致产蛋异常重要病毒多重PCR检测引物及方法

摘要

本发明提供一种致产蛋异常重要病毒多重PCR检测引物及方法，制备针对3种引起家禽产蛋异常重要病毒产蛋下降综合征病毒、禽坦布苏病毒及H9亚型禽流感病毒等病毒核酸的特异性捕获探针，与对应的病毒核酸杂交后，在连接酶作用下环化，随后通过一对探针特异性的通用检测引物进行PCR扩增进行检测，依据获得的扩增产物大小确定感染病原。该方法既可用于单一病毒的检测，又可同时鉴别诊断3种不同的病毒，具有高效率、高特异性、高敏感度、低成本的特点，适合产蛋禽出现产蛋异常时大量临床样品的检测分析，是明确引起产蛋异常的病原的早期快速鉴别诊断及分子流行病学分析的重要技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及致产蛋异常重要病毒多重PCR检测引物及方法，具体涉及一种连接酶依赖的致产蛋异常重要病毒多重PCR鉴别检测方法及其应用，属于预防兽医学领域。

背景技术

近些年来，我国种禽和蛋禽在饲养过程中因疫病导致产蛋异常的问题愈来愈严重，主要表现为产蛋量和蛋品质异常，如产蛋量难以达到正常峰值或骤然下降，出现软壳蛋、沙壳蛋、薄壳蛋、畸形蛋及小型蛋等，严重影响种（蛋）禽的生产性能，造成了巨大经济损失。现有研究表明，很多病原均可导致种（蛋）禽产蛋下降，如禽坦布苏病毒（ATV）、产蛋下降综合征病毒（EDSV）、H9亚型禽流感病毒(H9AIV)、禽1型副黏病毒（APMV-1）及沙门氏菌等多种细菌性病原。产蛋家禽的流行病学调查表明，60%以上的产蛋异常病例是由三种病毒中的一种或两种感染引起，而且临床上由这三种病原感染后引起的很多临床症状与病变十分类似，常继发或并发而易误诊或延误治疗，从而引发更为严重的经济损失。

禽坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属的RNA病毒，是2010年4月在我国浙江、江苏和福建等地新发现的引起开产蛋鸭、种鸭出现以产蛋骤降、低死亡为主要特征的急性高度接触性传染病的病原。该病毒感染产蛋家禽后主要造成产蛋家禽的卵泡膜充血、出血，卵泡变性、萎缩及瘢痕化等，极大的影响家禽的产蛋性能，发病后2天后家禽产蛋率下降达30%-70%，严重的于发病后7~14天停产，部分感染病例出现不可逆性停产。到2014年底，我国东南沿海及周边地区均出现该病的流行，除了产蛋鸭和鸡，鹅、肉鸭和麻雀等均有感染报道，该病已严重危害到我国养禽业的持续健康发展。

产蛋下降综合征病毒属于禽腺病毒Ⅲ型的DNA病毒，是于1976年发现的引起家禽以产蛋下降为特征的一种传染病的病原，该病毒感染后主要引起鸡群产蛋骤然下降，软壳蛋和畸形蛋增加等，故又命名为产蛋下降综合征1976。不同年龄的鸡和鸭均可感染，但幼龄家禽不表现临床症状。产蛋家禽感染该病毒后，开始发病时有或没有一般性的下痢、食欲下降和萎靡不振，随后蛋壳褪色，接着泛起软壳蛋、薄壳蛋。病程持续4～10周，产蛋下降幅度达10%～40%，种蛋孵化率降低，出壳后弱雏增多，产蛋下降持续4～10周后一般可恢复正常。

H9亚型禽流感病毒是正黏病毒科的RNA病毒，现有研究表明该病毒感染产蛋家禽后同样可引起家禽的产蛋率、受精率及孵化率下降等危害。当 20~ 30 周龄种禽感染时,会出现的呼吸道症状，同时产蛋量出现群体性下降，4~ 5天内产蛋量可下降30 % ~70 % , 部分病例的产蛋禽甚至完全停止产蛋。4周后, 产蛋禽缓慢恢复产蛋, 但达不到感染前的水平。

连接酶依赖的PCR扩增技术是一种由连接酶介导的核酸检测技术，其工作原理是：以一段人工合成的外源核酸序列作为捕获探针，利用其两端连接的与待检核酸序列互补的寡核苷酸序列，与待测样品中的目标的核酸杂交，从而在待检核酸链上形成一个带缺口的、首尾靠近的环，随后在连接酶作用将该环闭合形成一个完整的环；最后用针对该环外源核酸序列部分的特异性引物在DNA聚合酶催化下进行PCR扩增，达到检测待测基因的目的。当检测多个目的核酸序列时，只需加入将各自特异性的捕获探针进行杂交，最后用同一对检测引物进PCR扩增，即可到达鉴别诊断的目的。该技术不直接扩增待检核酸，而是通过扩增与待检基因特异性杂交的外源基因来达到检测待检核酸的目的，既避免了检测的非特异性，又因减少了PCR扩增时的引物数量，使检测效率和敏感性得到了保证。

因此，根据连接酶依赖的PCR扩增技术原理，建立一种可快速鉴别诊断禽坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9亚型禽流感病毒的多重PCR检测方法作为产蛋家禽产蛋异常病原的常规性检测及疫病突发时病原的及时确诊是十分有效的，为产蛋异常疫病病原的早期诊断及防治措施的制定和执行提供可靠的技术支撑。

发明内容

本发明提供致产蛋异常重要病毒多重PCR检测引物及方法。该方法是基于连接酶的工作原理，用特异性的捕获探针与对应的病毒核酸杂交，并在连接酶作用下环化，随后应用一对通用引物对环化的、针对不同病原的捕获探针进行检测，依据获得的扩增产物大小确定感染病原。

所述连接酶是指DNA Taq 连接酶。

所述的3种引起产蛋禽产蛋异常重要病毒为产蛋下降综合征病毒、禽坦布苏病毒及H9亚型禽流感病毒，其特异性的捕获探针序列分别如Seq ID No.1，Seq ID No.2和Seq ID No.3所示。

针对3种病毒核酸捕获探针的通用检测引物序列如Seq ID No.4和Seq ID No.5所示。

其检测程序主要分3个阶段，第一阶段为变性阶段，95℃维持5 min；第二阶段为连接酶介导的捕获探针与模板的杂交及探针环化阶段，95℃ 50 s, 55℃~63℃ 5-10 min 进行6个循环；第三阶段为PCR检测阶段 95℃ 30 s, 52℃~56℃ 30 s, 72℃ 30 s 进行25个循环，最后72 ℃ 10 min结束反应。

为获得上述发明目的，本发明采用的技术方案是：依赖于连接酶的多重PCR扩增方法，包括以下步骤：

1、病原核酸特异性探针的制备：根据GenBank中已发布的产蛋下降综合征病毒的100kd蛋白基因、禽坦布苏病毒的衣壳蛋白基因及H9亚型禽流感病毒的血凝素蛋白基因保守区序列保守区及增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的部分序列，设计3对引物，这3对引物的特征在于5`端分别为以上3种病原核酸序列的互补寡核苷酸序列，3`端为外源基因（本发明中为增强型绿色荧光蛋白基因）核酸序列。以绿色荧光蛋白质粒作为模板，用这3对引物分别进行常规PCR扩增，获得的3种扩增产物经纯化回收后即可作为病毒核酸特异性捕获探针。

2、通用检测引物的设计：根据3种病原捕获探针的共有序列（外源基因部分，即增强型绿色荧光蛋白基因）设计一对反向引物，该对引物的特征在于其与待检测的病原目的基因亲缘关系远，特异性的与已环化的捕获探针上的增强型绿色荧光蛋白基因杂交后，在DNA聚合酶作用下启动PCR扩增过程。

3、多重PCR检测方法的建立和优化：

（A）多重PCR反应体系的配置，所述多重PCR反应体系总计30 μL，包括dNTPs 0.3 mM, 10×Taq DNA 连接酶反应缓冲液3 μL, Taq DNA连接酶 0.5 μL, 10×Taq DAN聚合酶反应缓冲液 3 μL（含Mg²⁺）, Taq DNA聚合酶 0.50 μL, 通用检测引物各8 pmol, 3种捕获探针和 DNA 或 cDNA 溶液各2 μL，加去离子水补足至30 μL，另外配置一份不含样品DNA或 cDNA的反应液做阴性对照。

（B）多重PCR的反应程序 所有反应均在同一个反应管中完成，主要分3个阶段，第一阶段为变性阶段，95℃维持5 min；第二阶段为连接酶介导的捕获探针与模板的杂交及探针环化阶段，95℃ 50 s, 55℃~63℃ 5-10 min 进行6个循环；第三阶段为PCR检测阶段 95℃ 30 s, 52℃~56℃ 30 s, 72℃ 30 s 进行25个循环，最后72 ℃ 10 min结束反应。扩增结束后立即进行电泳显示检测结果。PCR检测的特异性还可以通过将PCR产物纯化回收后送生工上海生物工程有限公司测序验证。

（C）检测技术的优化 优化的技术方案中，应用上述3种捕获探针与待检样品的核酸杂交时，每30μL的PCR反应体系中每个探针的用量为8-12 pmoL。

优化的技术方案中，应用的通用引物检测环化的捕获探针时，每30μL的PCR反应体系中每个探针的用量为7-10 pmoL。

本发明的显著优点：

根据连接酶的工作原理，本发明首次建立了一种连接酶依赖的致产蛋异常重要病毒多重PCR检测技术，特异性的应用于引起家禽产蛋异常重要病毒产蛋下降综合征病毒、禽坦布苏病毒及H9亚型禽流感病毒的快速鉴别。该方法既可用于单一病毒的检测，又可同时鉴别3种不同的病毒，具有高效率、低成本的特点。

本发明中所涉及的病毒核酸特异性捕获探针是以与所检测的3种病毒核酸序列亲缘关系都很远的绿色荧光蛋白基因片段为骨架，在片段两端各连接一段与待检测病毒核酸序列互补的寡核苷酸序列后制备而成。通过探针两端的目的基因互补序列特异性捕获目的病毒基因，而中间的绿色荧光蛋白基因片段则作为3种探针的共有序列并作为PCR检测的靶基因。因此，既避免了传统多重PCR技术中多引物相互间的干扰扩增效率的问题，又因为通过扩增与待检基因杂交的外源基因避免了检测的非特异性，提高了检测的准确性和敏感性。

附图说明

图1是实施例中PCR扩增产物的电泳图。图中各泳道分别代表为：M、DNA Marker (DL2000); 1、减蛋综合征病毒；2、禽坦布苏病毒；3、H9亚型禽流感病毒；4、减蛋综合征病毒+禽坦布苏病毒；5、减蛋综合征病毒+H9亚型禽流感病毒；6、禽坦布苏病毒+H9亚型禽流感病毒；7、减蛋综合征病毒+禽坦布苏病毒+H9亚型禽流感病毒；8、阴性对照。

具体实施方式

实施例1

病毒特异性捕获探针的制备

本发明中用于检测引起家禽产蛋异常的3种病毒的特异性捕获探针，是通过如下方法推导获得的：

1.1、     根据GenBank中已发布的产蛋下降综合征病毒（EDSV）的100kd基因、禽坦布苏病毒(ATV)的衣壳蛋白基因及H9亚型禽流感病毒(H9AIV)的血凝素蛋白基因保守区序列保守区及增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的部分序列，设计3对引物用于制备捕获探针（引物信息见下表1）。

1.2、以绿色荧光蛋白质粒（pIRES2-EGFP, Takara生物技术有限公司，大连）作为模板，分别用以上3对引物进行扩增。PCR反应体系为50μL：10 x FastPfu Buffer 5 μL，FastPfu DNA polymerase 1 μL（2.5 u/μL），dNTP (10 mM) 1μL, 10引物各1 μL, 模板2 μL，用去离子水补充体积至50 μL。反应程序如下：94 ℃预变性3 min，按94 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1min 进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min 结束反应，取5 μL产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，扩增产物经纯化回收后即可作为病毒核酸特异性捕获探针。为验证这些探针的正确性，可将纯化回收探针克隆进平端克隆载体pEASY-Blunt，送生工上海生物工程有限公司进行测序，3种探针的序列分别如Seq ID No.1，Seq ID No.2和Seq ID No.3所示。

实施例2：

连接酶依赖PCR检测方法的建立

2.1 根据已获得的3种病毒捕获探针的核酸序列，设计一对反向通用检测引物，上游引物为Seq ID No.4（rEGFPF）: 5’- CTCGGCGCGGGTCTTGTAGTT - 3’，下游引物为Seq ID No.5（rEGFPR）: 5’- CTCGGCGCGGGTCTTGTAGTT - 3’，应用这对引物扩增针对不同病毒核酸的、环化的探针可获得不同大小的核酸片段。

2.2 采集表现产蛋异常的鸭肝脏或输卵管，按常规方法匀浆后，以含双抗无菌PBS缓冲液(pH 7.2)进行1:3稀释，分成2份，反复冻融3次后，取1份进行8 000 r·min-1离心10min，取上清用DNR/RNA extraction kit（QIAGEN公司）分别提取总DNA和RNA，参照试剂盒操作说明书进行。提取获得的RNA样品按Reverse transcription kit(Ivitrigen公司)操作说明书，用六碱基随机引物反转录获得cDNA，cDNA和提取获得的DNA分别作为下一步进行PCR扩增的模板。

取上述制备的待检样品DNA或cDNA模板、切胶回收的捕获探针及通用检测引物进行连接酶依赖的PCR检测分析。PCR反应体系为30μL：包括dNTPs 0.3 mmol·L^-1, 10×Taq DNA 连接酶反应缓冲液3 μL, Taq DNA连接酶（5U/ μL）0.5 μL, 10×Taq DAN聚合酶反应缓冲液 3 μL（含Mg²⁺）, Taq DNA聚合酶（5U/ μL）0.50 μL, 通用检测引物各20 pmol, 3种捕获探针和 DNA 或 cDNA 溶液各2 μL，用去离子水补足至30 μL。反应程序如下：95℃ 5 min； 95℃ 50 s, 55℃~63℃ 7 min 进行6个循环； 95℃ 30 s, 53 30 s, 72℃ 30 s 进行25个循环，最后72 ℃ 10 min结束反应。取产物5μLPCR扩增产物在 1.0%琼脂糖凝胶上电泳，电泳电压设定为5V/cm。当样品电泳至适当位置是，用紫外凝胶成像系统（Bio-rad, Gel Doc 2000）观察记录结果（见图1）。电泳后扩增片段的长度分别为减蛋综合征病毒436bp、禽坦布苏病毒480bp和H9亚型禽流感病毒681bp。根据有无以上扩增片段作出是否感染相应的病毒判断。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  福建省农业科学院畜牧兽医研究所

 

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