生产自然杀伤细胞的方法、由该方法生产的自然杀伤细胞以及包含该自然杀伤细胞的用于治疗癌症和感染性疾病的组合物

摘要

本发明涉及一种生产自然杀伤细胞(下文中，简称“NK细胞”)的方法、由该方法生产的NK细胞以及包含该NK细胞的用于治疗癌症和感染性疾病的组合物。本发明提供一种生产NK细胞的方法，该NK细胞保持高细胞活性和细胞毒性而对癌症和感染性疾病展现高疗效，并且能够以高效率和高浓度在活体外培养。此外，将一种保持细胞浓度处于恒定水平的培养方法用于生产NK细胞，从而可防止细胞的过度生长，这样可使细胞保持在最佳状态。特别地，即使当细胞被冷冻之后解冻时，细胞的功能也不会受损，并且NK细胞可保持高细胞活性和细胞毒性。因此，能够以液体状态或冷冻状态容易地存储和提供NK细胞，而无需额外的处理过程。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产自然杀伤细胞(在下文中简称为“NK细胞”)的方 法、由该方法生产的NK细胞以及包含该NK细胞的用于治疗癌症和感染性 疾病的组合物。

背景技术

针对癌症治疗，已开发并采用了包括手术、放疗和化疗的多种治疗方法。 然而，在特定的癌症和患者的情况下，难以应用这些治疗方法而且复发的可 能性很大。

因此，利用患者的免疫功能的免疫疗法日益受到关注，该免疫疗法基于 通过具有各种功能的免疫细胞之间的复杂的相互作用来去除肿瘤。直接去除 癌细胞的免疫细胞包括NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，将抗原呈递 至这些效应细胞的免疫细胞包括树突细胞(DC)或B细胞。其他实例包括分泌 各种细胞因子的辅助性T细胞(Th细胞)、调节性T细胞(Treg细胞)等。 在这些免疫细胞中，NK细胞被认为是最快速起效且高效的免疫细胞。

NK细胞是占血细胞的约10％的淋巴细胞且在免疫应答中起重要作用。 NK细胞具有多种功能，特别是具有杀死癌细胞或感染了外部病原菌的细胞 的能力，因此NK细胞的功能是去除癌细胞或去除将发展成癌症的细胞。

大多数NK细胞在机体中通常以灭活状态存在，但是为了将NK细胞用 于治疗目的，需要活化NK细胞。因此，已积极进行了各种研究来活化来自 患者的正常血液或灭活血液的NK细胞。

通过在活体外活化NK细胞获得的NK细胞的高细胞毒性表明了将NK 细胞用于免疫细胞疗法的可能性。据报道，在异基因骨髓移植之后施用在活 体外活化的NK细胞时，对多种癌症具有治疗作用，特别是诸如白血病的血 癌(Blood Cells Molecules&Disease,33:p261-266,2004)。然而，临床上尚未 证明NK细胞对除了血癌以外的实体癌的明显治疗效果。具体地，据报道， 在癌形成之前施用NK细胞可干扰癌植入(Cancer Immunol.Immunother., 56(11):p1733-1742,2007)，但是这种治疗模式似乎并不合适。此外，据报道， 在动物试验中腹腔注射NK细胞抑制乳腺细胞的生长，但尚不清楚该抑制效 果是否可归因于NK细胞(Breast Cancer Res.Treatment,104(3):p267-275, 2007)。

同时，尽管NK细胞可能作为癌症或感染性疾病的治疗剂，但是体内存 在的NK细胞数量并不多，因而需要一种生产大量的NK细胞同时保持足以 用于治疗目的疗效的技术。然而，NK细胞在体外不能被充分培养和扩增。 因此，能在有用的水平上培养和扩增NK细胞的技术已受到关注，但是研究 结果尚不能在临床上应用。

不仅利用用于T细胞增殖/活性的IL-2，而且利用IL-15(J.Immunol.,167(6): p3129-3138,2001；Blood,106(1):p158-166,2005,KR2009-0121694A)、刺激 CD3的OKT-3抗体(Experimental Hematol.,29(1):p104-113,2001)和 LPS(J.Immunol.,165(1):p139-147,2000)对NK细胞的培养已进行了各种研究。 然而，这些研究仅仅发现了对IL-2应用的修饰以及新型增殖物，并未提出用 于增殖的具有划时代意义的方法。众所周知，当使用IL-2或其他细胞因子 或化学物质来培养NK细胞时，NK细胞的数量比NK细胞的初始数量仅增 加了约3-10倍。

一些研究人员报道，使用癌细胞系作为饲养细胞来扩增NK细胞。据报 道，使用白血病细胞系CTV-1在增殖方面显示出改善很小或没有改善(J. Immunol.,178(1):p85-94,2007)，而使用EBV-LCL培养21天后，细胞数量增 加了平均约490倍(Cytotherapy,11(3):p341-355,2009)。此外，使用通过在 K562细胞中表达4-1BBL和膜结合的IL-15所获得的人工APC(抗原呈递细 胞)培养NK细胞3周后，NK细胞数量增加了平均227倍，并在体外和体 内呈现高细胞毒性，但是显示出由细胞死亡导致的有限的增殖(Cancer Res., 69(9):p4010-4017,2009)。最近有报道称，在用MICA、4-1BBL和IL-15转 染的K562细胞系中培养NK细胞3周后，NK细胞数量增加了平均350倍 (Tissue Antigens,76(6):p467-475,2010)，并且有报道称，当使用用膜结合的 IL-21转染的K562细胞系培养NK细胞2周同时每隔7天刺激NK细胞时， NK细胞数量增加了平均21,000倍。然而，由于使用了所有癌细胞系，因此 采用了不适合保证对临床应用非常重要的安全性的方法。此外，由于使用特 定的癌细胞作为饲养细胞，因此生产的NK细胞对特定的癌细胞具有启动特 异性。

通过从未分离NK细胞的外周血白细胞(PBL)富集NK细胞而获得的细胞 相比于纯NK细胞具有低细胞毒性，并且包含被自体MHC分子识别自身细 胞和非自身细胞的T细胞。因此，只要未除去T细胞，这些细胞就仅限于自 体移植。最近，开发了一种包括NK细胞分离步骤并利用饲养细胞进行适当 刺激来扩增所分离的NK细胞的方法，以及一种利用全PBL或外周血单核细 胞(PBMC)选择性扩增NK细胞的方法。此外，报道了一种培养NK细胞的方 法，所述方法包括在有外周血白细胞存在的情况下，使用包含抗-CD3抗体和 白细胞介素蛋白的培养基来培养NK细胞的过程(KR 10-2010-0011586 A)。

一般的应用于异基因的细胞扩增过程开始于两个连续的步骤：磁性去除 CD3+T细胞和富集CD56+NK细胞。为了刺激NK细胞增殖，通常使用被 照射的诸如PBMC[Cytotherapy 12:750-763,2010]、Epstein-Barr病毒转化的 淋巴母细胞样细胞系(EBV-LCL)[Cytotherapy 11:341-55,2009]这样的饲养细 胞。被照射的饲养细胞通过体液因子和直接的细胞间接触来刺激NK细胞 [Blood 80:2221-2229,1992]。

在本发明中，建立了一种大规模扩增和活化来自健康志愿者的用于临床 的NK细胞的简单而有效的方法。在单步磁性去除CD3+T细胞之后，在OKT3 和IL-2存在的情况下，用被照射的自体PBMC重复刺激并扩增去除的PBMC， 得到异基因所需的高纯度的CD3-CD16+CD56+NK细胞群。

同时，白蛋白是构成细胞的基本物质的蛋白质之一并且在自然界中存在 的简单蛋白质中具有最低的分子量。众所周知，白蛋白通常被用作生物制剂 的防腐剂，但是目前尚未报道利用白蛋白来提高NK细胞的稳定性。

如上所述，已描述了用于培养NK细胞的多种方法，但仍迫切需要一种 技术，该技术能够采用临床上友好的方法安全稳定地培养并扩增足够量的 NK细胞用于免疫细胞疗法，并使生产的NK细胞稳定地存储很长一段时间 并在需要时被提供。特别地，为了将活NK细胞用于治疗目的，需要克服NK 细胞维持活性的周期(即，有效期)仅仅为几天的缺点。因此，迫切需要一 种能够通过培养和生产NK细胞、冷冻存储所生产的NK细胞以及在需要时 解冻并提供所存储的细胞而显著提高免疫细胞的效用的技术。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种通过临床上友好的方式，高效并安全地 培养和增殖NK细胞以在短时间内生产大量的细胞毒性NK细胞的方法。

本发明的另一个目的在于提供一种包含具有改进的长期存储稳定性的 NK细胞的组合物以及包括该组合物的药物制剂。特别地，根据本发明的组 合物可作为冷冻产品提供，并且即使在解冻时也可保持NK细胞的高细胞活 性和细胞毒性。

根据本发明方法生产的NK细胞和包括该NK细胞的组合物能够有效地 用于治疗癌症和感染性疾病。

附图说明

图1示出了用饲养细胞重复刺激引起的NK细胞的增殖变化。(a)示出了 NK细胞随重复刺激的次数的增殖率变化。(a)，一次：在第0天应用一次刺 激；两次：在第0天和第7天应用两次刺激；三次：在第0天、第7天和第 14天应用三次刺激。(b)示出了NK细胞随应用重复刺激的时间点的增殖率变 化，其中D0：在第0天应用一次刺激；D0/D7：在第0天和第7天应用两次 刺激；D0/D10：在第0天和第10天应用两次刺激。

图2示出了通过用饲养细胞重复刺激所培养的NK细胞的细胞活性变化， 其中D0：在第0天应用一次刺激；D0/D7：在第0天和第7天应用两次刺激； D0/D10：在第0天和第10天应用两次刺激。

图3示出了通过用饲养细胞重复刺激所培养的NK细胞的细胞毒性变化， 其中D0：在第0天应用一次刺激；D0/D7：在第0天和第7天应用两次刺激； D0/D10：在第0天和第10天应用两次刺激。

图4示出了对通过用饲养细胞重复刺激所培养的NK细胞的表型分析结 果，其中(a1&a2)：NK细胞的识别和纯度；(b1&b2)：NK细胞的活化性受体； (c1&c2)：NK细胞的抑制性受体。

图5示出了在包含NK细胞的组合物中，细胞活性和细胞毒性随白蛋白浓 度的变化，其中(a)NK细胞的细胞活性变化；(b)NK细胞的细胞毒性变化。

图6示出了由白蛋白的加入引起的组合物中的NK细胞的细胞活性、细胞 毒性和表型的变化，其中(a)NK细胞的细胞活性变化；(b)NK细胞的细胞毒 性变化；(c)NK细胞的表型变化。

图7示出了由冷冻引起的NK细胞的变化，其中(a)冷冻/解冻之后的细胞活 性；(b)冷冻/解冻之后的复苏；(c)冷冻/解冻之后的细胞毒性；(d)冷冻/解 冻之后CD56+细胞的细胞表型的表达水平。

图8示出了NK细胞在淋巴瘤动物模型中的抗癌作用，其中(a)在试验模型 中对后肢麻痹的缓解作用；(b)提高试验模型的存活的作用。

图9示出了颅内施用时，NK细胞在脑癌(成胶质细胞瘤)动物模型中的 抗癌作用，其中(a)通过组织学检查观察肿瘤体积的结果；(b)根据细胞数量的 TUNEL分析结果；(c)肿瘤体积随NK细胞数量的变化。

图10示出了静脉施用时，NK细胞在脑癌动物模型中的抗癌作用，其中(a) 通过组织学检查观察肿瘤体积的结果；(b)肿瘤体积随NK细胞数量的变化。

图11示出了当与抗癌剂联合施用时，NK细胞在脑癌动物模型中的抗癌作 用。

图12示出了NK细胞在卵巢癌动物模型中的抗癌作用，其中(a)作为NK细 胞的施用周期的函数的肿瘤大小的变化(体内图像)；(b)观察由施用NK细 胞引起的肿瘤大小的变化结果。

图13示出了NK细胞在肝癌动物模型中的抗癌作用。

图14示出了NK细胞在神经母细胞瘤动物模型中的抗癌作用。

图15示出了NK细胞对各种癌细胞系和病毒感染的细胞系的体外疗效。

(a)对K562细胞系(白血病)的细胞毒性和分泌细胞因子的能力

(b)对Raji细胞系(淋巴瘤)的细胞毒性

(c)对SK-N-SH细胞系(神经母细胞瘤)的细胞毒性和分泌细胞因子的 能力

(d)对SNUOT-Rb1细胞系(成视网膜细胞瘤)的细胞毒性

(e)对U87-MG细胞系(成胶质细胞瘤)的细胞毒性

(f)对OVCAR-3细胞系(卵巢癌)的细胞毒性和分泌细胞因子的能力

(g)对Huh-7细胞系(HCC，肝细胞癌)的细胞毒性和分泌细胞因子的能 力

(h)对SNU398细胞系(HBV感染的HCC)的细胞毒性和分泌细胞因子的 能力

(i)对Huh-7.5细胞系(HCV感染的HCC)的细胞毒性和分泌细胞因子的 能力。

用于实施本发明的最佳实施方式

除非另有规定，本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明 所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本文中使用的术 语是在本领域中是众所周知并普遍使用的。

根据本发明的生产NK细胞的方法包括：

在含细胞因子的培养基中，用抗-CD3抗体和饲养细胞刺激除去T细胞 的单核细胞，进行静止培养几天以刺激细胞间接触，在保持细胞浓度和细胞 因子浓度处于恒定水平同时，在反应器中进行NK细胞的静止培养或悬浮培 养。

为了获得提高的NK细胞量，在接下来的静止培养或悬浮培养之前，可 重复刺激和静止培养。由本发明的方法生产的NK细胞保持高细胞活性和细 胞毒性而对癌症和感染性疾病展现高疗效，并且能够以高效率和高浓度在活 体外培养。

在本发明中，在初始刺激之后的静止培养进行约2-15天，优选为5-10 天，在重复刺激之后的静止培养进行约2-7天，优选为3-5天。

完成静止培养之后，在保持细胞因子的浓度处于恒定水平同时，优选在 培养箱中静止培养或悬浮培养细胞。

根据本发明的生产NK细胞的方法例如可包括以下步骤：

(i)从人外周血分离外周血白细胞和NK细胞；

(ii)将分离的NK细胞加入到含抗-CD3抗体和细胞因子的培养基中，通 过加入饲养细胞来刺激NK细胞并进行静止培养2-15天(优选为5-10天)， 以刺激细胞间接触；

(iii)完成步骤(ii)中的静止培养之后，通过加入细胞因子、抗-CD3抗体 和饲养细胞来重复刺激细胞并进行静止培养2-7天(优选为3-5天)，以刺 激细胞间接触；

(iv)完成静止培养之后，加入含静止培养或悬浮培养所需的细胞因子等 的培养基并在保持细胞浓度和细胞因子浓度处于恒定水平同时，进行静止培 养或悬浮培养。

在生产NK细胞的方法中，重复刺激细胞和进行静止培养的步骤(iii)可重 复一次或多次。本发明的方法可在步骤(ii)之前进一步包括制备饲养细胞的步 骤。

如在此使用的，术语“静止培养”是指在培养箱中以静止状态培养细胞， 而不搅拌或振荡，如在此使用的，术语“悬浮培养”是指通过通气或搅拌以悬 浮状态培养细胞，而不使细胞贴附至反应器的底部或侧面。

可用于本发明中的静止培养的反应器的实例包括但不限于烧瓶、方瓶 (T-flask)、一次性细胞培养袋等。可用于本发明中的悬浮培养的反应器的实 例包括但不限于摇瓶、振荡培养箱、发酵罐、方瓶、一次性细胞培养袋等。 此外，可使用适于实现本发明目的的任何生物反应器，并且可由本发明所属 技术领域的普通技术人员很容易地选择。

此外，用于静止培养和悬浮培养的反应器可以是相同的或不同的。例如， 当用于静止培养的反应器和用于悬浮培养的反应器相同时，完成静止培养之 后，可向相同的反应器中额外加入含必需营养成分的培养基，接着进行悬浮 培养。当使用不同的反应器时，完成静止培养之后，可将培养的细胞转移到 用于悬浮培养的反应器中。

用于悬浮培养的反应器的实例包括但不限于摇袋生物反应器 (GEHealthcare)、一次性生物反应器(SUB；Thermo Fisher)、一次性XDR生物 反应器(Xcellerex)、细胞培养袋(Nipro)、PBS系列细胞培养箱(PBS Biotech) (参见WO 07/111677A、WO 08/133845A和WO 09/132192A)、细胞培养 袋(Fujimori)、一次性摇瓶(Erlenmeyer)等。特别地，优选PBS系列细胞培养 箱(PBS Biotech)。

如在此使用的，术语“饲养细胞”是指不具有分裂增殖能力但具有代谢活 性，从而生产各种协助靶NK细胞增殖的代谢产物的细胞。可用在本发明中 的饲养细胞的实例包括但不限于导入了基因的动物细胞系、用各种细胞因子 或化合物处理的外周血白细胞(PBL)、自体或异基因外周血白细胞(PBL)、T 细胞、B细胞、单核细胞等。优选地，可使用自体外周血单核细胞。此外， 只要符合本发明的目的，可使用本领域已知的其他饲养细胞。

为确保安全，用作饲养细胞的自体外周血单核细胞可以以灭活状态使 用，。可使用本领域已知的传统方法来灭活。例如，可使用γ射线照射。灭 活的饲养细胞包括分离的T细胞。本发明所述的使用饲养细胞的方法是在分 离之后扩增NK细胞的方法，该方法的优点在于只有纯NK细胞不断增殖。

本发明中的“抗-CD3抗体”是一种与CD3抗原特异性结合的抗体，CD3 抗原是特异性结合到T细胞受体(TCR)以形成抗体识别复合物的分子，其中 CD3分子结合到TCR以将抗原识别信号传递到细胞内。只要具有结合到CD3 的特性，任何抗体可不受限制地用作本发明中的抗-CD3抗体。抗-CD3抗体 优选地选自由OKT3、UCHT1和HIT3a构成的组，但不限于此。

在本发明中，可包括在培养基中的细胞因子优选为选自白细胞介素中的 一种或多种。如在此使用的，术语“白细胞介素”是由诸如淋巴细胞、单核细 胞或巨噬细胞的免疫细胞产生的生物活性蛋白质的统称。本发明中可使用的 白细胞介素是选自由白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介 素-15(IL-15)、白细胞介素-18(IL-8)和白细胞介素-21(IL-21)构成的组中的一种 或多种。特别地，优选使用IL-2，但不限于此。此外，只要符合本发明的目 的，也可不受限制地使用本领域的普通技术人员所熟知的其他细胞因子。

在本发明中，抗-CD3抗体用于静止培养和悬浮培养，抗-CD3抗体在培 养基中的浓度为0.1-1,000ng/ml，优选为1-100ng/ml，更优选为5-20ng/ml， 并且细胞因子在培养基中的浓度为10-2,000IU，优选为100-1,000IU，更优 选为约200-700IU。

如在此使用的，术语“刺激”是指通过加入饲养细胞或类似物来诱导NK 细胞的增殖，也可将抗-CD3抗体连同饲养细胞一起用于刺激。

如在此使用的，术语“重复刺激”是指培养一定时间之后，通过加入饲养 细胞和/或抗-CD3抗体再次重新诱导NK细胞的增殖。

在本发明中，用于生产NK细胞的培养基可以是用于动物细胞培养的常 规培养基，如CellGro培养基(Cellgenix)、AIM-V培养基、RIMI-1640培养基 或X-VIVO20培养基。必要时，该用于动物细胞培养的培养基可包含选自分 离自人外周血的NK细胞、外周血单核细胞、抗-CD3抗体和白细胞介素中的 一种或多种成分。

特别地，在根据本发明生产NK细胞的方法中，为了保持细胞浓度和细 胞因子浓度处于恒定水平，可每隔一定时间测量培养基中细胞和细胞因子的 浓度，并基于测量结果，可根据细胞浓度和细胞因子浓度提供含细胞因子的 培养基。

此外，用于培养的培养基可包含血清、血浆或支持淋巴细胞增殖的额外 的增殖因子。加入到培养基中的血清或血浆没有特别限制，可以是源自动物 的商品。更优选地，使用人自体血清或血浆。例如，如本领域技术人员已知 的，可使用诱导来自外周血单核细胞的淋巴细胞增殖的细胞因子的组合，或 者使用刺激淋巴细胞增殖的凝集素。

可使用合适的赋形剂和添加剂将根据本发明方法生产的NK细胞提供为 治疗组合物。该组合物可施用给需要治疗的患者，由此达到治疗效果。

特别地，当向包含通过本发明方法生产的NK细胞的组合物中加入白蛋 白时，可大大提高NK细胞的长期存储稳定性、细胞毒性和细胞活性。加入 到本发明组合物中的白蛋白的量没有特别限制，但是基于本发明的组合物的 总重量，加入白蛋白的量可以是0.1-5wt％，优选为0.5-2wt％。

此外，当采用保持细胞浓度处于恒定水平的生产NK细胞的培养方法时， 可防止细胞的过度生长，这样可使细胞保持在最佳状态。特别地，即使当细 胞冷冻之后解冻，细胞的功能也不会受损，并且NK细胞可保持高细胞活性 和细胞毒性。因此，能够以液体状态或冷冻状态容易地存储和提供NK细胞， 而无需额外的处理过程。

由本发明方法生产的NK细胞和包含该NK细胞的组合物可用于治疗癌 症和感染性疾病。由本发明方法生产的NK细胞可应用于包括实体癌和血癌 的各类癌症。如在此使用的，术语“实体癌”不同于血癌，是指形成于器官中 的肿块型癌。在大多数器官中形成的癌对应于实体癌。可使用本发明的NK 细胞治疗的癌症是非限制性的，其优选的实例包括但不限于胃癌、肝癌、肺 癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、喉 癌、急性髓细胞性白血病、脑癌、神经母细胞瘤、成视网膜细胞瘤、头颈癌、 唾液腺癌、淋巴瘤等。如在此使用的，术语“感染性疾病”是指包括由病毒或 病原菌感染引起的并且可通过呼吸器官、血液接触或皮肤接触感染的所有疾 病。这些感染性疾病的非限制性的实例包括但不限于乙型肝炎、丙型肝炎、 人乳头状瘤病毒(HPV)感染、巨细胞病毒感染、病毒性呼吸道疾病、流感等。

实施例

以下，将参照实施例更详细地描述本发明。对于本领域的普通技术人员 将显而易见的是，这些实施例仅是解释性的目的，而不被理解为限制本发明 的范围。

实施例1：用饲养细胞重复地刺激(重复刺激)的NK细胞培养和特性评价

(1)用饲养细胞重复地刺激的NK细胞培养

将从健康供体收集的外周血单核细胞(PBMC)分散到小瓶中并在液氮中 冷冻。将一个冷冻的PBMC小瓶解冻并转移到50mL试管中，细胞悬浮于20 mL含1vol％FBS(胎牛血清)或自体血浆的PBS中，并在4℃以1200rpm离心 10分钟。

将PBMC沉淀悬浮于10mL的MACS电泳缓冲液中，通过台盼蓝染色进行 细胞计数。为了制备PBMC饲养细胞并除去CD3，将5×10⁷个细胞转移到各50 mL新试管中并在4℃以1200rpm离心10分钟。

将沉淀悬浮于10mL含1vol％自体血浆的CellGro培养基(Cellgenix)中来 制备PBMC饲养细胞，接着用γ射线照射仪以2000cGy照射。

为了得到除去CD3的细胞，将400μl电泳缓冲液和100μl CD3磁珠 (Miltenyi Biotech)加入到5×10⁷个细胞沉淀中，并在4℃反应20分钟。用20mL 的MACS电泳缓冲液洗涤反应材料，然后在4℃以1200rpm离心10分钟，并悬 浮于2mL的MACS电泳缓冲液中。利用配备有VarioMACS(Miltenyi Biotech) 的CS色谱柱(Miltenyi Biotech,130-041-305)将细胞与悬浮液分离，洗涤色谱柱 至终体积达20mL，由此回收细胞。

通过台盼蓝染色进行细胞计数，将1×10⁷个细胞分散到50mL新试管中， 并在4℃以1200rpm离心10分钟。将细胞沉淀悬浮于10mL含1vol％自体血浆 的CellGro培养基(Cellgenix)中。

对于袋培养，向含PBMC饲养细胞的试管中加入500IU的IL-2和10ng/mL 的OKT-3。向Nipro 350袋(Nipro)中加入含10mL的PBMC饲养细胞、10mL的 NK细胞和10mL的1vol％自体血浆的CellGro培养基(Cellgenix)，在37℃的培 养箱中进行静止培养5天。在这里，Nipro 350袋从边缘折叠6cm并从底部折 叠5cm，以达到约70cm²的面积并用于静止培养。对于摇瓶培养，使用与袋 培养相同的组成，在上述相同的条件下，用含0.5mL的PBMC饲养细胞、0.5 mL的NK细胞和0.5mL的1vol％自体血浆的CellGro培养基在12孔的孔板上进 行培养。在这里，12孔板具有3.5-3.8cm²的面积。

在培养5天时，进行细胞计数，用含500IU的IL-2(Proleukin)和1vol％自体 血浆的CellGro培养基(Cellgenix)将细胞稀释至约2×10⁵个细胞/mL，并在合适 的培养箱中进行静止培养。在这里，细胞浓度和面积调整为2×10⁵个细胞/mL 和3.5cm²。

自开始培养第7天、10天和14天时，进行细胞计数并用含1vol％自体血浆 的CellGro培养基将细胞稀释至2-5×10⁵个细胞/mL。制备1-10倍的饲养细胞并 悬浮于含1vol％自体血浆的CellGro培养基(Cellgenix)中，接着用γ射线照射器 以2000cGy照射。向其中加入500IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3，共培养这两 类细胞。

用饲养细胞重复刺激这些细胞，接着静止培养。然后，每隔2-3天进行细 胞计数并进行悬浮培养直到21天，同时用含500IU的IL-2和1vol％自体血浆的 CellGro培养基(Cellgenix)将细胞稀释至5-10×10⁵个细胞/mL。在悬浮培养21 天时，收集NK细胞。

将收集的NK细胞悬浮于含1wt％白蛋白(Green Cross Corp.)的哈特曼氏 液(Hatmann's solution，Choongwae Pharmaceutical Corp.，韩国)中达1-5×10⁷个细胞/mL，并在4℃存储。

用饲养细胞重复刺激的结果在图1(a)中示出。从中可以看出，当施用两 次或三次刺激时，NK细胞的增殖相比于施用一次刺激时大大增加。现有的生 产方法显示NK细胞增殖约161倍，而在用饲养细胞刺激两次时，NK细胞增殖 增加425倍，在用饲养细胞刺激三次时，NK细胞增殖增加1,320倍。如图1(b) 所示，当用饲养细胞额外进行刺激7天或10天时，NK细胞增殖比未额外刺激 培养情况下的NK细胞的增殖高。因此发现，与在初始阶段施用一次刺激且基 于培养基的量而非细胞数量来增殖NK细胞的方法相比，用饲养细胞额外进行 刺激并调整培养基的量同时保持细胞数量处于恒定水平的新培养方法对于 NK细胞增殖非常有效。

(2)NK细胞的体外细胞活性

为了比较评价体外细胞活性，采用细胞计数(NucleoCounter)系统 (Chemometec)，该系统利用能够结合到细胞内核的PI染色液的细胞计数方法。

将未经重复刺激的细胞和重复刺激培养了7天和10天的细胞用PBS稀释， 然后利用细胞计数系统测量总细胞计数和死细胞计数。将100μl稀释10倍的 细胞与100μl裂解缓冲液A-100(Chemometec)混合，向其中加入100μl稳定缓 冲液B(Chemometec)，然后利用NucleoCasette的活塞测量总细胞计数。利用 NucleoCasette的活塞测量未经10倍稀释处理的细胞的死细胞计数。

通过将测得的总细胞计数减去测得的死细胞计数来确定活细胞的数量， 然后利用下式计算细胞活性。

细胞活性(％)＝(活细胞计数/总细胞计数)×100

结果如图2所示，与未经重复刺激培养的细胞相比，由饲养细胞重复刺激 培养21天的NK细胞表现出高增殖率，同时这些NK细胞表现出约90％的高细 胞活性。

(3)体外细胞毒性

回收靶癌细胞系(K562等)，将3×10⁶个细胞置于15mL试管中并离心。 将细胞沉淀悬浮于600μl的RPMI培养基中，并将400μl悬浮液转移到15mL新 试管中，向其中加入浓度为50nM的Calcein-AM(分子探针，C34852)。然后用 银箔阻挡光的同时将细胞悬浮液于37℃在培养箱中染色20分钟。同时，将200 μl剩余的细胞悬浮液以1×10⁶个细胞/mL的浓度加入到800μl的RPMI培养基 中。用15mL RPMI培养基洗涤经Calcein-AM染色的癌细胞系并离心，并将沉 淀以1×10⁶个细胞/mL的浓度悬浮于2mL的RPMI培养基中。

将3×10⁶个NK细胞置于15mL试管中并离心，并将沉淀以相对于靶癌细 胞系的所需比例悬浮于RPMI培养基中。将100μl所制备的靶癌细胞系和NK 细胞系的混合物分散到圆底96孔板的各孔中。各孔是重复制备的。将该孔板 在37℃避光状态下培养2小时，然后以2000rpm离心3分钟。除去上清液，向 孔板的每孔中加入100μl的FACS缓冲液(在PBS中2.5wt％FBS)以使细胞悬 浮，之后将孔板转移到含5μl的7-AAD(BD,559925)的FACS中。在室温条件 下培养20分钟之后，对NK细胞的癌细胞毒性分析如下：

细胞毒性＝A值－B值

“A值”是指当NK细胞与靶癌细胞培养时，杀伤的靶癌细胞的比例(用钙 黄绿素-AM和7-AAD染色的死亡靶癌细胞的平均值－仅用钙黄绿素-AM染色 的对照)

“B值”是指基本上死亡的靶癌细胞的比例(用钙黄绿素-AM和7-AAD染色 的死亡靶癌细胞－仅用钙黄绿素-AM染色的对照)

结果如图3所示，与未经重复刺激培养的细胞相比，用饲养细胞重复刺激 培养21天的NK细胞表现出高增殖率，同时这些NK细胞在E:T比例＝3:1时表现 出约90％的高细胞毒性。

(4)体外细胞表型分析

收集在实施例1(1)中培养前后的NK细胞，以1200rpm离心5分钟，通过抽 吸除去培养基。用1mL的FACS缓冲液(含2.5％FBS的PBS)稀释细胞，进 行计数并用FACS缓冲液稀释为5×10⁶个细胞/mL的浓度。向各5mL FACS试管 (Falcon,352052)中加入100μl稀释的细胞液，向其中加入下表1中所示的抗体。

表1

【表1】加入到各试管中的抗体

如下表2所示制备对照试管。

表2

【表2】对照试管

表1和表2所示的试管在制冷温度静置以使悬浮细胞。将染色的细胞加入 到2mL的FACS缓冲液中并以1500rpm离心5分钟。除去上清液，将沉淀加入 到2mL的FACS缓冲液中并以1500rpm离心5分钟。接着，除去上清液，将沉 淀悬浮于300μl的FACS缓冲液中，之后利用FACSCalibur(Becton Dickinson) 分析细胞表型。

结果如图4所示，对应于识别和纯度的表型以及与NK细胞的活性和抑制 相关的表型在用饲养细胞进行额外刺激的情况下和没有进行额外刺激的情况 下无显著差异。

因此，虽然由包括用饲养细胞重复刺激的改进的培养方法生产的NK细胞 相比于通过现有方法培养的NK细胞表现出高增殖率，但其细胞活性、细胞毒 性和细胞表型与通过现有方法培养的NK细胞没有显著差异。

实施例2：由加入白蛋白生产的体外稳定性(应用稳定性)

为了评估作为哈特曼氏液中白蛋白的浓度(2wt％、1wt％和0.5wt％)的函 数所培养的细胞的稳定性，将实施例1(1)中培养的细胞在4℃存储72小时，同 时每隔24小时评估其体外细胞毒性和体外细胞活性。

将最终培养的NK细胞离心，除去上清液。用哈特曼氏液或含浓度为2 wt％、1wt％和0.5wt％的人血清白蛋白的哈特曼氏液稀释细胞沉淀，由此制 备细胞稀释液。在这里，通过控制哈特曼氏液的量或含人血清白蛋白哈特曼 氏液的量将终细胞稀释液的浓度调整为1.1×10⁷个细胞/mL，然后将细胞分散 液置于细胞培养袋中并在4℃存储。24小时、48小时和72小时之后，取出细胞， 评估其体外细胞毒性(参见实施例1(3))和体外细胞活性(参见实施例1(2))。

结果如图5(a)所示，当细胞在哈特曼氏液中低温存储达48小时，细胞活 性下降至65％。然而，当加入浓度为1wt％的人白蛋白时，即使低温存储细胞 达48小时或考虑到应用的时间在室温存储2小时，细胞仍保持约90％的细胞活 性。

图5(b)示出了作为存储时间的函数的细胞毒性。从中可以看出，当细胞 存储于哈特曼氏液中时，细胞毒性从24小时开始快速下降并在48小时以E:T 比例＝3:1降至小于10％。然而，当加入1wt％的人白蛋白时，即使低温存储细 胞48小时之后，NK细胞仍表现出70％或更高的细胞毒性。

图6示出了哈特曼氏液和1wt％人白蛋白-哈特曼氏液之间的累积数据的 比较。如图6(a)所示，当加入1wt％的白蛋白时，保持80％或更高的高细胞活 性达72小时。然而，在哈特曼氏液中，细胞活性在48小时快速下降至60％。 图6(b)示出了E:T比例＝3:1的细胞毒性的比较。从中可以看出，当加入1wt％ 的白蛋白时，保持80％或更高的细胞毒性达72小时，然而在哈特曼氏液中， 细胞毒性在48小时下降至50％。图6(c)示出了上述两种条件下NK细胞表型的 观察结果。从中可以看出，与细胞毒性有直接关联的NKp46在加入1wt％白 蛋白的条件下高度表达，其他表型在两种条件下无显著差异。

因此可以看出，随着时间的推移，向终NK细胞治疗剂中加入1wt％人白 蛋白对通过保持NK细胞的细胞活性和细胞毒性来确保NK细胞的稳定性有很 大作用。

实施例3：NK细胞冷冻/解冻试验：细胞数量、产量、表型、细胞活性和细胞 毒性

检测实施例1(1)中培养的NK细胞的冷冻稳定性。

为了冷冻所培养的NK细胞，将细胞数量调整为2-8×10⁷个细胞/mL，将待 冷冻的细胞转移到单独的试管中，然后在4℃以1200rpm离心10分钟。以20mL 的基准在冷冻袋(MEDIRUTION，韩国)中冷冻。将离心后的细胞充分悬浮于 14mL人血清AB中。将4mL Dextran 40和2mL DMSO彼此混合并冷却，并伴 随搅拌将混合溶液滴入制备的细胞悬浮液中。将细胞注入冷却袋，并从袋中 除去气泡。用温度速率可控的降温仪(CryoMed freezer,Thermo Scientific)冷冻 所述冷却袋并存储于液氮罐中。

为了解冻，从液氮罐取出冷冻袋，置于拉链袋中并于培养箱中在37℃迅 速解冻。细胞完全解冻之后，将细胞转移到相应的试管中，并用10倍量的含1 wt％FBS的PBS溶液使细胞缓慢悬浮。将细胞悬浮液充分混合并离心(1,200 rpm，10分钟，4℃)。离心之后，用含1wt％FBS的PBS使细胞悬浮为浓度10⁷个细胞/mL。稀释10倍之后，测量细胞数量和活性。基于测得的细胞数量， 以E:T比例＝3:1评估对于K562细胞系的细胞毒性。测量对CD16、NKG2A、 NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD25、CD62L、CD57等的细 胞表型。最后，评估冷冻前后的细胞产量、细胞活性、细胞毒性和细胞表型 的变化。

结果，当培养的NK细胞在冷冻之后解冻时，它们保持高的细胞活性(参 见图7(a))和复苏(参见图7(b))，无需特殊活性诱导就对K562癌细胞系具有 高细胞毒性(参见图7(c))，而且也维持细胞表型(参见图7(d))。

实施例4：自然杀伤细胞在淋巴瘤动物模型中的抗癌作用评估

(1)淋巴瘤动物模型的构建

1)Raji细胞系和SU-DHL-4细胞系的培养

在37℃、5％CO₂培养箱中，利用RIMI培养基(2mM L-谷氨酰胺、1mM 丙酮酸钠、10wt％FBS、0.055mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100μg/ml 链霉素)培养Raji细胞系(人B细胞淋巴瘤细胞系，ATCC，CCL-86)和 SU-DHL-4细胞系(人B细胞淋巴瘤细胞系，DSMZ，ACC 495)。

2)动物模型的构建

将6-8周龄的雌性C.B-17小鼠驯化7天，然后通过1mL注射器将Raji细胞 系和SU-DHL-4细胞系各以1×10⁵个细胞/100μL的浓度注入小鼠的尾部静脉。

(2)自然杀伤细胞的施用和抗癌作用评估

1)自然杀伤细胞的施用

异种移植肿瘤之后，将小鼠随机分组并标记。将400μL的PBS注入对照 组的尾部静脉。在试验组中，从第0天每隔2-3天将自然杀伤细胞以1×10⁷个细 胞/400μL的浓度施用到小鼠的尾部静脉5次。

2)抗癌作用评估

实验后，每天检测小鼠的全身情况、灵活性和后肢体麻痹。当Raji和 SU-DHL-4被静脉施用至小鼠(众所周知的淋巴瘤模型)时，在脊髓周围产生 肿瘤，这样小鼠表现出后肢体麻痹症状并2-3天之后导致死亡。因此，后肢体 麻痹的发展与存活率一起被评估并作为抗癌作用的指标。

结果，在施用PBS的对照组中，后肢体麻痹的中值(参见图8(a))和存活 率的中值(参见图8(b))为37天和39天，然而在施用NK细胞的组中，后肢体 麻痹明显得到缓解，以至于测不到中值，并且存活率大大提高。

实施例5：自然杀伤细胞在脑肿瘤(成胶质细胞瘤)动物模型中的抗癌作用 评估

(1)脑癌动物模型的构建

利用具有七个芯(flame)的多筒注射器将U-87 MG(人成胶质细胞瘤细胞 系，ATCC HTB-14)以2×10⁵个细胞/5μL的浓度注入6周龄的BALB/C-nu/nu 小鼠的大脑。利用Hamilton注射器注射细胞，静置5分钟之后，移除注射器的 针头5分钟。然后，进行消毒并缝合。在试验期间观察小鼠的状况和体重。根 据试验进度处死小鼠并分析组织。

(2)自然杀伤细胞的施用

为了检测NK细胞在脑癌动物模型中的抗癌作用，自施用U-87MG之后1 周，每隔一周注射NK细胞三次。将NK细胞经颅内注射和静脉注射。在颅内 注射的情况下，施用1×10³个、1×10⁴个和1×10⁵个NK细胞，而在静脉注射的 情况下，施用1×10⁵个、1×10⁶个和1×10⁷个NK细胞。在施用U-87MG之后4周， 处死小鼠并评估NK细胞的抗癌作用。

为了检测由联合施用NK细胞和抗癌剂以及施用的时间点产生的抗癌作 用，在下表3所示的各时间点，静脉注射1×10⁷个NK细胞。自施用U-87MG之 后3周，将替莫唑胺(TMZ)作为抗癌剂以2.5mg/kg的剂量经腹腔注射连续5天、 每天一次。在施用U-87MG之后4周，处死小鼠并测量肿瘤体积。

表3

【表3】各组中NK细胞和抗癌剂的组合以及施用方法

(3)抗癌作用评估

为了测量肿瘤的体积，利用苏木精-伊红染色。从小鼠提取大脑并每2mm 切片。将切片在4℃于10％福尔马林缓冲溶液中固定24小时，并包埋到石蜡块 中。将石蜡包埋的组织切成4μm，固定到包被的载玻片上并干燥过夜。将该 组织用二甲苯脱蜡并通过分级醇系列(100vol％、95vol％和80vol％乙醇/蒸 馏水)再水化。然后，对该组织进行Gill's苏木精-伊红染色，检测染色的程度， 接着脱水并固定。测量染色的组织中肿瘤的长度和宽度，利用下式计算肿瘤 体积：

肿瘤体积(mm³)＝肿瘤长度(mm)×肿瘤宽度(mm)²×0.5

可以看出，与对照相比，腹腔内施用1×10⁴个NK细胞和1×10⁵个NK细胞 (参见图9)以及颅内施用1×10⁶个NK细胞和1×10⁷个NK细胞(参见图10)时， 肿瘤体积减小。当观察联合施用NK细胞和抗癌剂以及施用的时间点产生的作 用时(参见图11)，可以看出当联合施用TMZ和NK细胞时，肿瘤体积比单 独施用它们时小。此外，当施用肿瘤之后1周内注射三次NK细胞时，肿瘤体 积减小最显著，这表明显示了最佳效果。

为了分析细胞死亡的程度，进行TUNEL(末端脱氧核苷酸介导的脱氧尿 苷三磷酸缺口末端标记)检测。具体地，将石蜡包埋的组织(4mm)固定到包 被的载玻片上并干燥过夜。将该组织用二甲苯脱蜡并通过分级醇系列(100 vol％、95vol％和80vol％乙醇/蒸馏水)再水化，接着用PBS(pH 7.5)洗涤。使 用TUNEL试剂盒(Invitrogen)检测组织中细胞死亡的程度。将染色的载玻片用 Gill's苏木精复染1分钟并固定。用显微镜以相对于肿瘤边缘放大400倍拍下染 色的载玻片，得到10张照片，对显示阳性反应的细胞进行细胞计数，对测量 结果求平均值。

结果可以看出，当颅内施用1×10⁴个NK细胞和1×10⁵个NK细胞时，死亡 细胞的数量很大，这表明施用NK细胞是有效的(参见图9c)。

实施例6：NK细胞在卵巢癌动物模型中的抗癌作用评估

(1)卵巢癌动物模型的构建

1)OVCAR-3-Luc细胞系的构建

将荧光素酶基因克隆至pGL3载体并瞬时转染入OVCAR-3细胞系。利用 荧光素初步筛选显示出表达荧光素酶的细胞系，二次筛选与OVCAR-3具有相 似表型和NK细胞毒性的细胞系。

2)OVCAR-3-Luc细胞系的培养

在37℃、5％CO₂培养箱中，利用RIMI培养基(2mM L-谷氨酰胺、1mM 丙酮酸钠、10％FBS、0.055mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100μg/ml链 霉素、100μg/mL G418)培养OVCAR-3-Luc细胞系(人卵巢癌细胞系，KTCC (韩国细胞系库)30162)。

3)动物模型的构建

将6-8周龄的雌性C.B-17 SCID小鼠驯化7天，然后将OVCAR-3-Luc细胞系 以5×10⁶个细胞/100μL的浓度经腹腔注入小鼠。

(2)NK细胞的施用和抗癌作用评估

1)NK细胞的施用

异种移植肿瘤之后，将小鼠随机分组并标记。将200μL的哈特曼氏液 (Choongwae Pharmaceutical Corp.，韩国)经腹腔注入对照组。自异种移植 肿瘤之后1周，每隔2-3天以1×10⁷个NK细胞/200μL经腹腔向NK细胞治疗组注 射五次。

2)抗癌作用评估

异种移植OVCAR-3-Luc之后，每天观察小鼠的全身状况和灵活性。将荧 光素经腹腔施用至小鼠，每隔7天使用IVIS成像系统(Xenogen)拍摄荧光素酶 图像。异种移植肿瘤之后8周，将所有组的小鼠开腹，测量肿瘤的体积。

异种移植癌细胞之后，癌细胞立即扩散到整个腹腔，荧光素酶图像看起 来很大。然而，7天之后，癌细胞被移植，因而荧光素酶水平下降。7天之后， 在施用NK细胞的组中，荧光素酶水平持续下降直到23天，然而在阴性对照组 荧光素酶水平提高(参见图12(a))。

在8周时，处死小鼠，提取肿瘤，并测量肿瘤的体积和重量(参见图12(b))。 观察到在施用NK细胞的组中，肿瘤的重量相比于阴性对照组减小了54.91％。 换句话说，与阴性对照组相比，在施用NK细胞的组中肿瘤体积显著减小。这 表明将NK细胞经腹腔施用到卵巢癌转移到腹腔的模型时，它们抑制肿瘤的生 长。

实施例7：NK细胞在人肝癌动物模型中的抗癌作用评估

(1)肝癌动物模型的构建

为了评估NK细胞对肝癌的抗癌作用，构建人肿瘤异种移植小鼠并静脉施 用NK细胞。为此，将6×10⁶个SNU-354细胞(人肝癌细胞系)皮下植入到裸 鼠的一侧。

(2)NK细胞的施用和抗癌作用评估

1)NK细胞的施用

异种移植SNU-354细胞之后两小时，将200μL的1×10⁶个NK细胞或1×10⁷个NK细胞施用至小鼠的尾部静脉。第一次施用之后，再每隔一周注射相同剂 量的NK细胞3次。

表4

【表4】按照组施用NK细胞的方法

2)抗癌作用评估

为了评估在实验过程中的NK细胞的毒性，每天观察动物的全身状况并在 实验结束前测量动物的重量和肿瘤体积11次(第0天、第7天、第9天、第12 天、第14天、第16天、第19天、第21天、第23天、第26天和第28天)。28天 之后，处死动物并测量提取的肿瘤重量。

据观察，与阴性对照组相比，施用NK细胞的组的肿瘤体积减小37.7％ (1×10⁶个细胞/小鼠)和50.6％(1×10⁷个细胞/小鼠)(图13)。

此外，与阴性对照组相比，施用NK细胞的组的肿瘤重量减小36.0％(1×10⁶个细胞/小鼠)和50.2％(1×10⁷个细胞/小鼠)(图13)。

因此，可以得出结论：NK细胞可用于治疗肝癌。

实施例8：NK细胞在神经母细胞瘤动物模型中的抗癌作用评估

(1)神经母细胞瘤动物模型的构建

1)NB-1691luc细胞系的培养

在37℃、5％CO₂培养箱中，利用RIMI培养基(2mM L-谷氨酰胺、1mM 丙酮酸钠、10％FBS、0.055mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素,100μg/ml链 霉素、100μg/mL G418)通过将荧光素酶基因转染入NB-1691(人神经母细 胞瘤细胞系，来自St.Jude儿童研究医院)来制备NB-1691luc细胞系。

3)动物模型的构建

将7周龄的雌性C.B-17 SCID小鼠驯化7天，将NB-1691luc细胞系以5×10⁵个细胞/100μL的浓度注入小鼠的尾部静脉。

(2)NK细胞的施用和抗癌作用评估

1)NK细胞的施用

异种移植肿瘤之后，将小鼠随机分组并标记。将200μL的哈特曼氏液 (Choongwae Pharmaceutical Corp.，韩国)注入对照组的尾部静脉。自异种 移植肿瘤之后1周，每隔2-3天以1×10⁷个NK细胞/200μL的浓度向NK细胞处理 组的尾部静脉注射五次。

2)抗癌作用评估

异种移植NB-1691luc之后，每天观察小鼠的全身状况和灵活性。为了追 踪肿瘤生长，将荧光素经腹腔施用至小鼠，每隔7天使用IVIS成像系统 (Xenogen)拍摄荧光素酶图像。

在实验过程中，每周调查五次来检查动物的死亡。结果，对照组和施用 NK细胞的组的存活天数分别为49天和51天。然而，通过对数秩(log-rank)检验， 施用NK细胞的组的存活显著增加(图14)。

实施例9：NK细胞对各种癌细胞系和病毒感染细胞系的体外疗效的评估

通过利用按实施例1所述制备的NK细胞，按实施例1(3)所述来评估NK细 胞的细胞毒性。

对NK细胞分泌细胞因子的能力测量如下：

制备NK细胞(5×10⁶个细胞/mL)和靶癌细胞系(5×10⁶个细胞/mL)， 将制备的NK细胞和靶癌细胞系加入到圆底96孔板中。为了避免分泌的细胞因 子在细胞中累积，同时加入GolgiStop(BD Pharmingen,554724)。

孔1：悬浮的NK细胞100μL、RPMI培养基100μL、抗人CD107a-APC(BD  Pharmingen,560664)1μL

孔2：悬浮的NK细胞100μL、悬浮的靶癌细胞系100μL、抗人CD107a-APC (BD Pharmingen,560664)1μL

孔3：悬浮的NK细胞100μL、悬浮的靶癌细胞系100μL、APC小鼠IgG1 k 同型对照(BD Pharmingen,555751)5μL

将96孔板用箔包裹，然后在37℃培养箱中存储4小时。4小时之后，除去 96孔板的上清液，向每孔中加入100μL FACS缓冲液、5μL 7-AAD(BD, 559925)、1μL抗-人CD3-PerCP-Cy5.5(eBioscience,45-0036-42)以及1μL抗- 人CD56-APC-eFluor780(eBioscience,47-0567-42)。

通过在4℃存储30分钟将96孔板染色，然后加入200μL FACS缓冲液并离 心(2000rpm)3分钟(2次)。

除去96孔板的上清液，向每孔中加入200μL Cytofix/Cytoperm(BD, 51-2090KZ)。用移液管将每孔中的混合物充分混合，然后在4℃存储(30分钟 以固定)。

固定之后，向每孔中加入200μL用蒸馏水稀释10倍的Perm/Wash缓冲液 (BD,51-2090KZ)，将96孔板离心(2000 rpm)3分钟(2次)。

除去上清液之后，加入下面一组抗体。

孔1&2：稀释的Perm/Wash 100μL、抗-人IFN-g-FITC(BD,554700)1μL、 抗人TNF-a-PE-Cy7(eBioscience,25-7349-82)1μL

孔3：稀释的Perm/Wash 100μL、FITC小鼠IgG1 k同型对照(BD,555748)5 μL、PE-Cy7小鼠IgG1 k同型对照(BD,557872)5μL

通过将96孔板在4℃存储30分钟来染色细胞因子。染色之后，向每孔中加 入200μL用蒸馏水稀释10倍的Perm/Wash缓冲液(BD,51-2090KZ)，将96孔板 离心(2000rpm)3分钟(2次)。

最后，通过加入200μL稀释的Perm/Wash缓冲液(BD,51-2090KZ)使每孔 重新悬浮，通过FACS-Fortessa(BD)评估分泌细胞因子的能力。

图15示出了NK细胞对如下各种癌细胞系和病毒感染细胞系的体外疗效 (细胞毒性和分泌细胞因子的能力)：

(a)K562细胞系(白血病)

(b)Raji细胞系(淋巴瘤)

(c)SK-N-SH细胞系(神经母细胞瘤)

(d)SNUOT-Rb1细胞系(成视网膜细胞瘤)

(e)U87-MG细胞系(成胶质细胞瘤)

(f)OVCAR-3细胞系(卵巢癌)

(g)Huh-7细胞系(HCC，肝细胞癌)

(h)SNU398细胞系(HBV感染的HCC)

(i)Huh-7.5细胞系(HCV感染的HCC)

NK细胞对大多数癌细胞系显示出优异的细胞毒性。此外，NK细胞对各 种病毒感染细胞系显示出良好的细胞毒性。

在一些细胞系中，观察NK细胞分泌细胞因子的能力，NK细胞尤其对 K562细胞系和病毒感染的癌细胞系(HBV和HCV感染的HCC细胞系)显示出 强的细胞因子分泌能力。

总之，可以确定根据本发明生产的NK细胞对各种癌细胞系和病毒感染细 胞系具有优异的疗效(细胞毒性和分泌细胞因子的能力)。

工业实用性

与传统的方法相比，当采用如上所述的NK细胞培养技术时，即通过在 含抗-CD3抗体和细胞因子的培养基中静止培养，同时用饲养细胞重复刺激、 接着悬浮培养来生产NK细胞时，可通过临床上友好的方法高效地生产具有 高纯度、高细胞毒性和高细胞活性的NK细胞。根据本发明的方法生产的NK 细胞因为其细胞活性和细胞毒性可稳定地保持很长一段时间，具有优异的长 期存储稳定性。

特别地，向含通过本发明方法生产的NK细胞的组合物中加入白蛋白时， 细胞毒性和细胞活性会大大提高。此外，由于本发明的生产方法的特性，即 使当NK细胞被冷冻之后解冻时，仍能够保持它们的细胞毒性(即疗效)和 细胞活性。因此，能够以液体状态或冷冻状态容易地存储和提供NK细胞， 而无需额外的处理过程。

根据本发明生产的NK细胞在体外能够稳定地显示出它们的疗效，因而 包含所述NK细胞作为有效成分的组合物能够有效地用于治疗癌症和感染性 疾病。

尽管参照具体的特征已经详细地描述了本发明，对于本领域的技术人员 将显而易见的是，这种描述仅是为了优选的实施方式而不是限制本发明的范 围。因此，本发明的实质的范围将由所附权利要求和其等效物限定。