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值（P/N≥2.1），并被判定为阳性；如果样品无丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌或浓度太低（P/N≤2.1）那么无丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

(三)有益效果 

本发明提供的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌双抗体夹心检测方法采用了理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，稳定性好、成本低，能同时检测大量样品，适合丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的检测要求，具有推广和应用价值。

生物材料样品保藏：丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌（NCPPB1820），来自湖南省进出口检验检疫局。细胞株Q号，分类命名单克隆细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.9312，保藏日期2014年5月28日。细胞株R号，分类命名单克隆细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.9313，保藏日期2014年5月28日。 

附图说明

图1  丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌双抗体夹心法的标准曲线。 

具体实施方案

以下通过实施例进一步说明本发明。 

一、仪器： 

TGL－40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂；

KFLOW纯水机，凯佛隆公司；                                                    

ZD–9556水平摇床，太仓科教器材厂；                                         

96孔8×12可拆酶标板，厦门怡佳美实验器材有限公司；

MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司；

可调试移液器，Thermo Labsystems公司；

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂。

二、试剂： 

四甲基联苯胺(TMB)，上海晶纯实业有限公司；

其他试剂均为分析纯试剂。

三、步骤 

1．单克隆抗体的制备

a、实验动物：选5只8周龄的BALB/c小鼠进行免疫；

b、抗原配制：将免疫原用生理盐水稀释，配成10⁹cfu/mL的溶液；

c、乳化：将上述免疫原溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠；

免疫方法：按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合；

d、采血：第三次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价；

e、融合、筛选：采用杂交瘤技术进行融合，采用间接ELISA筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆；

f、抗体的纯化和保存：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度，分装后放入-20℃保存。

2、ELISA反应过程： 

抗体效价测定步骤：

a、将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 μL/孔，于4 ℃冰箱过夜；次日取出酶标板回至室温，每孔注入200 μL PBST溶液，摇床上振荡3 min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次；以下洗涤方法相同；

b、充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200 μL/孔，于37 ℃温育箱内温育2 h后取出烘干待用；

c、将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干；

d、每孔加入100 μL，1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干；

e、每孔加入100 μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37 ℃反应15 min，取出后每孔加入100 μL终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀。

丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌双抗体夹心法测定步骤： 

a、包被：用5μg/mL的1D3包被酶标板，100μL /孔，4℃过夜；

b、洗涤：用PBST洗涤酶标板三次，每次3min，200μL / 孔，然后甩干酶标板；

c、封闭：含0.2%明胶的CBS，200μL /孔，37℃封闭2h；

d、洗涤：同b；

e、样品：用PBST将丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌稀释成1×10⁸、3.3×10⁷、1.1×10⁷、3.7×10⁶、1.23×10⁶、4.12×10⁵、1.37×10⁵ cfu/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照。每孔加入100μL样品，于37℃温育1h；

f、洗涤：同b；

g、加酶标抗体(6C6-HRP，2μg/mL)，100μL /孔，37 C反应1h；

h、洗涤：同b；

i、显色：加底物TMB 100μL /孔，显色10min；

j、终止：加终止液50μL /孔；

k、测定：用酶标仪检测OD₄₅₀nm。

交叉反应的测定： 

将水稻细菌性谷枯病菌（Burkholderia glumae，NCPPB 3591），水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola，NCPPB 1585），玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii subsp.stewartii，NCPPB449），丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv.syringae，NCPPB2844）稀释到10⁸ cfu/mL、10⁷ cfu/mL，在建立的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌双抗体夹心法体系中检测吸光值，并设空白孔和丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌阳性对照，每个浓度做6次测定平均值，做3次重复实验。

试验结果如下： 

1、标准曲线：本发明所获得的抗原检测的检测范围是为10⁶～10⁸cfu/mL，具体请见说明书附图图1。

2、LOD：LOD是空白的平均吸收值加3倍的空白吸收值的标准偏差对应的菌体浓度，丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌双抗体夹心法LOD为1.5×10⁵ cfu/mL。 

3、交叉反应率(CR%) 

结果：丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌正常显色，而10⁸ cfu/mL及以下浓度的其它测试菌株均不显色（OD< 0.15）。说明建立的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌双抗体夹心ELISA法与水稻细菌性谷枯病菌，水稻细菌性条斑病菌，玉米细菌性枯萎病菌，丁香假单胞菌丁香致病变种无交叉反应，特异性良好。