MUC15与p-AKT在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用

摘要

本发明涉及MUC15与p-AKT在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。首次揭示肝细胞癌中粘蛋白MUC15在癌中较癌旁明显低表达，且这种低表达与肝癌的恶性临床病理指标存在明显的相关性。并且，本发明揭示了肿瘤样本中MUC15和p-AKT水平的负相关性，建立了一种肝细胞癌的预后评估的方法。

说明书

技术领域

本发明属于医学生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及MUC15蛋白 与p-AKT蛋白的负相关性，及其在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。

背景技术

肝细胞癌是最致命的恶性肿瘤之一，世界范围内，占肿瘤相关死亡的第三 位，更是肝硬化病人死亡的首要原因[1，2，3]。2008年，新诊断的肝细胞癌病 人超过70万，按年龄分层，每10万人中，就有新诊断的肝细胞癌病人16个[4]。 经过仔细筛选的早期肿瘤病人，通过肝切除术，肝移植和射频消融，可以得到 有效的治疗[5]。但晚期肿瘤病人，因为术后复发转移，预后依然很差[6]。因此， 鉴定新的肝癌进展分子标记，并深刻理解肝癌术后转移复发的分子机制，对于 阻止肿瘤复发，延长患者生存依然十分重要。

蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB或AKT)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，与 磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)组成的PI3K/AKT信号 通路广泛存在细胞中，在凋亡、衰老、增殖等细胞生命活动中起重要作用[7]。 非磷酸化AKT蛋白不具备生物学活性，经磷酸化作用生成磷酸化 AKT(Phosphorylated AKT，pAKT)。

粘蛋白属于一类高分子量糖蛋白家族，通常在胞浆或者细胞膜上，会被高 度的O型糖基化包被。通常生理条件下，大部分上皮细胞中具有粘蛋白的表达。 近年来，很多文献报道粘蛋白在炎症向肿瘤的进展过程中，起到了很重要的作 用。粘蛋白MUC15最初是从牛奶脂肪小泡的膜上被分离鉴定的，其基因定位 于11号染色体短臂14.3区[8]。MUC15的mRNA在多种人类组织中通过逆转 录PCR被检测到。在人类胎盘的发育过程中，MUC15的表达在胚胎晚期比胚 胎早期要高。最近有研究揭示，在肿瘤的发生发展及转移过程中，MUC15可 能发挥了潜在的作用。例如，在结肠腺癌中，MUC15的表达是异常升高的， 并能促进人类结肠癌细胞的恶性表型[9]。但是过表达外源的MUC15，能够抑 制滋养层样细胞JAR和JEG-3的侵袭能力[10]。

然而，MUC15在肝癌发生发展及转移复发，以及肝癌术后预后评估中的 作用等研究，在国内外上仍是空白。

发明内容

本发明的目的在于提供MUC15与p-AKT联合应用作为肝癌预后评估标志 物的用途。

在本发明的第一方面，提供MUC15蛋白和p-AKT蛋白的用途，用于制备 进行肝细胞癌预后评估的诊断试剂。

在本发明的另一方面，提供一种用于肝细胞癌预后评估的试剂盒，所述试 剂盒中包括：

特异性检测MUC15蛋白表达水平的试剂；和

特异性检测p-AKT蛋白表达水平的试剂。

在一个优选例中，所述的试剂盒中，所述的特异性检测MUC15蛋白表达水 平的试剂是抗MUC15蛋白的抗体；和/或所述的特异性检测p-AKT蛋白表达水 平的试剂是抗p-AKT蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗MUC15蛋白的抗体是利用MUC15重组蛋白免 疫兔子后制备得到的。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：携带有可检测信号分子的检测抗 体。

在另一优选例中，所述的可检测信号分子选自(但不限于)：辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡 萄糖淀粉酶。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：免疫组化试剂。

在另一优选例中，所述的试剂盒中，所述的免疫组化试剂包括(但不限于)： 显色试剂，二甲苯，乙醇，H₂O₂甲醇液，抗原修复液，封闭液，PBS，中性树 脂。

在本发明的另一方面，提供特异性检测MUC15蛋白表达水平的试剂和特 异性检测p-AKT蛋白表达水平的试剂的用途，用于制备肝细胞癌预后评估的试 剂盒。

在一个优选例中，所述的特异性检测MUC15蛋白表达水平的试剂是抗 MUC15蛋白的抗体；和/或所述的特异性检测p-AKT蛋白表达水平的试剂是抗 p-AKT蛋白的抗体。

在本发明的另一方面，提供一种肝癌预后评估的方法，所述方法包括：

(1)应用前面任一所述的试剂盒检测受试者离体肝癌组织中MUC15蛋白 表达水平和p-AKT蛋白表达水平；

(2)分析蛋白表达水平，

若MUC15高表达且p-Akt低表达，则该受试者预后为低死亡率及低复发 率；

若MUC15低表达且p-Akt高表达，则该受试者预后为高死亡率及高发率；

若MUC15和p-Akt均高表达或MUC15和p-Akt均低表达，则该受试者预 后为中等死亡率及中等复发率。

在另一优选例中，所述肝癌预后评估方法包括以下步骤：

(a)利用所述试剂盒中的MUC15和p-AKT抗体和免疫组化实验试剂对切 片后的肝癌组织进行免疫组化染色；

(b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；

(c)利用生物图像处理软件分析整张组织芯片阳性信号强度，给出评分；

(d)根据评分计算肿瘤组织中粘蛋白MUC15和p-AKT蛋白分子表达量；

(e)根据MUC15和p-AKT的表达量水平的负相关性，对肝癌患者预后进 行评估。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。

附图说明

图1、经p-AKT及MUC15双指标检测后的肝细胞癌组织分类及相应患者预 后情况。

图2、免疫组化显示肝癌组织中MUC15蛋白表达量显著低于对应的癌旁组织。

(A)肝癌(Tumor)及癌旁组织(Peri-tumor)中MUC15免疫组化结果；

(B)313名患者肝癌及癌旁组织中MUC15表达量统计分析结果。

图3、313个临床样本中MUC15与p-Akt存在明显负相关。r=-0.185，p= 0.001。

图4、临床样本中MUC15与p-Akt负相关典型图片。

图5、结合MUC15和p-Akt显著增加了单独因素预测预后的效能。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现肝细胞癌中粘蛋白MUC15在 癌中较癌旁明显低表达。大样本验证发现，这种低表达与肝癌的恶性临床病理 指标存在明显的相关性。同时，本发明人将肿瘤样本中MUC15和p-AKT水平 的负相关性结合起来，建立了一种肝细胞癌的术后预后方法，该方法较应用 MUC15或p-AKT单一因素具有更好的预后准确性。

本发明利用免疫组化技术、显微镜拍照和计算机图像处理软件测定肿瘤组 织中MUC15与p-AKT蛋白的表达量，并结合术后随访信息，确定MUC15与 p-AKT的负相关性可用于判断手术后肝癌患者的预后效果，为肝癌病人术后监 控与序贯治疗提供了重要的指导。

为了准确地测定样本中MUC15和p-AKT蛋白的表达水平，本发明人建立 了针对MUC15和p-AKT蛋白的灵敏检测系统，从而有利于方便、快捷地用于 临床检测。作为本发明的优选方式，所述的检测系统是一种检测试剂盒，所述 的试剂盒中含有特异性结合MUC15和p-AKT蛋白的抗体。

作为本发明的优选方式，所述的特异性检测MUC15蛋白表达水平的试剂是 抗MUC15蛋白的抗体；和/或所述的特异性检测p-AKT蛋白表达水平的试剂是 抗p-AKT蛋白的抗体。

制备抗体的技术是本领域中众所周知的。本发明的抗体可以是对MUC15 或p-AKT蛋白具有特异性的单克隆抗体。单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制 备(见Kohler等人,Nature256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511, 1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal  Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。所述单克隆抗体可以利 用MUC15或p-AKT蛋白或蛋白片段或功能区，通过免疫技术获得。此外，还 可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。

本发明的抗体也可以是对MUC15或p-AKT蛋白具有特异性的多克隆抗 体。所述的多克隆抗体可通过常规的方法来制备，例如，可通过将所述的MUC15 或p-AKT蛋白导入动物中来获得，例如，将MUC15或p-AKT蛋白与弗氏佐 剂按照适当比例(如1:1)混合后免疫动物。免疫方法可使用动物皮下注射。所述 动物可选自兔、羊、牛等。作为本发明的优选方式，采用兔来生产所述的多克 隆抗体：兔免疫2-3个月后，从其静脉血中收获抗血清并纯化，获得特异性多 克隆抗体。

在获得了特异性检测MUC15蛋白表达水平的试剂和特异性检测p-AKT蛋 白表达水平的试剂后，可以方便地制备出用于特异性检测MUC15和p-AKT蛋 白的检测试剂盒。所述试剂盒中除了含有所述抗体以外，还可以包含：携带有 可检测信号分子的检测抗体(用于与抗MUC15抗体或抗p-AKT抗体结合)，以及 疫组化试剂。所述的免疫组化试剂包括但不限于：显色试剂，二甲苯，乙醇， H₂O₂甲醇液，抗原修复液，封闭液，PBS，中性树脂等。

如本文所用，所述的“可检测信号分子”是指用于确定待检测样品中MUC15 和p-AKT蛋白的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所 采用的特异性抗体和检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来 进行检测的各种可检测信号分子。例如，可检测信号分子可以选自：辣根过氧 化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、 过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。

当采用如上所示的一些酶作为可检测信号分子时，还需要采用一些与相应 的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导可检测信号分子的存在情况或 者存在量。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基 联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl  phosphate，p-NPP)；等等。本领域人员可根据所采用的可检测信号分子的种类 和特性，选择适宜的底物。

在获得了本发明提供的试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样 品中MUC15和p-AKT蛋白的表达量，这些方法均被包含在本发明中。

作为一种优选方式，本发明提供了使用上述试剂盒用于体外检测MUC15 和p-AKT蛋白在肝癌组织中的表达量的方法，该方法包括以下步骤：

(a)利用所述试剂盒中的MUC15和p-AKT抗体和免疫组化实验试剂对切 片后的肝癌组织进行免疫组化染色；

(b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；

(c)利用生物图像处理软件分析整张组织芯片阳性信号强度，给出评分；

(d)根据评分计算肿瘤组织中粘蛋白MUC15和p-AKT蛋白分子表达量。

本发明人应用组织芯片免疫组织化学评分方法，对大量患者(313例)样本进 行了免疫组化分析，用Image Scope软件对组织芯片进行扫描，扫描后采用该 软件的Algorithms(Positive Pixel Count)程序对每个芯片点进行“阳性Pixel” 计算。如表1计算数据。最终确定：MUC15高低表达标准可以以表达评分中 位数(0.35)为界限；p-AKT高低表达标准可以以表达评分中位数(0.37)为界限。 高于所述界限可确定为高表达，低于所述界限可以确定为低表达。上述界限可 以作为临床诊断的依据。

综上，根据MUC15和p-AKT的表达量水平的负相关性，对肝癌患者预后 进行评估。本发明首次提出利用MUC15及p-AKT的负相关性进行检测并预测 肝细胞癌手术后复发转移等事件，并判断预后，对于肝细胞癌病人术后监控和 序贯治疗也具有重要的指导意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版， 科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、MUC15在肝癌及癌旁组织中的差异化表达

1、临床组织样本的选取

313例原发性肝细胞癌组织标本随机取自于2006年1月-2009年9月在第 二军医大学东方肝胆外科医院接受肝切除手术的HCC病人。书面知情同意书 均于术前获得。入组和排除的标准：术前体能评分WHO0-1；肝功能Child-Pugh 分级为A级；没有远处转移；无肉眼可见腹水；无肝性脑病；术前未接受任何 放化疗；均为根治性切除；所有病人术后病理均证实为肝细胞癌。按照国际抗 癌联盟(UICC)2002第六版进行TNM分期。本研究313例肝细胞癌患者中男性 为281例，女性32例，男女比例为9:1；平均年龄49.6±10.2岁，范围21-83 岁；本组病例均为HBsAg阳性(313/313)；无围手术期死亡病例。

实施例2、免疫组化法检测肝癌及癌旁组织中MUC15的表达情况

对上述313例肝癌患者的癌及癌旁组织，进行MUC15免疫组化实验，结 果表明肝癌组织中MUC15蛋白的表达水平明显低于对应的癌旁组织 (Peritumor)，如图2。

实施例3、MUC15与p-AKT在肝癌患者中表达情况与预后的关联

1、组织芯片的构建

首先对上述313例病人的每一个供体蜡块进行切片和苏木素-伊红(HE)染 色。显微镜下对所需穿取的目标组织进行定位，分别选取有代表性的癌和癌旁 组织各3个位点，利用组织芯片制作仪依次从供体蜡块上穿取直径为1mm的 组织芯，插入有240个点阵的受体蜡块中，以4μm的厚度连续切片，所得的组 织芯片的每个点都经过病理诊断。

2、免疫组化(DAB法)步骤

(1)-20℃取组织块，石蜡包埋，切片。

(2)石蜡切片60℃烤箱过夜。

(3)切片脱腊、水合：二甲苯①10min→二甲苯②10min→二甲苯③10min →100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→双蒸水 5min。

(4)3%H₂O₂甲醇液，室温放置20min，去除内源性过氧化物酶。

(5)双蒸水洗5min×3次。

(6)抗原修复：切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液中煮沸5min，停火10min， 再煮沸5min。

(7)自然冷却至室温，双蒸水洗5min×3次。

(8)1%BSA封闭30min，37℃。

(9)甩去封闭液，不洗，直接加一抗(抗MUC15多克隆抗体或抗p-AKT 多克隆抗体)，置入湿盒中30min，37℃，后4℃冰箱过夜。

(10)4℃取出，室温下复温15min，0.01M PBS洗5min×4次。

(11)滴加DAKO二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体)，湿盒中45 min，37℃。

(12)0.01M PBS洗5min×4次，DAB显色2-10min，镜下观察。

(13)双蒸水终止显色，0.01M PBS洗5min×1次。

(14)苏木精-伊红或甲基绿复染2min，无水乙醇脱色5-10s。

(15)二甲苯脱水透明，滴中性树脂后盖玻片覆盖封片。

(16)显微镜下观察阳性染色。

3、免疫组化结果判定方法

组织芯片免疫组织化学评分方法：采用Image Scope (Aperio公司)软件对整 张组织芯片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count)程序 对每个芯片点进行“阳性Pixel”计算。获得计算数据如表1。

表1

每个组织芯片点的组化评分计算方法为Log10[255/Iavg]，其中Iavg= (Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即平均强度，计算方法：

平均强度=(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱 阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)。

MUC15高低表达标准以313例肝癌组织中MUC15表达评分的中位数(0.35) 为界；p-AKT高低表达标准以313例肝癌组织中p-AKT表达评分的中位数(0.37) 为界。

如图3所示，在临床样本中，MUC15的表达和p-Akt的表达存在明显的负 相关关系。图4显示了较典型的三例样本中MUC15和p-Akt的染色情况。

结合患者肿瘤组织中MUC15表达水平和p-Akt表达水平，将313例肝癌 患者分为四组：

MUC15高表达(表达评分高于0.35)且p-Akt高表达(表达评分高于0.37)组；

MUC15高表达(表达评分高于0.35)且p-Akt低表达组(表达评分低于0.37)；

MUC15低表达(表达评分低于0.35)且p-Akt高表达组(表达评分高于0.37)；

MUC15低表达(表达评分低于0.35)且p-Akt低表达(表达评分低于0.37)组。

将上述四组患者进行长期观察，每年统计患者的复发情况及生存率。将72 个月的跟踪分析，发现肿瘤样本中较低的MUC15表达水平和较高的p-Akt水 平明显具有更差的总体生存率和更高的术后复发率；而肿瘤样本中较高的 MUC15表达水平和较低的p-Akt水平则明显具有较高低生存率和较低的术后复 发率，差异显著，如图5和图1。

并且，将MUC15水平和p-Akt水平结合后，明显较单独MUC15或p-Akt 一个因素能更好的预测患者的预后。

实施例4、检测试剂盒的制备

本实施例中，制备的试剂盒组成如下：

1、p-AKT多克隆抗体(购自Cell Signaling Technology公司)；

2、MUC15多克隆抗体(购自Sigma公司)；

3、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(购自DAKO公司，丹麦)。

4、其它免疫组化试剂：二甲苯，乙醇，3%H₂O₂甲醇液，抗原修复液，封 闭液，DAB显色试剂，甲基绿，0.01M PBS，中性树脂，苏木精-伊红。

实施例5、检测试剂盒的临床应用

获得5位临床患者的肝癌组织，如实施例3的方法制备免疫组化样本(组织 芯片)，如实施例3采用Image Scope软件对组织芯片进行扫描，扫描后采用该 软件的Algorithms(Positive Pixel Count)程序对每个芯片点进行“阳性Pixel” 计算。MUC15高低表达评分以0.35为界；p-AKT高低表达标准以中位数0.37 为界。

结合MUC15表达水平和p-Akt表达水平，去预测患者的预后。结果如下：

2位患者MUC15低表达(表达评分显著低于0.35)且p-Akt高表达(表达评分 显著高于0.37)组，预后为高死亡率、高复发率；建议后续进行积极检查和治疗。

2位患者MUC15高表达(表达评分显著高于0.35)且p-Akt低表达(表达评分 显著低于0.37)组，预后为低死亡率、低复发率；预后较为乐观，但需定期回访 检查，必要时进行治疗。

1位患者MUC15高表达(表达评分显著高于0.35)且p-Akt高表达(表达评分 显著高于0.37)组，预后为中等死亡率及复发率；建议后续进行积极检查和治疗。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

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