含水溶性有机溶剂的脱蜡缓冲液及其使用方法

摘要

含水溶性有机溶剂的脱蜡缓冲液、其使用方法以及包含脱蜡缓冲液的试剂盒。所述脱蜡缓冲液含有沸点至少为80℃的水溶性有机溶剂。本文所述脱蜡缓冲液可用于在水性缓冲溶液中以及升高的温度下快速并有效地去除装载在玻片上的组织切片上的包埋石蜡，同时无须担心玻片上的石蜡再沉积。此外，本文所述脱蜡缓冲液可用于在单个步骤中进行脱蜡和HIER，从而大幅减少实验时间并降低样品损失或损坏的风险。

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2012年1月23日提交的美国专利申请号13/356,491的优先权， 其内容通过引用全文纳入本文。

背景

作为一种组织学研究中制备组织样品所用的包埋介质，石蜡已经被使用了 很长时间。在一些情况下，塑料树脂也被用作包埋介质。这类包埋过程通常包 括以下步骤：样品固定(如福尔马林固定)、脱水、清洗、石蜡浸润或浸渍、 封闭或包埋在一块石蜡中，将石蜡块和样品切成薄片，将切片装载在玻片上、 去除石蜡和用于该目的(即脱蜡或脱石蜡)的溶剂、以及在镜检前对切片进行 染色。包埋介质的主要目的是使样品在天然状态下被切片和装载。石蜡包埋的 优势在于可在染色前将蜡溶解使之与样品分离，从而使染色时切片为裸露组织 的形式并且避免了与难以去除的基于树脂的包埋材料的存在相关的额外困难。

最近对于石蜡包埋组合物的改进拓宽了其实用性，同时保留了其与下游样 品制备和分析的相容性。因此，对固定后石蜡包埋材料切片的脱蜡仍是一种广 泛使用的方法，尤其是在免疫诊断目的的医院组织病理学实验室中。

一种通常使用的脱蜡方法涉及在有机溶剂中溶解包埋的石蜡。例如，目前 通常在实验方案中使用二甲苯(一种可燃、有挥发性和毒性的有机溶剂)以溶 解石蜡，实现对样品切片的脱蜡。通常，将装载在显微镜玻片上的样品浸入二 甲苯浴中直至石蜡溶解。

另一种常用于脱蜡的方法涉及在含水性缓冲溶液的热浴中熔解并去除包 埋的石蜡。使用热缓冲溶液的额外优势在于其可通过一种被称作热诱导表位修 复("HIER")的过程进行抗原修复。HIER是一种常在免疫组化("IHC")或原 位杂交("ISH")前使用的预处理过程，用于通过对装载在玻片上的样品材料中 所含靶蛋白的分子构象进行热诱导修饰以改善染色。通常该修饰过程是必需 的，因为虽然醛基固定剂(如福尔马林)能够很好地保存细胞形态，但它们也 会引起蛋白交联，导致一些蛋白表位无法结合互补的抗体。HIER通常与酶消 化联用，作为改善IHC/ISH染色反应中多种抗原反应性的方法。

现有的被设计用来在IHC/ISH前同时对玻片脱蜡并进行HIER的缓冲液配 方利用了低浓度的表面活性剂和其他乳化剂以破碎石蜡。HIER步骤中玻片被 置于高温(如70至100℃)下，使石蜡熔化且表面活性剂温和地将石蜡运送 至缓冲液表面。然而，已知的缓冲液配方和方法的性能有限，有时会造成石蜡 拖尾、玻片重新涂覆和不一致的染色结果。

相应地，需要能够在免疫组化或其他诊断分析前有效地去除样品中的石蜡 或改良的石蜡基包埋材料的脱蜡组合物和方法，同时最小化对使用者的危险， 与自动系统相容且保持与下游分析的相容性。需要不存在毒性或致癌性或毒性 或致癌性有限、不产生或产生最少量的气味、能够降低有毒溶剂的使用量，使 有毒废物最少和/或能够降低腐蚀性和可燃性的脱蜡组合物和方法。

发明内容

本发明公开了含水溶性有机溶剂的脱蜡缓冲液及其使用方法以及包含脱 蜡缓冲液的试剂盒。本文所述脱蜡缓冲液可用于在高温下的水性缓冲溶液中快 速并有效地去除装载在玻片上的组织切片中的包埋的石蜡，同时无需担心玻片 上石蜡的再沉积。此外，本文所述脱蜡缓冲液可在单个步骤用于脱蜡和HIER， 能够大幅减少实验方案的时间并降低样品损失或破坏的风险。

在一个实施方式中，一种脱蜡缓冲液包括缓冲剂、沸点高于80℃且在水 中的溶解度至少为20体积百分比("vol％")的有机溶剂和水。所述脱蜡缓冲液 的工作溶液可包括大于95vol％的水。在一个实施方式中，可使用浓缩脱蜡缓 冲剂，通过用水稀释浓缩液以制备脱蜡缓冲液工作溶液。

在一个方面，所述脱蜡缓冲液能够在高温下在水性溶液中溶解熔解后的包 埋石蜡且熔解后的石蜡在冷却后不会发生再固化。同样，所述脱蜡缓冲液能够 降低石蜡的熔点，这可以大幅减少实验方案的时间。人们认为该活性是由于水 溶性有机溶剂的作用。也就是说，由于溶剂化学性质的双重性，人们认为该溶 剂能够在水性溶液中破坏氢键，并在水中溶解有机分子(如石蜡)。

通过以下描述和所附权利要求书或者通过学习下文中所述的本发明的实 践，可以更充分地理解本发明的这些和其他目的及特征。

发明详述

I.引言

本发明公开了含水溶性有机溶剂的脱蜡缓冲液及其使用方法以及包含脱 蜡缓冲液的试剂盒。本文所述脱蜡缓冲液可用于在高温下的水性缓冲溶液中快 速并有效地去除装载在玻片上的组织切片中的包埋石蜡。本文所述脱蜡缓冲液 能够溶解熔解后的包埋石蜡，这意味着可从脱蜡缓冲液中移出玻片同时无需担 心玻片上石蜡的再沉积。本文所述脱蜡缓冲液能够降低石蜡的熔点，这可以大 幅减少实验方案的时间。同样，因为是在水性溶液中对装载在玻片上的组织样 品进行脱蜡，所以脱蜡前无需对组织样品进行脱水。这也可大幅减少玻片处理 的时间。此外，本文所述脱蜡缓冲液可在单个步骤用于进行脱蜡和HIER，能 够大量减少实验方案的时间并降低样品损失的风险。

II.脱蜡缓冲液

在一个实施方式中，描述了一种脱蜡缓冲液。所述脱蜡缓冲液包括缓冲剂、 沸点高于80℃且在水中的溶解度至少为20体积百分比("vol％")的有机溶剂 和水。在一个实施方式中，所述脱蜡缓冲液的pH范围为约pH 5至约pH 10， 或者约pH 6至约pH 9。但通常可根据优选用于特定组织类型或特定脱蜡实验 方案的pH选择任意的pH。

在一个实施方式中，所述脱蜡缓冲液能够在水中溶解有机分子(如石蜡)。 人们认为有机溶剂的主要作用在于这一特性。然而，如下文所详细讨论的那样， 在脱蜡期间和脱蜡后，脱蜡缓冲液的各组分协同作用以稳定细胞结构，从而有 效且完全地去除装载在玻片上的组织样品中的包埋蜡，避免包埋蜡在玻片上再 沉积并在脱蜡期间和脱蜡后稳定细胞结构。

在一个实施方式中，所述有机溶剂的沸点为至少90℃、至少100℃、至 少110℃、至少120℃、至少130℃、至少140℃、至少150℃、至少160℃、 至少170℃、至少180℃、至少190℃或至少200℃。但通常沸点较高的溶 剂(如沸点高于110℃的溶剂)优于沸点较低的溶剂(如沸点低于约75℃的 溶剂)。例如，一些HIER实验方案要求在高温(如高于80℃)下将玻片在脱 蜡缓冲液中孵育约1-20小时。在这类情况下，沸点较高的溶剂从缓冲液中蒸发 的可能性较小，如果发生蒸发则会随着时间降低缓冲液溶解蜡的能力。同样， 优选沸点较高溶剂的原因在于由于其不易蒸发的事实，其产生溶剂气味的可能 性较小。

在一个实施方式中，所述脱蜡缓冲液的工作溶液可包括约0.1vol％、0.2 vol％、0.25vol％、0.3vol％或0.4vol％的下限量的有机溶剂，约5vol％、3vol％、 2vol％、1vol％或0.5vol％的上限量的有机溶剂，或列出的下限量和上限量的 任意组合。在一个优选实施方式中，所述缓冲液包括约0.25vol％的有机溶剂。 所含有机溶剂量低至0.1vol％至0.25vol％的本文所述脱蜡缓冲液能够溶解装 载在玻片上的组织样品中的大量包埋蜡。应当理解的是，可使用如此少量的有 机溶剂在水性溶液中溶解包埋蜡是出乎意料的。

在一个实施方式中，所述有机溶剂可具有约20vol％、25vol％、30vol％、 35vol％、40vol％、45vol％或50vol％的下限范围水溶性，99vol％、95vol％、 90vol％、85vol％、80vol％、75vol％、70vol％、65vol％、60vol％、55vol％、 50vol％的上限范围水溶性，或列出的下限和上限水溶性限值的任意组合。在一 个优选实施方式中，所述有机溶剂与水互溶(即可以任意比例混合溶剂和水)。

在一个实施方式中，合适的具有上文所述特性且可包含于脱蜡缓冲液中的 有机溶剂的示例包括但不限于脂肪族化合物、醇、醛、酮和杂环有机化合物的 酯类衍生物(如氧杂环丁烷、呋喃、四氢呋喃、吡喃、四氢吡喃、噻丁环、噻 吩、四氢噻吩、噻喃或四氢噻喃)。例如，已知的四氢呋喃(也被称作氧戊环) 衍生物包括但不限于甲基四氢呋喃、四氢呋喃醇、2-(羟基甲基)氧戊环-3-醇、 糖呋喃亚甲基(2-((四氢糠基)氧基)乙醇)、2-(羟基甲基)氧戊环-3,4-二醇、二羟 基甲基四氢呋喃、甲基四氢呋喃羧酸盐等。其他上文所列化合物的衍生物包括 但不限于四氢噻吩基甲醇、四氢吡喃基甲醇、(氧杂环丁烷氧基)甲醇和呋喃醇。

在另一个实施方式中，所述有机溶剂至少是糠醛、糠醇、甲基四氢呋喃、 四氢呋喃醇、二甘醇二甲醚、二甘醇、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二噁烷、二 乙醇胺、丙二醇或其衍生物中的一种。

在一个优选实施方式中，所述有机溶剂是四氢呋喃醇("THFA")。THFA 的沸点约178℃，这意味着其不易蒸发，其可与水混容、气味极少、非反应性、 毒性低且易于生物降解。此外，THFA来源于农业产品(如玉米芯和甘蔗渣) 且其不是石油蒸馏的产物。在另一个优选实施方式中，所述有机溶剂是甲基四 氢呋喃("me-THF")。me-THF的许多特性与THFA相同，除了me-THF的沸点 为约78-80℃。下文的式1和2分别显示了THFA和me-THF的结构。

在一个实施方式中，所述脱蜡缓冲液还可包括约0.5vol％至约2vol％的多 官能醇。合适的多官能醇的示例包括但不限于聚乙二醇("PEG")、聚丙二醇 ("PPG")、糖醇及其组合。多官能醇(如PEG)可通过改变和/或破坏水的正常 氢键结构改变水的活性。在本例中，发明人发现PEG有助于溶解蜡并随着脱蜡 溶液冷却形成晶体结构和絮凝，这有助于防止包埋蜡在玻片上的再沉积。此外， PEG可帮助稳定组织样品中的细胞结构，使得染色效果更好更一致且细胞形态 更佳。

PEG是环氧乙烷的寡聚物或多聚物，通过环氧乙烷的多聚化进行制备。市 售可得从约200g/mol至约10,000,000g/mol的大范围分子量的PEG。PEG易溶 于水和多数醇且通常在酸性和碱性溶液中稳定。下文式3显示了PEG的基础结 构。

在PEG中，n可低至约4(PEG 200)或为成百上千(非常高分子量的PEG)。 分子量最大为约600道尔顿的PEG通常为液体；平均分子量高于600道尔顿的 PEG在室温下通常为固体。通常根据多聚物的平均分子量表示PEG。例如，PEG 200是一种平均分子量为200道尔顿的多聚物，PEG 500是一种平均分子量为 500道尔顿的多聚物，PEG 1000是一种平均分子量为1000道尔顿的多聚物， 依此类推。在一些命名系统中，还根据n的值对PEG进行分类。例如PEG 200 常指PEG 4，PEG 500常指PEG 10，PEG 1000常指PEG 20，依此类推。

本发明中可使用的PEG的适当示例包括液态PEG(如PEG 200、PEG 300、 PEG 400、PEG 500和PEG 600)和固态PEG(如PEG 1000、PEG 2000、PEG 5000、 PEG 10,000、PEG 15,000等)。可将易溶于水的固态PEG制成可加入脱蜡缓冲 溶液中的水性溶液(如50％质量/体积溶液)。在一个优选实施方式中，PEG 选自PEG 200、PEG 300、PEG 400、PEG 500、PEG 600及其组合。在一个更 优选的实施方式中，所述PEG是PEG 200。

PPG(又名聚环氧丙烷)是一种丙二醇的多聚物。PPG具有与聚乙二醇相 同的许多特性。但随着分子量的升高水溶性迅速下降。PPG中仲羟基的反应性 低于聚乙二醇中的伯羟基。PPG的毒性通常低于PEG。下文式4显示了PEG 的基础结构。

糖醇具有通式H(HCHO)n+iH，而糖为H(HCHO)nHCO。糖醇是碳水化合 物的氢化形式，其羰基(醛或酮，还原糖)被还原为伯或仲羟基(因此成为醇)。

一些常见的糖醇包括阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇(5–碳)、甘露糖醇、 山梨糖醇(6–碳)、异麦芽糖、麦芽糖醇、乳糖醇和聚糖醇(12–碳)。单糖、 二糖和多糖可形成糖醇；但来源于二糖和多糖的糖醇(如麦芽糖醇和乳糖醇) 并未全部氢化。

在一个实施方式中，所述脱蜡缓冲液可进一步包括约0.1vol％至约4vol％、 约0.15vol％至约3vol％、约0.2vol％至约2vol％、约0.25vol％至约1vol％、 约0.30vol％至约0.5vol％、约0.35vol％至约0.4vol％的表面活性剂。优选地， 脱蜡缓冲液中表面活性剂的含量为约0.25vol％。在一些情况下，表面活性剂含 量较高(如高于约4％)的表面活性剂溶液可有效地对装载在玻片上的组织样 品进行脱蜡并固定包埋石蜡。然而，发明人发现通常并不推荐使用如此高水平 的表面活性剂，因为其会溶解组织中细胞的部分细胞膜并形成人造产物。

在一个实施方式中，适当的可包含在脱蜡缓冲液中的表面活性剂示例包括 但不限于阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂、 非离子型表面活性剂及其组合。在一个特定实施方式中，所述表面活性剂可以 是曲通X-100(也被称作辛基酚乙氧基化物)或吐温20(也被称作聚氧乙烯(20) 山梨糖醇酐单月桂酸酯)。

在一个实施方式中，上文所述脱蜡缓冲液工作溶液包括高于95vol％、高 于96vol％或高于97vol％的水。

在一个实施方式中，公开了一种浓缩脱蜡试剂。所述浓缩脱蜡试剂可包括 缓冲剂、沸点高于约80℃且水溶性至少20vol％的有机溶剂、约7.5vol％至约 30vol％的PEG 200和至少45vol％至50vol％的水或优选至少47vol％的水。在 一个实施方式中，所述浓缩脱蜡试剂还可包括约3vol％至约15vol％的表面活 性剂。

在一个实施方式中，可使用浓缩脱蜡缓冲剂，通过用水稀释浓缩液以制备 上文所述脱蜡缓冲液工作溶液。例如，可使用1400ml去离子水稀释100ml浓 缩试剂以制备1500ml脱蜡缓冲液工作溶液。

在一个实施方式中，所述浓缩脱蜡试剂可包含于试剂盒中，所述试剂盒包 括至少一个容器的浓缩脱蜡试剂和一份实验方案，所述实验方案包括稀释浓缩 脱蜡试剂以制备脱蜡缓冲液工作溶液的说明书和在脱蜡缓冲液中对装载在玻 片上的组织切片进行脱蜡的方法的说明。

在一个实施方式中，所述试剂盒还可包括含有能够在约pH 6时提供缓冲 的第一缓冲剂的第一浓缩脱蜡试剂，含有能够在约pH 8时提供缓冲的第二缓冲 剂的第二浓缩脱蜡试剂和含有能够在约pH 9时提供缓冲的第三缓冲剂的第三 浓缩脱蜡试剂。每个第一、第二和第三浓缩脱蜡试剂均包括有机溶剂、PEG 200 和水。

在一个实施方式中，所述第一浓缩脱蜡试剂包括第一着色剂，所述第二浓 缩脱蜡试剂包括第二着色剂且所述第三浓缩脱蜡试剂包括第三着色剂，且所述 第一、第二和第三着色剂的作用是提供一种通过视觉区分所述第一、第二和第 三浓缩脱蜡试剂的简便方法。例如，所述第一浓缩脱蜡试剂可包括橙色，所述 第二浓缩脱蜡试剂可包括紫色，且所述第三浓缩脱蜡试剂可包括蓝色。在选择 这类颜色以方便区分多种缓冲溶液的同时，还需选择的着色剂为惰性且不干扰 脱蜡及后续的染色实验方案。

III.脱蜡方法

在一个实施方式中，描述了一种脱蜡方法。所述方法包括(1)提供装载在 玻片上的组织切片，所述组织切片至少部分包埋于包埋石蜡中以及(2)将所述 装载在玻片上的组织切片浸入脱蜡缓冲液中，所述脱蜡缓冲液包括缓冲剂、沸 点高于80℃且在水中的溶解度至少为20体积百分比("vol％")的有机溶剂和 至少95vol％的水。在一个实施方式中，所述脱蜡缓冲液还包括至少一种PEG 或表面活性剂。

所述方法进一步包括(3)将所述装载在玻片上的组织切片在脱蜡缓冲液 中在所选温度下孵育一段足够对所述装载在玻片上的组织切片进行脱蜡的时 间，(4)冷却所述脱蜡缓冲液，以及(5)将所述装载在玻片上的组织切片从所 述脱蜡缓冲液中移出。

在一个实施方式中，所述孵育还包括：(i)在约室温下将所述装载在玻片 上的组织切片浸入所述脱蜡缓冲液中，(ii)在所述脱蜡缓冲液中将所述装载在 玻片上的组织切片预热至约85℃，(iii)提高其中浸没所述装载在玻片上的组 织切片的所述脱蜡缓冲液的温度至约97℃，(iv)使所述装载在玻片上的组织 切片在约97℃下在所述脱蜡缓冲液中孵育10分钟至24小时，以及(v)将其 中浸没所述装载在玻片上的组织切片的所述脱蜡缓冲液的温度冷却至约85℃。

在一个实施方式中，所述脱蜡缓冲液能够降低包埋石蜡的熔点，降低幅度 为至少5℃、至少7℃或至少10℃。不受单一理论限制，人们认为有机溶剂 在降低包埋石蜡熔点的过程中起主要作用。这类对包埋蜡或石蜡熔点的降低可 大幅减少去除装载在载玻片上的组织切片中包埋蜡所需的时间和能量。

在一个实施方式中，100ml所述脱蜡缓冲液能够在水性溶液中溶解至少1g 至5g石蜡。应当理解的是，仅含有例如约0.25vol％有机溶剂的脱蜡缓冲液能 够溶解如此大量的石蜡是出乎意料的。

在一个实施方式中，在约58-62℃或更高温度下，所述脱蜡缓冲液能够溶 解装载在玻片上的组织切片中基本所有的包埋石蜡。相似地，在约55℃下所 述脱蜡缓冲液能够溶解装载在玻片上的组织切片中约7-12％的包埋石蜡，在低 于55℃的温度下所述脱蜡缓冲液能够溶解装载在玻片上的组织切片中约5％ 的包埋石蜡，

在石蜡包埋的组织样品上测试所述缓冲液和本文所述脱蜡/表位修复方法 时，发现本文所述缓冲液可以在水性溶液中有效地对玻片进行脱蜡，同时无需 恢复使用有毒且有害的有机溶剂(如二甲苯)。并且由于玻片在水性溶液中脱 蜡，在脱蜡前无需对组织进行脱水，当玻片在二甲苯或类似溶剂中脱蜡时，这 一脱水过程通常是必需的。相对于已知的实验方案，这可以节约大量时间。

本文所述脱蜡/表位修复方法与标准的缓冲液和方法相比较。例如，使用标 准柠檬酸缓冲液、Dako Flex低pH以及包含柠檬酸缓冲液、1.5vol％PEG 200、 0.5vol％曲通XI 00、0.5vol％THFA和～97vol％DI水的脱蜡缓冲液测试并比较 了脱蜡/表位修复。我们观察到与使用标准柠檬酸缓冲液和Dako Flex低pH所 达到的脱蜡/表位修复效果相比，使用本文所述缓冲液/方法处理的组织的脱蜡 效果至少相当且在许多方面更好。相似地，使用本文所述缓冲液/方法处理的组 织展现出良好的细胞形态且未见因低效的除蜡或再沉积产生的人造产物。

可使用本领域已知的任意方法加热所述脱蜡缓冲液用于脱蜡和/或表位修 复(如HIER)。相似地，本文所述缓冲液和方法并不依靠昂贵且复杂的自动 化仪器，这类自动化仪器会不必要地消耗大量缓冲液或因有害的加热和清洗步 骤存在样品损失或损坏风险。例如，可在被称作PT模块的缓冲液槽中加热缓 冲液，该缓冲液槽可购自加利福尼亚州弗里蒙特视觉实验室公司(Lab Vision, Incorporated of Fremont,California)。所述PT模块被设计用来提供玻片预处理 相关手动步骤的标准化。

所述PT模块同时被设计用来在免疫染色前在玻片上进行脱蜡和表位修复 (即HIER)。将玻片装入PT模块并浸入脱蜡缓冲液中。所述PT模块含有一 台用于编写预处理程序的集成计算机。用户也可修改时间和温度设置以进一步 最优化结果。

典型的PT模块含有可以容纳约1500ml缓冲液和对24块玻片同时进行脱 蜡的缓冲液槽。本文所述1500ml缓冲液可以使用至多五至八次、或优选地至 多三次独立的脱蜡而不会超出缓冲液的脱蜡能力。也就是说，我们发现本文所 述1500ml缓冲液可用于对多达192至120块独立玻片、或优选地约72块玻片 进行脱蜡，同时不会观察到低效除蜡或蜡再沉积的迹象。

此外，不同于本领域已知的一些依靠在水平盘上每次处理一片玻片、使石 蜡漂浮在水性溶液顶部(即石蜡与缓冲液不互溶)进行脱蜡的方法，本文所述 缓冲液和方法通过将石蜡真正溶解在水性溶液中的方式进行脱蜡。正因为如 此，可以在加热的缓冲液槽中以垂直排列的形式整批地处理玻片，而无需使用 复杂的系统移除溶液表面已熔化的蜡。这结合了诸如二甲苯的溶剂的除蜡有效 性和水性缓冲液中除蜡的便捷。

IV.实施例

实施例1–工作缓冲液配方

下文表1-3显示了几种脱蜡缓冲液工作溶液的配方。

表1

表2

表3

实施例2–工作缓冲液配方

下文表4-6显示了几种浓缩脱蜡缓冲试剂溶液的配方。

表4

表5

表6

实施例3–脱蜡缓冲液–石蜡溶解性测试

该组测试的目的是理解四氢呋喃醇和聚乙二醇对于石蜡在水性缓冲溶液 中溶解性的作用。制备了脱蜡HIER缓冲液，使得HIER过程期间石蜡部分溶 解。HIER期间在PT模块中将石蜡从垂直浸入的玻片上移除。冷却后，石蜡部 分再沉淀，但程度远低于其他已知的脱蜡缓冲液。

因为PT模块需要玻片处于垂直方向，所以需要石蜡在HIER过程的较高 温度加热步骤(即高于85摄氏度)期间完全溶解在缓冲液中。在该高温加热 期间，石蜡熔解并与玻片分离。如果缓冲液中没有增加石蜡溶解度的添加剂， 则石蜡会简单地聚集在缓冲液表面，就像油在水上(或橄榄油在醋上)一样。

在缓冲液到达冷却温度后(约75至85摄氏度)，可从HIER缓冲液中取 出玻片，此时如果缓冲液中没有增加石蜡溶解度的添加剂，则缓冲溶液会重新 包被玻片。通过使用添加剂(如聚乙二醇200(PEG 200)和甲基四氢呋喃醇 (THFA))，我们能够在HIER过程期间部分溶解石蜡。这些实验被设计用来说 明在多种温度下这两种添加剂是如何在水性缓冲溶液中与石蜡(Histoplast LP) 相互作用的。

预期结果：预期结果显示在脱蜡缓冲液的部分石蜡溶解特性中THFA和 PEG 200均无法单独发挥作用。相反地，预期结果将显示两种添加剂共同作用 形成了脱蜡缓冲液的部分石蜡溶解特性。

实验设计：

缓冲液：

D HIER L1–包含柠檬酸盐缓冲液、1.5vol％PEG 200、0.5vol％曲通 X100、0.5vol％THFA和-97vol％DI水的缓冲液。

D HIER L2：与L1相同，除了不添加PEG 200并用DI水代替。

D HIER L3：与L1相同，除了不添加THFA并用DI水代替。

HIER L：用于HIER的标准柠檬酸盐缓冲液，不含PEG 200或THFA。

Dako Envision Flex低pH(红色)：竞争脱蜡缓冲液

100ml各缓冲液中放置5克石蜡。在持续搅拌下将溶液加热至58摄氏度。 在58摄氏度下观察溶解的石蜡的相对百分比。允许在持续搅拌下继续加热工 作溶液并纪录石蜡完全溶解时的温度。然后，停止加热溶液并使其冷却至55 摄氏度。在55摄氏度下过滤溶液并称量滤纸上收集的残余物。用各工作溶液 中最初放入的物质质量减去过滤得到的物质质量。差值即55摄氏度下溶解在 溶液中的石蜡质量。

观察：

1.在实验的加热期间，我们注意到D HIER L1和D HIER L2与熔解的石 蜡形成完全的悬浊液。即溶液混浊、起泡且未显示与水性工作溶液存在任意形 式的分离。

2.在实验的加热期间，我们注意到D HIER L3在水性缓冲液的顶部出现 一层油层。该油层是澄清且无色的。水性溶液是澄清且带有浅橙色(与母液的 颜色一致)。水性溶液并非完全混浊且没有显示起泡。

3.在实验的加热期间，我们注意到HIER L缓冲液出现澄清且无色的一层 明显油层。水性缓冲溶液也是澄清且无色的，且不混浊也不起泡。

4.在实验的加热期间，我们注意到Dako Envision Flex红缓冲液在水性缓 冲液的顶部出现一层明显油层。该油层是澄清且无色的。水性溶液是澄清且带 有浅红色，与母液的颜色一致。

5.D HIER L1、L2和L3在58摄氏度下各溶解(即熔解)了90％的石蜡。 HIER L缓冲液和Dako Flex缓冲液仅分别显示了40％和60％的溶解。

6.D HIER L1和L2在62摄氏度下各显示了100％的石蜡溶解。

7.D HIER L3在66摄氏度下显示了100％的石蜡溶解。

8.HIER L在79摄氏度下显示了完全的溶解。

9.Dako Flex红在68摄氏度下显示了完全的溶解。

10.55摄氏度下D HIER L1在溶液中存留了0.3582g石蜡(7％)。

11.55摄氏度下D HIER L2在溶液中存留了0.5580g石蜡(11％)。

12.55摄氏度下D HIER L3在溶液中存留了0.1627g石蜡(3％)。

13.55摄氏度下HIER L在溶液中存留了0.2528g石蜡(5％)。

14.55摄氏度下Dako红在溶液中存留了0.2786g石蜡(5％)。

15.55摄氏度和24摄氏度之间D HIER L1存留了0.2337g石蜡(5％)。

16.55摄氏度和24摄氏度之间D HIER L2存留了0.2570g石蜡(5％)。

17.55摄氏度和24摄氏度之间D HIER L3存留了0.1010g石蜡(2％)。

18.55摄氏度和24摄氏度之间HIER L存留了0g石蜡(0％)。

19.55摄氏度和24摄氏度之间Dako Flex红存留了0g石蜡(0％)。

最终观察：

上述结果显示了脱蜡缓冲液配方中所含THFA对石蜡的部分溶解行为产生 重要差异的定性和定量证据。

如果没有THFA，则脱蜡制剂、竞争制剂(Dako Envision Flex红)或常规 HIER缓冲液均无法溶解石蜡，即使在高温下也是如此。石蜡只会熔解并在水 相顶部形成一层澄清且无色的相。在任何温度下这些相均无法混合，即使是暂 时性的。

THFA使得熔化的石蜡能够在温和的温度(约52–62摄氏度)下溶解于缓 冲液中。混浊的溶液形成，且没有任何分离的相或层的痕迹。

相比于缺少THFA的脱蜡缓冲液或Dako缓冲液或对照HIER缓冲液，石 蜡可在较低温度下溶解于脱蜡溶液(含THFA)。

存留在含THFA的脱蜡L溶液中的石蜡质量多于不含THFA的脱蜡L(2.5 倍)。在该温度范围内，对照和竞争溶液(HIER L和Dako Flex红)中没有存 留任何石蜡，所有石蜡均在较高的55摄氏度下被过滤出来。

含THFA的脱蜡缓冲液在较高温度下(55摄氏度及以上)引起石蜡的部分 溶解并在24摄氏度和54摄氏度之间也保持了一些这类石蜡的部分溶解。直至 缓冲液到达室温后石蜡才会从溶液中完全析出。这与对照缓冲液(并非用于脱 石蜡的缓冲液)和竞争缓冲液(用于去除石蜡，但是通过水平玻片机制)不同。

实施例4–脱蜡缓冲液–替代性配方的测试

下文表7显示了几种替代性脱蜡缓冲液工作溶液的配方。

表7

测试实验方案-

除非另外说明，每种缓冲液配方中测试三(3)块玻片。缓冲液处理前，将 玻片在实验室烘箱中70℃孵育20分钟。为测试每种缓冲液，将玻片移出烘箱 并转移至充满预热至85℃的缓冲液的PT模块中。随后将PT模块加热至97℃ 并在该温度下孵育玻片20分钟，用于脱蜡和表位修复。脱蜡后，按照标准方 法处理玻片。

结果-

混合时配方1A形成乳白色溶液。未检测到配方1A的脱蜡行为。

配方1B–结果不足以确定该配方的有效性。

配方1C–对该配方测试了三块玻片。缓冲液对3块玻片中的2块很好地 完成了脱石蜡，在这2块脱石蜡良好的玻片上进行的IHC结果良好。

配方1D–对该配方测试了三块玻片。缓冲液对3块玻片中的2块很好地 完成了脱石蜡，在这2块脱石蜡良好的玻片上进行的IHC结果良好。

配方1E–对该配方测试了三块玻片。缓冲液对3块玻片很好地完成了脱 石蜡，但在PTM上HIER后损失了一些组织，损失肽段。

配方1F–对该配方测试了三块玻片。缓冲液对全部3块玻片都很好地完 成了脱石蜡，但在PTM上HIER后损失了一些组织，损失肽。

配方1G-1和1G-2–对每种配方均测试了三块玻片。缓冲液对每块玻片均 很好地完成了脱石蜡，没有组织损失，没有肽损失(斑点显示了良好的AR)， 完美的IHC结果。

配方1H–对该配方测试了三块玻片。缓冲液对3块玻片很好地完成了脱 石蜡，但存在一些组织损失和一些肽损失。

配方1I–对该配方测试了三块玻片。缓冲液对3块玻片很好地完成了脱石 蜡，没有组织损失，没有肽损失(斑点显示了良好的AR)，完美的IHC结果。

总结-

配方1A和1B表现不能接受的原因是，不同于产生一种具有能够部分溶解 石蜡的协同特性的水性溶液，配方1A和1B自身形成了悬浮液且缺乏任何溶解 石蜡的能力。

配方1C和1D显示了石蜡部分溶解以及IHC信号方面的一些进展，但结 果不稳定。一些玻片并未很好地脱石蜡化，而其他玻片似乎很好地脱石蜡化了。

配方1E、1F和1H过于剧烈。虽然其表现出了极佳的石蜡溶解性，但对于 组织切片的化学处理过于严苛。一些组织切片从玻片上掉落且一些肽缺失可以 证实这一点。通常这是不可接受的。

配方1G-1、1G-2和1I表现出优异的石蜡溶解性、优异的IHC信号和表现 的稳定性。这些配方的成功归因于me-THF或THFA这样的活性成分。对这些 配方继续进行了检验和确认("V&V")测试。在V&V测试中，不仅进一步展示 了配方1G和1I的性能和稳定性，还表明含有THFA和PEG200的配方是含有 me-THF的配方的改进，原因是含THFA缓冲液最小为零的气味。此外，THFA 的挥发性低于me-THF，这意味着在操作温度下该溶剂不易从缓冲液中蒸发且 随着时间的变化该缓冲液的表现更为稳定。也就是说，由于在脱蜡和HIER过 程期间缓冲液中THFA的量并未出现明显变化，所以缓冲液溶解石蜡的能力也 不随时间特别是一轮或多轮脱蜡和HIER期间出现明显下降。

本发明可体现在其他特定形式中，而不偏离其精神或基本特性。所述实施 方式在所有情况下均应视为仅是说明性的，而非限制性的。因此，本发明的范 围由所附权利要求书而不是前面的描述指明。在权利要求书的等价含义和范围 之内的所有变化形式都涵盖在其范围之内。