鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对及其试剂盒

摘要

本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对及其试剂盒。本发明提供的引物对，由如下5对引物对组成：引物对1(序列1和序列2)、引物对2(序列3和序列4)、引物对3(序列5和序列6)、引物4(序列7和序列8)、引物对5(序列9和序列10)。应用本发明所提供的试剂盒对仓储豆象进行种的鉴定，具有不受标本个体发育状态及样品完整性的影响，具有省时、高效、准确的优点。本发明可在粮食储藏部门和检疫部门广泛应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种鉴定或辅助鉴定仓储豆 象的引物对及其试剂盒。

背景技术

豆象属鞘翅目(Coleoptera)豆象科(Bruchinae)，分布于除南极之 外的世界各大陆，尤其以亚洲的热带区以及中美和南美的数量最多。 豆象科昆虫目前全世界记录约1400种，分属于58个属。该科昆虫大 约84％的种类取食豆科植物种子，成为栽培豆科植物的一类重要害 虫。我国储藏物中豆象科昆虫共记载有18种，其中绿豆象 Callosobruchus chinensis(Linnaeus)、蚕豆象Bruchus rufimanus  Boheman和豌豆象Bruchus pisorum(Linnaeus)为我国主要的储藏豆类 害虫；而菜豆象Acanthoscelides obtectus(Say)和四纹豆象 Callosobruchus maculatus为我国规定禁止入境的检疫性害虫。

由于豆象个体微小(约2-5mm)且种间外部形态极为相似等原因， 传统的形态学鉴定技术仅能鉴定具有明显特征形态的成虫，并要求工 作人员具有丰富的种类鉴定经验。同时，豆象能够以卵、幼虫、蛹、 成虫随寄主果实和运输工具等进行远距离人为传播，且以卵、幼虫、 蛹等非成虫态样品为主，需将其饲养至成虫才能进行种类鉴定。因此， 传统的基于形态学特征的豆象种类鉴定技术已不能满足快速、准确鉴 定豆象种类的需求。

随着现代分子生物学技术的发展，利用现代分子生物学技术进行 豆象种类鉴定，不受豆象发育阶段和环境条件的影响，对于非成虫态 的样品及形态结构不完整的成虫样品，均能从基因序列上获得准确、 可靠的鉴定信息。

但是，分子生物学鉴定方法主要包括同工酶电泳技术、限制性片 段长度多态性分析(RFLP)技术、随机扩增DNA多态性分析(RAPD) 技术、核酸序列分析技术及特异引物PCR技术。限制性片段长度多 态性PCR技术结果较为准确，但筛选所需限制性内切酶种类的工作 量较大。

目前，还没有一种高效、便捷鉴别不同仓储豆象种类的鉴定方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种鉴定或辅助鉴定仓储 豆象的引物对及其试剂盒，从分子水平对豆象进行种类鉴定，是一种 高效、便捷的方法，对于采取有效的防治措施和检疫处理措施具有重 要意义。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种鉴定或辅助鉴定仓储豆 象的引物对，其由以下5对引物对组成，分别为引物对1～引物对5：

1)引物对1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA 组成；

2)引物对2由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA 组成；

3)引物对3由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA 组成；

4)引物对4由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA 组成；

5)引物对5由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA 组成。

其中，序列1由22个核苷酸组成；序列2由22个核苷酸组成； 序列3由25个核苷酸组成；序列4由21个核苷酸组成；序列5由 22个核苷酸组成；序列6由22个核苷酸组成；序列7由19个核苷 酸组成；序列8由26个核苷酸组成；序列9由22个核苷酸组成；序 列10由22个核苷酸组成。

所述仓储豆象为如下中至少一种：豌豆象、四纹豆象、蚕豆象、 菜豆象和绿豆象。

基于上述引物对本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定仓储豆象 的试剂盒，包括如下5对引物对中至少一对：

1)引物对1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA 组成；

2)引物对2由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA 组成；

3)引物对3由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA 组成；

4)引物对4由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA 组成；

5)引物对5由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA 组成。

进一步地，所述试剂盒中组成每对引物的两条单链DNA的摩尔 数相同。

所述仓储豆象为如下中至少一种：豌豆象、四纹豆象、蚕豆象、 菜豆象和绿豆象。

在所述试剂盒中，所述引物对1特异于豌豆象；所述引物对2特 异于四纹豆象；所述引物对3特异于蚕豆象；所述引物对4特异于菜 豆象；所述引物对5特异于绿豆象。

所述试剂盒还包装有：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种 dNTP。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定仓储豆象的方法，包括以下 步骤：

1)以待测仓储豆象的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1 或3所述5对引物对进行PCR扩增，获得相应的扩增产物，检测PCR 扩增产物大小；

若所述引物对1扩增产物的大小为166bp，则待测仓储豆象为豌 豆象；

若所述引物对2扩增产物的大小为276bp，则待测仓储豆象为四 纹豆象；

若所述引物对3扩增产物的大小为167bp，则待测仓储豆象为蚕 豆象；

若所述引物对4扩增产物的大小为432bp，则待测仓储豆象为菜 豆象；

若所述引物对5扩增产物的大小为274bp，则待测仓储豆象为绿 豆象。

在上述方法中，所述PCR扩增中，PCR扩增的退火温度为54℃。

在上述方法中，所述PCR扩增中，反应体系中每对引物的两条 单链DNA的摩尔比均为1∶1。本发明中，每对引物中单条引物在各 自的PCR反应体系中的摩尔浓度均为0.4μΜ。

在上述方法中，所述166bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表 中序列11；所述276bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列12；

所述167bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列13；

所述432bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列14；

所述274bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列15。

检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。

本发明的有益效果在于：

1)本发明针对豌豆象、四纹豆象、蚕豆象、菜豆象和绿豆象这 5种世界常见的仓储豆象，基于mtDNA COⅠ基因序列分别设计了特 异引物，可直接鉴别以上5种仓储豆象；

2)与传统形态鉴定方法相比，该方法不需要形态分类学基础且 实现了对非成虫态的鉴定；

3)技术通用性强，对仪器设备要求不高，在实际工作中容易推 广应用；

4)操作过程简单、耗时较短、灵敏度高且较稳定。

附图说明

图1为用于鉴定豌豆象引物对(引物对1)的特异性检测结果；

图2为用于鉴定四纹豆象引物对(引物对2)的特异性检测结果；

图3为用于鉴定蚕豆象引物对(引物对3)的特异性检测结果；

图4为用于鉴定菜豆象引物对(引物对4)的特异性检测结果；

图5为用于鉴定绿豆象引物对(引物对5)的特异性检测结果；

图6为用于鉴定豌豆象引物对(引物对1)的灵敏度检测结果；

图7为用于鉴定四纹豆象引物对(引物对2)的灵敏度检测结果；

图8为用于鉴定蚕豆象引物对(引物对3)的灵敏度检测结果；

图9为用于鉴定菜豆象引物对(引物对4)的灵敏度检测结果；

图10为用于鉴定鉴定绿豆象引物对(引物对5)的灵敏度检测 结果。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明 的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业 途径得到。

实施例1特异引物对的设计

通过在GenBank中搜索查询豌豆象、四纹豆象、蚕豆象、菜豆 象和绿豆象的mtDNA COⅠ序列，用DNAMAN软件对目标种的 mtDNA CO Ⅰ序列进行比对分析，根据分析结果，针对目的基因序列 人工设计特异引物，并用Oligo软件对引物进行评估，检查引物Tm 值、GC％、错配、二聚体和发夹结构等，并用GenBank中的Blast 程序检查同源序列。

设计的5对引物对如表1所示：

表1 为特异引物序列

实施例2豆象的鉴定

1、豆象DNA的提取

采用盐析法提取单头豆象的基因组DNA，包括豌豆象、四纹豆 象、蚕豆象、菜豆象和绿豆象。以上豆象种类均经形态特征确认。

将单头豆象用液氮处理于1.5ml离心管中研磨成粉末状，并迅速 加入300μL TNES(50mM Tris，pH7.5，400mM NaCl，20mM EDTA，0.5％SDS)和100μg/mL蛋白酶K，于37℃温浴4h；加入 85μL 5M的NaCl，剧烈震荡15s，14000rpm离心5min；取上清， 加入等体积的冰冷无水乙醇，轻混匀；14000rpm离心5min，用70％ 乙醇洗一次。室温下干燥沉淀，加入适量50μL无菌水将提取的DNA 溶解。然后置于-20℃保存备用分别得到编号为1-5的豆象基因组 DNA。

2、PCR特异性扩增

分别以步骤1得到的基因组DNA为模板(用水作为阴性对照)， 用实施例1设计的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物， 用水作为阴性对照。

PCR反应体系如下(25μL)：10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL、2.5mM dNTP 2.5μL、10μM引物(上下游引物)各1.0μL、2.5U/μL Taq酶 0.2μL、基因组DNA 1μL，ddH₂O 16.8μL。

PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s、54℃退火30s、 72℃延伸1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。

将5μL步骤2的PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测， 溴化乙锭(EB)染色，在凝胶成像系统中观察并成像分析。

结果如图1-5所示，其中，M：DNA相对分子量标准；1：豌豆 象；2：四纹豆象；3：蚕豆象；4：菜豆象；5：绿豆象；6：阴性对 照。

图1为豌豆象引物(引物对1)PCR特异性检测凝胶电泳结果， 结果可以看出，编号为1的豌豆象得到166bp的PCR产物；经过测 序，编号为1的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列6；其他豆 象没有PCR产物，说明引物对1可用于特异鉴定豌豆象。

图2为四纹豆象引物对(引物对2)PCR特异性检测凝胶电泳结 果，结果可以看出，编号为2的四纹豆象得到276bp的PCR产物； 经过测序，编号为2的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列7； 其他豆象没有PCR产物，说明引物对2可用于特异鉴定四纹豆象。

图3为蚕豆象引物对(引物对3)PCR特异性检测凝胶电泳结果， 结果可以看出，编号为3的蚕豆象得到167bp的PCR产物；经过测 序，编号为3的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列8；其他豆 象没有PCR产物，说明引物对3可用于特异鉴定蚕豆象。

图4为菜豆象引物对(引物对4)PCR特异性检测凝胶电泳结果， 结果可以看出，编号为4的菜豆象得到432bp的PCR产物；经过测 序，编号为4的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列9；其他豆 象没有PCR产物，说明引物对4可用于特异鉴定菜豆象。

图5为绿豆象引物对(引物对5)PCR特异性检测凝胶电泳结果， 结果可以看出，编号为5的绿豆象得到274bp的PCR产物；经过测 序，编号为5的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列10；其他 豆象没有PCR产物，说明引物对5可用于特异鉴定绿豆象。

实施例3特异引物对的灵敏度检测

分别将实施例2中得到的编号为1-5的豌豆象、四纹豆象、蚕豆 象、菜豆象和绿豆象基因组DNA用蒸馏水进行系列稀释，得到5种 稀释液；5种稀释液中的基因组DNA浓度分别为：50ng/μl、25ng/μl、 10ng/μl、5ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.1ng/μl、0.05ng/μl。分别以每种 稀释液为模板(水为阴性对照)，用上述5对特异性引物对分别对其 特异种进行PCR扩增。

PCR反应体系如下(25μL)：10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL、2.5mM dNTP 2.5μL、10μM引物(上下游引物)各1.0μL、2.5U/μL Taq酶 0.2μL、基因组DNA 1μL，ddH₂O 16.8μL。

PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s、54℃退火30s、 72℃延伸1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。

PCR扩增结束后，取5μL PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电 泳检测，溴化乙锭(EB)染色，在凝胶成像系统中观察并成像分析。

各个稀释液PCR扩增产物电泳结果见图6-10，其中，M：DNA 相对分子量标准；泳道1-8依次为稀释液1至稀释液8，对应的DNA 浓度分别为50ng/μl、25ng/μl、10ng/μl、5ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、 0.1ng/μl、0.05ng/μl；泳道9为阴性对照。

图6为豌豆象引物灵敏度检测结果，可以看出，灵敏度为0.1ng/μl

图7为四纹豆象引物灵敏度检测结果，可以看出，灵敏度为 0.1ng/μl

图8为蚕豆象引物灵敏度检测结果，可以看出，灵敏度为0.5ng/μl

图9为菜豆象引物灵敏度检测结果，可以看出，灵敏度为0.5ng/μl

图10为绿豆象引物灵敏度检测结果，可以看出，灵敏度为 0.5ng/μl

结果可以看出，可检测到的模板浓度均可达到0.5ng/μl，有的甚 至可达到0.1ng/μl，且模板DNA浓度到达一定浓度后，目的条带亮 度不随其浓度的升高而增加。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明 做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实 施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施 例，这些实施例都属于本发明保护范围。