用于核酸检测的PCR和环介导的等温扩增的组合技术

摘要

本发明涉及用于检测样品中是否存在一种或多种靶核酸序列的方法和试剂盒，所述方法包括一系列的利用聚合酶链式反应预扩增所述样品的步骤，然后是一系列的包括对预扩增样品进行等温扩增的步骤，其中所述等温扩增包括包含一对正向引物和反向引物的引物对，所述正向引物具有与需要检测其存在与否的靶序列的第一部分基本上互补的3’部分和与所述靶序列的第二部分基本上同源的5’部分，所述反向引物包含与所述靶序列的第四部分基本上同源的3’部分和与所述靶序列的第三部分基本上互补的5’部分。

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测样品中是否存在一种或多种靶核酸序列的方法。另外，本发 明涉及适合于检测样品中是否存在一种或多种靶核酸序列的套件试剂盒。

背景技术

已经证明利用核酸扩增技术检测样品中是否存在特定核酸序列是有力的诊断工 具，具有许多应用。

聚合酶链式反应(PCR)的引入为对样品中存在的特定靶核酸序列进行快速特异性 扩增提供了可能。PCR技术由此为样品中核酸序列的检测提供重要的诊断工具，该 技术的引入开启了诊断应用的新领域。

如今聚合酶链式反应已为本领域技术人员公知。

但是，已经证明难以检测样品中是否存在低拷贝数的多重靶核酸序列。通过并行 单重PCR检测数种靶序列(每个都利用对病原体具有特异性的一个引物组)，由于起始 材料中的靶DNA的量有限，经常是不可行的。作为选择，由于不同引物组的扩增效 率的固有差异，在同一反应中利用多重引物组的多重PCR可能在检测灵敏性上受限。 此外，经证明PCR技术耗时并且在许多应用的实践中难以处理，这是因为要求热循 环的许多次重复循环(当进行PCR过程中的不同步骤时温度循环改变)。热循环的要求 还引起制造合适的检测装置方面的问题，所述检测装置中快速冷却和加热的要求给装 置制造者带来技术设计问题。为了提供更简单的装置，等温扩增技术会是更合适的。

为了规避该困难和其它困难，已经开发出许多用于核酸序列扩增的替代方法，例 如等温技术，如转录介导的扩增(TMA)或自持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增 (NASBA)、RNA的信号介导扩增技术(SMART)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、 DNA的环介导等温扩增(LAMP)、等温多重置换扩增(IMDA)、解旋酶依赖性扩增 (HDA)、单引物等温扩增(SPIA)和环解旋酶依赖性扩增(cHDA)。

但是在许多应用中，所调查的样品中仅存在非常低拷贝数的靶核酸序列。样品中 存在非常低拷贝数的核酸序列对于任何现有的核酸扩增技术构成挑战。

作为实例，败血症的早期检测对于罹患该疾病的患者可能是成功诊断和治疗的关 键因素。但是，即使在败血症的危及生命的情况下(如人的)血液中仅存在非常少量的 微生物细胞。因此，特别是对源自引起败血症的微生物的靶核酸序列进行检测对于分 子诊断工具提出巨大挑战。

类似地，在感染HIV的患者中检测不同的标志物给检测和诊断带来重大困难。

在许多诊断应用中，关键的是在尽可能最短的时间内提供诊断结果。例如，由于 败血症进展非常迅速，成功诊断败血症的关键因素是能够完成诊断的速度。

在败血症的诊断中，血液中极其低数量的细菌和相应的极其低数量的特定核酸标 志物序列经常给所用的核酸检测技术造成重大挑战。此外，在诊断例如败血症时需要 同时调查多种靶核酸序列的存在，这造成另一挑战，即样品必须进行能够扩增和检测 多种相互不同的靶核酸序列的技术。通常，需要同时扩增10种以上的序列。

已经证明环介导扩增对于核酸靶序列的扩增而言是快速、灵敏和高度特异性的技 术。但是，虽然已经证明环介导核酸扩增不能用于许多应用，即不具有令人满意的灵 敏性。此外，环介导扩增不能用于同时检测特定样品中的超过1种的靶核酸。

巢式PCR是公知的技术，其提供了检测样品中非常少量的靶核酸分子的方法。 引入该技术以克服常规PCR中缺少足够的灵敏性。巢式PCR由以下步骤组成：使用 旨在扩增包含靶序列和靶序列的上游序列和下游序列的核酸序列的引物对来对样品 中的靶核酸进行PCR扩增的第一步，然后对所述靶序列进行PCR扩增的第二步。由 此，取得了对靶核酸的高度灵敏性和特异性的检测。但是，已经证明巢式PCR是耗 时的，并且实践中在许多应用中难以处理。例如，由于需要多个引物对，因此已经显 示多重巢式PCR是困难的。

核酸序列多重检测的现有技术，如多重PCR，实践中难以用于超过3或4个靶 序列。此外，多重PCR通常在甚至更大程度上面临PCR的上述问题。此外，多重检 测经常要求每一靶序列以显著且近乎相等的量存在，以避免不同靶序列的不均匀扩 增。将起始试样分成划分以用于平行PCR的检验途径经常是不可行的，这是因为靶 DNA的量有限。在同一反应中使用多个引物组的多重PCR可以减少试样消耗，但是 在检测灵敏性上受限。

因此，使用多重PCR在如诊断败血症中检测数种靶序列已经证明是有问题的。

此外，理想的是在适合于在现场即时检测系统中使用的方法中避免PCR。这主 要是由于需要温度循环，其在多重设定中是有问题的。最重要的是，温度循环在检测 部分或所述方法中的步骤的检测序列方面是有问题的，因为由于存在气泡而引入测定 伪象(measurement artefact)和/或整个样品难以集中。

因此，非常期望适合于在现场即时测试中使用的方法，该方法能够同时从单个试 样中检测多种病原体，并且所述方法在最后的扩增步骤中不使用PCR。

因此，本领域需要检测样品中的靶核酸序列的更灵敏的分子技术。

因此，本领域还需要检测样品中的靶核酸序列的耗时较少的分子技术。

本领域还需要能够同时检测样品中的两种以上相互不同的靶核酸序列的分子技 术。

特别是本领域需要更灵敏的、耗时较少的并且允许检测样品中的两种以上相互不 同的靶核酸序列的分子技术。

本领域还需要更容易进行自动化操作的新型分子技术，即要求最小量的时间并且 其中最后的扩增和检测可以在同一操作下于同一反应器中在等温条件下进行。

在诊断涉及败血症的细菌领域，上述要求尤为显著。

因此，本发明的目的在于提供检测样品中是否存在靶核酸序列的简单高灵敏性方 法。

因此，本发明的另一目的在于提供检测样品中是否存在靶核酸序列的快速方法。

因此，本发明的另一目的在于提供检测样品中是否存在两种以上相互不同的靶核 酸序列的方法。

本发明的又一目的在于提供检测样品中是否存在两种以上相互不同的靶核酸序 列的方法，所述方法能够检测样品中是否存在非常少量的靶分子。

又一目的在于提供对涉及败血症诊断的两种以上靶分子序列进行扩增的方法。

本领域的又一目的在于提供更容易进行自动化操作的扩增技术，即要求最小量的 时间并且其中最后的扩增和检测可以在同一操作下于同一反应器中在等温条件下进 行。

发明内容

在产生本发明的实验期间，令人惊奇地发现本发明的上述目标可以通过将PCR 扩增技术和与环介导扩增相似的扩增技术组合到一种扩增方法中而实现。因此本发明 方法由下述步骤顺序组成：第一步骤顺序，其包括对靶核酸序列进行PCR预扩增， 然后是第二步骤顺序，其包括对预扩增的样品进行与环介导扩增相似的反应和等温检 测。

因此，本发明涉及一种新型扩增技术，本发明人将其命名为“isoPCR”。该技术最 简单的形式是两步法扩增技术，其中使用来自第一PCR步骤的靶序列来引发特异性 第二巢式等温扩增步骤，其中各个离散的靶序列在规定位置进一步扩增。

本发明在现场即时检测方法和装置中高度有用，这是因为该方法的最终扩增和检 测部分在等温条件下进行。

因此，在第一方面，本发明涉及用于检测样品中是否存在一种或多种靶核酸序列 的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供样品，

b.可选地从所述样品中提取核酸序列，由此提供核酸提取物样品，

c.为每一种或多种靶核酸序列提供核酸引物对，所述核酸引物对包含引物(a)和引 物(b)，所述引物(a)具有与需要检测其存在与否的靶序列的一部分或其(3’)下游 序列基本上互补的3’部分(a1)；所述引物(b)具有与需要检测其存在与否的靶序 列的一部分或其(5’)上游序列基本上同源的3’部分(b1)；所述核酸引物对(a)和 (b)适合用于对包含所述靶核酸序列的核酸序列进行聚合酶链式反应(PCR)介 导的扩增，

d.为每一种或多种靶核酸序列提供核酸引物对，所述核酸引物对包含引物(c)和引 物(d)，所述引物(c)具有与需要检测其存在与否的靶序列的第一部分基本上互 补的3’部分(c1)和与所述靶序列的第二部分基本上同源的5’部分(c2)，所述靶 核酸序列的所述第二部分位于所述靶序列的第一部分的(5’)上游；所述引物(d) 包含与需要检测其存在与否的靶序列的第四部分基本上同源的3’部分(d1)和 与所述靶序列的第三部分基本上互补的5’部分(d2)，所述第三部分位于所述第 二部分的(5’)上游，并且第四部分位于所述靶核酸序列的第三部分的(5’)上游， 所述核酸引物组(c)和(d)适合用于用于扩增所述靶核酸序列的环介导扩增反 应，

e.可选地，为每一种或多种靶核酸序列提供核酸引物e)和/或f)，所述引物e)具 有与所述靶序列的第五部分基本上同源的3’部分(e1)，所述第五部分位于所述 靶核酸序列的第一部分的(5’)上游和所述靶核酸序列的第二部分的(3’)下游，所 述引物f)具有与所述靶序列的第六部分基本上互补的3’部分(f1)，所述第六部 分位于所述靶核酸序列的第三部分的(5’)上游和所述靶核酸序列的第四部分的 (3’)下游，

f.使步骤a或b的样品在步骤c提供的一个或多个核酸引物对的存在下进行至少 一个循环的聚合酶链式反应(PCR)扩增，由此提供预扩增样品，其中所述样品 中的一个或多个所述靶核酸序列的量增加，

g.使用步骤d中提供的核酸引物对以及可选的步骤e中提供的一个或多个引物， 使步骤f的预扩增样品或其子样品进行环介导扩增反应，由此提供样品反应产 物，

h.使用常规技术在步骤g的样品反应产物中是否存在核酸扩增产物。

在具体实施方式中，本发明的方法是用于检测样品中是否存在两个以上相互不同 的靶核酸序列的方法，所述方法包括上述步骤a-h，并还包括另外的步骤，所述另外 的步骤将步骤f的预扩增样品分成2个以上的子样品，并使所述2个以上的子样品进 行步骤g和h的工艺。

该实施方式在现场即时检测方法和装置中高度有用，这是因为该方法的PCR部 分可以在单个区室(compartment)中作为多重反应进行，然后在多个区室(每个靶序列 一个区室)中进行最后的等温扩增。

定义

PCR

聚合酶链式反应(PCR)开发于1983年，是将一个或少量拷贝的一份DNA扩增数 个数量级的技术，产生了数以千计至数以百万计拷贝的特定DNA序列。该方法依赖 热循环，由DNA解链反应和DNA的酶促复制进行重复加热和冷却的循环组成。由 包含与靶区域互补的序列的短DNA片段组成的引物与单链靶序列退火，并使DNA 聚合酶引发DNA合成。随着PCR的进行，将产生的DNA自身用作复制模板，引发 DNA模板以指数扩增的链式反应。该技术对本领域技术人员而言是公知的。

LAMP

环介导扩增(LAMP)是由Notomi T等人开发的DNA扩增技术(Notomi等，2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research 28:E63)。使用 LAMP，利用两对或三对引物和除了具有复制活性还具有高链置换活性的聚合酶，将 靶核酸序列在60℃～65℃的恒定温度扩增。环介导等温扩增(LAMP)反应是具有高度 特异性、灵敏性的等温核酸扩增反应。LAMP使用四个关键引物的引物组，所述四个 关键引物称为正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向置换引物(F3)和反向置换引物 (B3)。使用这4种不同的引物来鉴定在靶基因上的6个独特区域，这很大地增加了特 异性。由于这些引物作用的特定性质，LAMP中产生的DNA的量显著高于基于PCR 的扩增。此外，可以引入有效促进反应的两个可选引物，将它们称为正向环引物(LF) 和反向环引物(LB)。内引物(FIP和BIP)含有靶DNA的正义链和反义链的序列，而置 换引物(F3和B3)以及环引物(LF和LB)各自含有单个靶序列。当在反应中包括环引物 (LF和LB)时总共识别8个靶序列。使用DNA聚合酶来扩增感兴趣的靶序列。可以 使用许多不同的DNA聚合酶，最常见的是Bst DNA聚合酶，而地芽孢杆菌(Geobacillus  sp.)大片段(GspSSD)DNA聚合物较不经常使用。

LAMP反应通过由内引物(FIP和BIP)引发的DNA合成启动。继之以由置换引物 (F3或B3)引发的DNA合成，其释放单链DNA。该单链DNA充当由与靶序列的另 一端杂交的第二内置换引物引发的DNA合成的模板。这产生了茎环DNA结构。在 随后的LAMP循环中，一个内引物与产物上的环杂交，并启动置换DNA合成。这产 生了最初的茎环DNA和具有两倍长度的茎的新茎环DNA。循环反应继续进行，在小 于1个小时内累积了约10⁹个靶标拷贝。一个或两个环引物(LF和/或LB)的引入通过 与茎环(除了被内引物杂交并且引发链置换DNA合成的环之外)杂交而促进了LAMP 反应。存在各种LAMP扩增检测方法。通过将混浊样品目视鉴定为阳性LAMP反应 中的焦磷酸镁沉淀，可以获得非特异性的靶标检测。为了使阳性反应具有更好的可视 性，可以向反应中添加诸如羟基萘酚蓝或钙黄绿素等各种试剂。作为选择，可以使用 诸如SYBR绿、Picogreen或碘化丙啶等DNA嵌入染料实现荧光检测，将所述DNA 嵌入染料加入反应试剂或在反应完成后添加以用于终点分析。

通过LAMP反应扩增特定的目的靶标可以使用各种基于杂交探针的方法实现。 例如，通过用荧光团标记环引物并添加DNA探针，该DNA探针与环引物互补但是 用猝灭分子标记。首先，环引物会结合该DNA探针，并且荧光团不发光。当LAMP 反应进行时，环引物被纳入茎环结构，DNA探针不能猝灭产生荧光信号的荧光团。 LAMP产物还可以容易地使用凝胶电泳鉴定，所述凝胶电泳根据所用的特定靶标和引 物使不同的条带图案可视化。该技术对本领域技术人员是公知的，并详细地描述于例 如Nagamine等,Molecular and Cellular Probes(2002)16,223-229。

LAMP型扩增反应

根据本发明，对PCR预扩增样品进行等温扩增的步骤(步骤g)称为LAMP型等温 扩增反应。在所有方面，该反应与典型的LAMP反应类似，不同之处在于仅需要一 对引物。这些所需引物对应于上述内引物FIP和BIP。在常规LAMP反应中必需的置 换引物(F3和B3)，在本发明的等温扩增中不具有任何功能。虽然本发明的第七步骤 的LAMP型扩增含有LAMP的一些要素，当与经典LAMP相比时其代表了简化和促 进。

根据本发明，“序列”是指至少5个核酸的DNA或RNA的寡核苷酸链。但是， 可以将诸如LNA或其它相似的类似物等替代性核苷酸类似物引入靶序列中和/或引入 引物序列中。

根据本发明，使用“互补”或短语“互补序列”来描述两个核酸序列之间的关系，两 个核酸序列中一个序列在合适的条件下(低于序列的解链温度)下与另一个序列退火， 从而使这两个序列共同形成两条链以不同的5’–3’方向取向的常规的双链DNA分子。 作为实例，序列5’AAGGTTCC3’与序列5’GGAACCTT3’互补。

根据本发明，使用“同源”或短语“同源序列”来描述两个核酸序列之间的关系，所 述两个核酸序列中，当两个序列以相同的5’–3’方向取向时一个序列具有与另一个序 列相同的序列。作为实例，序列5’AAGGTTCC3’与序列5’AAGGTTCC3’同源。

根据本发明，与“同源”或短语“同源序列”或词语“互补”或短语“互补序列”联用的 “基本上”用来描述序列中的至少80％的核苷酸分别互补/同源的情况。在优选的定义 中，与“同源”或短语“同源序列”或词语“互补”或短语“互补序列”联用的“基本上”用来 描述序列中的至少80％的核苷酸分别互补/同源的情况。在另一优选的定义中，包含 少于3个非互补性/非同源性核苷酸的序列是“基本上”互补/同源的。在更优选的定义 中，包含少于2个非互补性/非同源性核苷酸的序列是“基本上”互补/同源的。

根据本申请，“引物”是指包含至少5个核酸的寡核苷酸，其与靶序列中的或与靶 序列相邻的核酸的特定区域互补。引物必须能够通过DNA聚合酶引发DNA合成。

短语“核酸引物对”是指至少两个寡核苷酸，它们适合用于对相关的靶核酸序列进 行聚合酶介导的扩增。如果引物之一包含与靶核酸序列的一部分基本上互补的3’部 分，另一引物包含与靶核酸序列的一部分基本上同一的3’部分，则引物对适合用于对 相关的靶核酸序列进行聚合酶介导的扩增。

附图说明

图1显示本发明的L引物的引物设计。箭头显示引物延伸DNA合成的方向。第 一L引物(c)包含两部分：FIP 3’(c1部分)和FIP 5’(c2部分)。第二L引物(d)包含两部 分：BIP 3’(d1部分)和BIP 5’(d2部分)。虚线表示所述部分连接在一个引物序列中。 FIP 3’部分(c1)与靶序列的第一部分(存在于第二链上)互补，FIP 5’部分(c2)与靶序列的 第二部分(存在于第二链上)同源。另外，BIP 3’部分(d1)与靶序列的第四部分(存在于 第二链上)同源，BIP 5’部分(d2)与靶序列的第三部分(存在于第二链上)互补。

图2显示实施例2中所用引物的引物设计。箭头显示引物延伸DNA合成的方向。 第一L引物FIP(本发明的引物(c))包含两部分：FIP 3’(c1部分)和FIP 5’(c2部分)。第 二L引物BIP(本发明的引物(d))包含两部分：BIP 3’(d1部分)和BIP 5’(d2部分)。引 物LF和LB是本发明的可选引物(e)和(f)。引物F3和B3是对于常规等温环介导扩增 所必需的置换引物。引物POF和POB是实施例2中使用的用于PCR的外引物。

具体实施方式

令人惊奇地观察到将PCR扩增技术和环介导型等温扩增组合在一个检验中能够 满足本发明的目标。该新型的基于PCR/等温扩增的技术被称为“isoPCR”，并且其组 合了PCR和等温扩增的优点。

在其最广义的意义上，isoPCR技术是两步扩增技术，其中使用来自第一PCR步 骤的靶序列来启动第二巢氏等温扩增步骤。在第一步中，产生多重靶序列，每个靶序 列的产生都使用一个特异性引物组，所有反应在一个试管中发生。在第二步，将第一 步的反应产物，或将第一反应产物的小部分转移至数个单扩增区，其中对各个离散的 靶序列在规定位置在由第二引物对驱动的等温扩增步骤中进一步扩增。

由于使用靶向在靶核酸的(总共)4个区域的至少一个引物对(等温扩增步骤中使 用的引物对必须靶向4个区域)，isoPCR具有与巢氏PCR相当的特异性。通过在本发 明的PCR和等温步骤中使用不同的引物对，能够特异性增加。通过在本发明的PCR 和等温步骤中使用相似的引物对，可以使过程容易进行。

因此，在第一方面，本发明涉及用于检测样品中是否存在一种或多种靶核酸序列 的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供样品，

b.可选地从所述样品中提取核酸序列，由此提供核酸提取物样品，

c.为每一种或多种靶核酸序列提供核酸引物对，所述核酸引物对包含引 物(a)和引物(b)，所述引物(a)具有与需要检测其存在与否的靶序列的一部分或 其(3’)下游序列基本上互补的3’部分(a1)；所述引物(b)具有与需要检测其存在 与否的靶序列的一部分或其(5’)上游序列基本上同源的3’部分(b1)；所述核酸 引物对(a)和(b)适合用于对包含所述靶核酸序列的核酸序列进行聚合酶链式反 应(PCR)介导的扩增，

d.为每一种或多种靶核酸序列提供核酸引物对，所述核酸引物对包含引 物(c)和引物(d)，所述引物(c)具有与需要检测其存在与否的靶序列的第一部分 基本上互补的3’部分(c1)和与所述靶序列的第二部分基本上同源的5’部分 (c2)，所述靶核酸序列的所述第二部分位于所述靶序列的第一部分的(5’)上游； 所述引物(d)包含与需要检测其存在与否的靶序列的第四部分基本上同源的3’ 部分(d1)和与所述靶序列的第三部分基本上互补的5’部分(d2)，所述第三部分 位于所述第二部分的(5’)上游，并且第四部分位于所述靶核酸序列的第三部分 的(5’)上游，所述核酸引物组(c)和(d)适合用于用于扩增所述靶核酸序列的环介 导扩增反应，

e.可选地，为每一种或多种靶核酸序列提供一个或多个核酸引物e)和/ 或f)，所述引物e)具有与所述靶序列的第五部分基本上同源的3’部分(e1)，所 述第五部分位于所述靶核酸序列的第一部分的(5’)上游和所述靶核酸序列的第 二部分的(3’)下游，所述引物f)具有与所述靶序列的第六部分基本上互补的3’ 部分(f1)，所述第六部分位于所述靶核酸序列的第三部分的(5’)上游和所述靶核 酸序列的第四部分的(3’)下游，

f.使步骤a或b的样品在步骤c提供的一对或多对核酸引物的存在下进 行至少一个循环的聚合酶链式反应(PCR)扩增，由此提供预扩增样品，其中所 述样品中的所述一个或多个靶核酸序列的量增加，

g.使用步骤d中提供的核酸引物对以及可选的步骤e中提供的一个或多 个引物，使步骤f的预扩增样品或其子样品进行环介导扩增反应，由此提供样 品反应产物，

h.使用常规技术在步骤g的样品反应产物中是否存在核酸扩增产物。

步骤a

在所述方法的第一步(步骤a)中，提供样品。优选的是，所述样品是人类来源的 样品。在本发明的一个实施方式中，所述样品是血液样品。在本发明的另一实施方式 中，所述样品是尿样品。在本发明的另一实施方式中，所述样品是来自人的擦拭样品。

步骤b

在可选的第二步(步骤b)中，从所述样品中分离核酸，由此可以对本发明的核酸 序列更容易地进行扩增。核酸可以使用常规技术从样品中提取。这对本领域技术人员 是公知的，并且适合从样品中提取核酸的套件试剂盒是可商购的。但是，这类步骤通 常耗费时间，并且在特定实施方式方面，会优选替代性的更简单更快的步骤，所述步 骤仅除去大部分抑制物质。在一些实施方式中，核酸提取步骤不是必须的，因此不是 优选的。

步骤c

在所述方法的第三步(步骤c)中，提供一种或多种引物对(P-引物)，每对扩增一种 或多种靶核酸序列。每个引物对必须适合用于对相关靶序列进行聚合酶链式反应 (PCR)扩增。本领域技术人员熟悉此类引物对的常规设计。每个引物对必须含有正向 引物(a)，该正向引物(a)具有与检测其存在与否的靶序列的一部分或其(3’)下游序列基 本上互补的3’部分(a1)。此外，每个引物对必须含有反向引物(b)，该反向引物(b)具有 与检测其存在与否的靶序列的一部分或其(5’)上游序列基本上同源的3’部分(b1)。此 外，核酸引物对必须适合用于对包含靶核酸序列的核酸序列进行聚合酶链式反应 (PCR)介导的扩增。因此包括其第一部分、第二部分、第三部分和第四部分的靶序列 必须通过P-引物扩增。所以，正向引物(a)必须包含与靶序列的第一部分的一部分或 其(3’)下游序列互补的3’部分。类似地，反向引物(b)必须包含与靶序列的第四部分的 一部分或其(5’)上游序列同源的3’部分。另外，引物对的3’部分(a1)和(b1)应该设计成 靶向具有合适长度的序列并将其扩增。PCR扩增产物的合适长度优选为50～2000bp。

每个引物对的P-引物应该具有相似的Tm(解链温度)，优选在引物对内的P-引物 之间偏离小于10度。在多重设定中，相互不同的P-引物对应该类似地具有相似的 Tm(解链温度)，优选在相互不同的引物对内的引物之间偏离小于10度。优选的是， 步骤c中提供的P-引物或其3’部分(a1)和(b1)具有的Tm为40～80度。P-引物的(a1) 和(b1)部分中的每个的长度都应该为12～35个碱基对，优选15～30个碱基对，还更 优选15～25个碱基对。

提供的P-引物对优选相互不同，从而它们靶向样品中相互不同的核酸序列的预 扩增。

但是，在某些实施方式中，例如在其中仅靶序列之一(如果存在的话)以非常低的 拷贝数存在的情况下，仅需要或推荐将样品中的靶核酸序列之一预扩增。这在情况下 是相关的：例如其中一个靶序列是待检测的有机体中以高拷贝数质粒存在的序列，而 另一靶序列是待检测的有机体中仅以一个拷贝存在的序列。

因此，在本发明的一个实施方式中，在预扩增中使用的P-引物对靶向所有在随 后的等温扩增步骤中所靶向的核酸序列。在一个实施方式中，在预扩增步骤仅对样品 中的靶序列中的一个进行预扩增。

在进一步的实施方式中，在预扩增步骤中使用的一个或多个P-引物对能够扩增 数个相互不同的靶序列。此类实施方式的实例是预扩增保守性区域，例如编码核糖体 RNA的基因的保守性区域，由此单个引物对足以扩增数个相互不同的靶序列。在此 类实施方式中，利用一组预扩增引物在预扩增步骤中对样品中的数个靶序列进行预扩 增。

步骤d

在该方法的第四步(步骤d)中，对于靶核酸序列的每一种或多种提供核酸引物对 (L-引物)。优选的是每个引物对特别设计成仅对该方法的第三步中产生的预扩增靶序 列中的一个进行扩增。L-引物对的通用设计示于图1，其中第二链包含存在于双链分 子中的靶序列。L-引物对包括引物(c)，所述引物(c)具有与检测其存在与否的靶序列 的第一部分基本上互补的3’部分(c1)和与所述靶序列的第二部分基本上同源的5’部分 (c2)，所述靶核酸序列的第二部分位于所述靶序列的第一部分的(5’)上游。L-引物对还 包括引物(d)，所述引物(d)包含与检测其存在与否的靶序列的第四部分基本上同源的 3’部分(d1)和与所述靶序列的第三部分基本上互补的5’部分(d2)，所述第三部分位于 所述第二部分的(5’)上游，并且第四部分位于所述靶核酸序列的第三部分的(5’)上游。 所述核酸引物对(c)和(d)必须适合用于环介导扩增反应以将所述靶核酸序列扩增。这 意味着所述引物必须能够在合适的等温条件下在环介导等温反应中形成反应产物。

引物对中的每一种的L-引物的(c1)、(d1)、(c2)和(d2)的部分优选具有相似的Tm(解 链温度)，优选的是在每一对内的引物的部分之间偏离小于10度。

优选的是，步骤d中提供的引物的(c1)、(d1)、(c2)和(d2)的部分各自具有45～75 度的Tm，还更优选具有58～68度的Tm。

L-引物的(c1)、(d1)、(c2)和(d2)部分中的每个的长度都优选为12～35个碱基对， 优选15～30个碱基对，还更优选18～22个碱基对。

提供的L-引物对优选相互不同，从而它们靶向样品中相互不同的核酸序列的等 温扩增。

在一个实施方式中，L-引物和P-引物相同(参见实施例1)。

步骤e

在该方法的可选第五步(步骤e)中，为每一种或多种靶核酸序列提供一种或多种 引物e)和/或f)，优选引物对e)和f)。以下将这些称为O-引物。核酸O-引物e)具有与 所述靶序列的第五部分基本上同源的3’部分(e1)，所述第五部分位于所述靶核酸序列 的第一部分的(5’)上游和所述靶核酸序列的第二部分的(3’)下游。所述O-引物f)具有 与所述靶序列的第六部分基本上互补的3’部分(f1)，所述第六部分位于所述靶核酸序 列的第三部分的(5’)上游和所述靶核酸序列的第四部分的(3’)下游。

O-引物优选具有与引物对中的每一种的L-引物(c1)、(d1)、(c2)和(d2)的相应部分 相似的Tm(解链温度)，优选的是在每一对内的引物的部分之间偏离小于10度。

优选的是，步骤e中提供的O-引物(e)和(f)(d1)具有45～75度的Tm，还更优选 具有58～68度的Tm。

O-引物中的每个的长度都优选为12～35个碱基对，优选15～30个碱基对，还更 优选18～22个碱基对。

步骤f

在该方法的第六步(步骤f)(PCR预扩增步骤)中，使步骤a的样品或步骤b中提供 的其核酸提取物在步骤c提供的至少一个核酸引物对的存在下进行至少一个循环的 聚合酶链式反应(PCR)扩增。由此提供预扩增样品，其中所述样品中的两种以上的靶 核酸序列中的至少一种的量增加。PCR适合使用常规技术和反应成分以常规方法进 行。在优选的实施方式中，在进行利用子样品作为模板的该方法的第七步之前，将预 扩增样品分成两份以上样品。

优选的是，预扩增进行至少5个PCR循环，更优选至少9个PCR循环。优选的 是，预扩增进行小于25个PCR循环，更优选小于20个PCR循环。优选的是，该方 法的预扩增步骤包括10～19个PCR温度循环，还更优选10～15个PCR循环。

步骤g

在该方法的第七步(步骤g)中，使用步骤d中提供的核酸引物对以及可选的在步 骤e中提供的一个或多个引物，使步骤f的预扩增样品或其子样品进行等温环介导型 扩增反应，由此提供样品反应产物。同时使用的步骤e中提供的引物产生更快地扩增， 并且具有增加的灵敏性。但是，令人惊奇地显示步骤e中提供的O-引物对于进行所 述测试的性能不是必需的。省去O-引物，由此提供更简单的扩增系统和更简单的测 试设计的益处。该步骤中使用的DNA聚合酶必须是能够进行链置换的聚合酶。合适 的聚合酶可以是Bst DNA聚合酶或地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)大片段DNA聚合酶。 此外，第六步中的条件与常规环介导等温扩增方法中使用的条件相似。这些条件对本 领域技术人员而言是公知的。

步骤h

在该方法的第八步(步骤h)，检测在步骤g产生每一种或多种样品反应产物中是 否存在核酸扩增产物。这可以使用常规技术进行。

优选的是，第七和第八步作为一个步骤进行，其中随着第七步(步骤g)的扩增反 应的进行监视扩增产物(步骤h)。例如这可以通过监视与扩增反应的进展对应的焦磷 酸盐的释放而进行。焦磷酸盐的释放因沉淀而产生可见混浊，这允许通过肉眼容易地 可视化(特别是大反应体积尤其如此)，或者对于小体积通过简单的检测方法。因此， 优选的是，该反应通过测定混浊度或通过监视由(添加的)荧光染料的存在产生的信号 而以实时方式进行，所述荧光染料插入DNA中或直接标记DNA，进而可以与起始存 在的拷贝数关联。

此外，如果可以提供具有置换活性的热稳定聚合酶，此类聚合酶会提供在单一型 反应中进行步骤f和g(或f、g和h)的可能性。此类实施方式是高度期望的。

还令人惊奇地观察到，与基于PCR或巢式PCR的结果相比，本发明的方法从相 同的样品提供了更一致性的结果(结果之间具有更小的差异)。不受理论限制，该预料 不到的结果可能是由本发明的PCR和等温扩增的组合除去产生的气体和气泡的结 果。

另外的实施方式

与常规环介导扩增技术相反，令人惊奇地观察到本发明的扩增技术适合对样品中 以非常低拷贝数存在的多种靶标提供等温扩增。当使用PCR进行预扩增，然后将扩 增产物分成子样品，并随后将子样品用于接下来的扩增和检测步骤时，可以容易地实 现对两种以上靶标的检测。因此，在具体实施方式中，本发明的方法是用于检测样品 中是否存在两个以上相互不同的靶核酸序列的方法，所述方法包括上述步骤a-h，并 还包括另外的步骤：将步骤f的预扩增样品分成2个以上的子样品，并使所述2个以 上的子样品进行步骤7和8的工艺。

此外，令人惊奇地发现该方法能够比相应的巢式PCR方法快得多地提供结果。

此外，观察到本发明的扩增方法在检测涉及败血症的靶核酸序列时较优。

因此，在特定的实施方式中，本发明涉及用于检测样品中是否存在两种以上相互 不同的靶核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供样品，

b.可选地从所述样品中提取核酸序列，由此提供核酸提取物样品，

c.为两种以上的靶核酸序列中的每一种提供核酸引物对，所述引物对包含引物 (a)和引物(b)，所述引物(a)具有与检测其存在与否的靶序列的一部分或其(3’)下游序列 基本上互补的3’部分(a1)；所述引物(b)具有与其存在与否是待检测的靶序列的一部分 或其(5’)上游序列基本上同源的3’部分(b1)；所述核酸引物对适合用于对包含所述靶 核酸序列的核酸序列进行聚合酶链式反应(PCR)介导的扩增，

d.为两种以上的靶核酸序列中的每一种提供核酸引物对，所述核酸引物对包含 引物(c)和引物(d)，所述引物(c)具有与检测其存在与否的靶序列的第一部分基本上互 补的3’部分(c1)和与所述靶序列的第二部分基本上同源的5’部分(c2)，所述靶核酸序 列的第二部分位于所述靶序列的第一部分的(5’)上游，所述引物(d)包含与检测其存在 与否的靶序列的第四部分基本上同源的3’部分(d1)和与所述靶序列的第三部分基本 上互补的5’部分(d2)，所述第三部分位于所述第二部分的(5’)上游，并且第四部分位 于所述靶核酸序列的第三部分的(5’)上游，所述核酸引物组(c)和(d)适合用于环介导的 扩增反应以将所述靶核酸序列扩增，

e.可选地，为两种以上的靶核酸序列中的每一种提供核酸引物e)和/或f)，所述 引物e)具有与所述靶序列的第五部分基本上同源的3’部分(e1)，所述第五部分位于所 述第一部分的(5’)上游和所述靶核酸序列的第二部分的(3’)下游，所述引物f)具有与所 述靶序列的第六部分基本上互补的3’部分(f1)，所述第六部分位于所述第三部分的(5’) 上游和所述靶核酸序列的第四部分的(3’)下游，

f.使步骤a或b的样品在步骤c提供的两个以上核酸引物对的存在下进行至少 一个循环的聚合酶链式反应(PCR)扩增，由此提供预扩增样品，其中所述样品中的所 述一种或多种靶核酸序列的量增加，将该预扩增样品分成两个以上的子样品，

g.使步骤f的两个以上预扩增子样品中的每一个进行环介导扩增反应，每个反 应使用步骤d中提供的靶特异性核酸引物对中的一对以及可选的在步骤e中提供的一 个或多个相应的靶特异性引物，由此提供两个以上靶特异性样品反应产物，

h.使用常规技术检测在步骤g的每一样品反应产物中是否存在核酸扩增产物。

令人惊奇地观察到，本发明的方法可用于检测多种靶标存在与否。当使用产生可 检测量的扩增产物所需的扩增循环数时，例如常规的多重PCR在实践中因许多因素 而限于同时检测4-5种不同的靶标，与常规的多重PCR不同，本发明令人吃惊地不 受这方面限制。据推测这归因于在本发明的预扩增步骤中需要的PCR循环的量有限。

因此，在本发明的优选实施方式中，本发明涉及用于检测三种以上的核酸靶序列 的方法，例如四种以上，例如五种以上，例如六种以上，例如七种以上的核酸靶序列。 因此，本发明涉及用于检测3～40，例如4～40，例如5～40，例如6～40或例如4～ 25，例如5～20，例如5～15种相互不同的靶序列的方法。在这些实施方式中，对于 每个相互不同的靶序列，提供根据所述方法的第三步的适合对靶序列进行PCR扩增 的P-引物对，并且对于每个相互不同的靶序列，提供根据所述方法的第四步的适合 对靶序列进行环介导扩增的L-引物对。此外，可选的是，可以提供针对各个相互不 同的靶序列的O-引物。然后将这些引物对用于本发明的反应步骤f-h中。

在本发明的该实施方式中，所述方法的第三步提供的P-引物对不需要对单个靶 核酸序列具有特异性。例如，单个预扩增P-引物对可以扩增多个相互不同的靶序列。 例如，第三步提供的引物可以靶向扩增多个不同靶标的通用或保守区，例如核糖体靶 序列或其它感兴趣的保守区。

不过，所述方法的第四步提供的L-引物对优选对在步骤f中预扩增的单个靶核酸 序列具有特异性。

在本发明的优选实施方式中，靶序列的第一部分和第二部分由至少12个核酸碱 基分开。此外，在优选的实施方式中，靶序列的第三部分和第四部分由至少12个核 酸碱基分开。由此，在本发明方法的第七步期间产生的单链扩增产物中形成环，由此 反应以更快速率进行。当使用步骤e中提供的可选O-引物时这特别优选。这些引物 然后靶向位于靶序列的第一部分和第二部分之间的区域(第五部分)和/或位于靶序列 的第三部分和第四部分之间的区域(第六部分)。

在优选的实施方式中，所述靶核酸序列的第五部分不包含所述靶序列的第一部分 和第二部分，并且其中所述靶核酸序列的第六部分不包含所述靶核酸序列的第三部分 和第四部分。由此，可选的O-引物的作用较少地被双链DNA阻碍。

在另一优选实施方式中，靶核酸序列的第五部分包含靶序列的第一部分的一部分 和第二部分的一部分。在更优选的实施方式中，靶核酸序列的第六部分包含靶序列的 第三部分的一部分和第四部分的一部分。

在另一优选实施方式中，靶核酸序列的第五部分由靶序列的第一部分的一部分和 第二部分的一部分组成。在更优选的实施方式中，靶核酸序列的第六部分由靶序列的 第三部分的一部分和第四部分的一部分组成。

令人惊奇地显示，当PCR预扩增步骤中使用的P-引物包含与L-引物的3’部分相 同的序列(作为3’部分)或由与L-引物的3’部分相同的序列组成(作为3’部分)时，可以 进行本发明的isoPCR。由此，可以想到简单得多的引物设计，并且增加了可能扩增 的潜在靶序列的数量。作为实例，可以实现对较短DNA序列的检测。最小的LAMP 检测序列至少通过对于常规LAMP必须的F3和B3引物的长度(即约40个核苷酸)而 缩短。

因此，在本发明的优选实施方式中，步骤c中提供的核酸引物a)包含与步骤d中 提供的核酸引物c)的3’部分(c1)基本上同一的3’部分。类似地，在本发明的优选实施 方式中，步骤c中提供的核酸引物b)包含与步骤d中提供的核酸引物d)的3’部分(d1) 基本上同一的3’部分。在不背离该实施方式的情况下，对于特定目的，引物(a)和(b) 可以含有其它5’序列。

但是，在本发明的更优选实施方式中，步骤c中提供的核酸引物(a)与步骤d中提 供的核酸引物c)的3’部分(c1)基本上同一。类似地，在本发明的优选实施方式中，步 骤c中提供的核酸引物b)与步骤d中提供的核酸引物d)的3’部分(d1)基本上同一。

在本发明的更优选实施方式中，步骤c中提供的核酸引物a)与步骤d中提供的核 酸引物c)基本上同一。类似地，在本发明的优选实施方式中，步骤c中提供的核酸引 物b)与步骤d中提供的核酸引物d)基本上同一。

在本发明的更优选实施方式中，步骤c中提供的核酸引物a)与步骤d中提供的核 酸引物c)相同。类似地，在本发明的优选实施方式中，步骤c中提供的核酸引物b) 与步骤d中提供的核酸引物d)相同。如实施例(实施例X)中所示，该实施方式令人吃 惊地能够在isoPCR方法中提供扩增产物，由此为更容易的检测设计铺平道路，所述 更容易的检测设计中对于每个靶序列仅需要一个引物对来提供扩增产物。由此，本发 明的isoPCR扩增反应可以对每个靶序列仅使用一个引物对而进行。因此，在本发明 的一个高度优选的实施方式中，在检验中使用的唯一引物是L-引物，其也用于预扩 增PCR步骤。

如实施例中所看出的，使用另外的引物(O-引物)e)和f)提供了更快的等温反应。 因此，在本发明的优选实施方式中，进行可选步骤e，并且将提供的O-引物用于步骤 g的反应中。

在优选实施方式中，步骤d中提供的L-引物c)和/或d)包含在3’和5’部分之间的 中心连接序列，所述中心连接序列优选由至少4个核苷酸组成，其中所述中心连接序 列不与所述靶序列互补或同源。

诊断检验

从临床前景来看，能够从单个试样同时检测多个病原体的现场即时检测(POC)测 试是高度期望的。测试设计策略包括所有临床相关病原体的综合鉴定，所述临床相关 病原体可以根据局部流行学和其它临床因素容易地适应性改变。

将起始试样分成平行的单重PCR、每个PCR使用对病原体具有特异性的单组引 物的检验途径由于靶DNA的量有限经常是不可行的。除了灵敏性的挑战之外，微流 体系统中的PCR射流技术仍在早期开发阶段。作为选择，在同一反应中利用多个引 物组的多重PCR可以减少试样和试剂消耗，但由于不同引物组的扩增效率的固有差 异，在检测灵敏性上受限。

作为实例，由于人血液样品中核酸的丰度非常低，败血症的诊断是复杂的(包括 数个可能的靶序列)和成问题的。因此，本发明高度适合于该检验。在本发明的高度 优选实施方式中，一种或多种靶核酸序列源自败血症涉及的微生物。

在优选实施方式中，靶序列源自一种或多种微生物，所述微生物选自铜绿假单胞 菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色念珠菌 (Candida albicans)和光滑念珠菌(Candida glabrata)。

isoPCR法还可以用于其它常规检验中并具有较优的结果，例如用于在拭子或尿 试样中检测沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)的质粒DNA和淋病奈瑟菌 (Neisseria gonorrhoeae，NG)的基因组DNA的检验。该检验靶向位于CT质粒上的两 个区域，以检测野生型CT株(wtCT)和Swedish CT株，Swedish CT株为新型变体CT 株(nvCT)。此外，在NG的opa基因中靶向单个保守区。最后，向样品制品添加内部 对照，由此在每轮检验中靶向总共四个区域。

靶序列或序列还可以是cDNA。此类靶序列可以通过对RNA进行逆转录来提供。 使用本发明的isoPCR法来检测人外周血中一个或多个特定人RNA分子的表达水平， 需要逆转录步骤来将所述RNA分子翻译成单链cDNA分子，然后应用isoPCR法。 将RNA逆转录的方法是本领域技术人员公知的。由此，isoPCR法可以用于常规的人 检验中并具有较优的结果，例如，在如人外周血中的基因表达检验(在转录水平测试 特定基因)。基因表达检验测定了已知参与特定疾病的发展和进展的特定mRNA分子 的活性，由此提供关于人疾病的当前状态的信息。此类疾病的实例是动脉粥样硬化和 心血管疾病。

此类诊断检验优选提供为旨在现场即时检测应用的套件试剂盒。

因此，本发明还涉及套件试剂盒，所述套件试剂盒包含以上实施方式中定义的核 酸引物a)、b)以及c)和d)中的一组或多组。

这些试剂盒的优选实施方式包含引物a)、b)以及c)和d)中的两组以上。

实施例

实施例1

实施例1的目的在于调查对来自光滑念珠菌有机体的靶序列进行PCR预扩增是 否可以使用常规用于对相同的靶序列进行LAMP扩增的引物中的一些进行。此外， 目的在于调查对所述PCR预扩增样品是否能够进一步利用类似LAMP的程序和使用 相同的引物进行扩增。

对包含来自100个拷贝的光滑念珠菌的纯化DNA的样品(利用常规技术产生)以 及不具有模板靶序列的对照样品(NTC＝无模板对照(H2O))进行检验。

设计和产生常规用于对靶光滑念珠菌序列进行LAMP扩增的引物对。FIP引物具 有序列(5’–3’)CTGCATTCCCAAACAACTCGACTCATGGAGGGTGAGAATCCCG， BIP引物具有序列 TACAGGCGAGAGACCGATAGCGTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTC。这些引物对应 于本发明方法中的引物(c)和(d)。然后将引物FIP和BIP均用于本发明的PCR步骤中 和用于类似LAMP的步骤中。

如下进行利用FIP和BIP作为引物的PCR反应。PCR试剂混合物(20μL)由下述 物质组成：2μL来自光滑念珠菌的纯化DNA或用于无模板对照的H2O；10μl的 2x Mastermix TrueHOT(VWR)；分别为0.4μM的FIP和BIP引物。使用热循环仪， 使PCR试剂混合物在95℃进行15分钟的起始热启动，然后12个热循环，热循环为 在95下30秒，在60℃下30秒，在72℃下45秒，并且在72℃进行5分钟的最终延 伸。

在将产物电泳后，在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上未观察到PCR产物。

随后使用等温环介导扩增类型的反应仅利用引物FIP和BIP对PCR反应产物进 行扩增。使用实时荧光测定进行检测。扩增反应混合物(25μL)由下述物质组成：15μL 的Isothermal Mastermix(Optigene)；2μL的第一阶段PCR扩增产物和各自为1.6μM 的FIP和BIP。利用Genie II装置(Optigene)在63℃进行反应60分钟。该装置实时通 过荧光信号测定进展。通过相关软件确定检测时间。

作为对照，对于作为模板的纯化DNA进行等温反应(无预扩增)，该模板与上述 两步PCR/LAMP检测中使用的模板相同。

结果

令人惊奇的是，在PCR/LAMP检验中迅速出现反应产物，而在对照样品中不能 观察到反应产物。这些结果证明来自利用FIP和BIP引物的PCR的预扩增产物可以 用作LAMP-类反应中的模板，所述LAMP-类反应中省去了普通LAMP中常规且必须 使用的F3和B3(置换引物)。

实施例2

实施例2的目的在于将常规技术qPCR、巢式PCR和LAMP的检出限(LOD)和检 出时间与本发明的PCR/LAMP组合检验的不同实施方式进行比较。

从光滑念珠菌的稀释液系列中纯化的DNA含有10,000～10个细胞(拷贝数)/模板 样品，其使用常规技术产生。对这些模板样品以及无模板靶序列的对照样品(NTC＝ 无模板对照(H2O)进行检验。

靶向来自光滑念珠菌的模板序列的引物如下(5’～3’)：

FIP:CTGCATTCCCAAACAACTCGACTCATGGAGGGTGAGAATCCCG

BIP:TACAGGCGAGAGACCGATAGCGTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTC

FIP3’:TCATGGAGGGTGAGAATCCCG

BIP3’:TTTCACTCTCTTTTCAAAGTTC

LF:CAAAGAACTGACACCCTCGC

LB:CAAGTACAGTGATGGAAAGATG

F3:GGAGAGTACCACTTTGGGACTG

B3:CCTTCCCTTTCAACAATTTCAC

PCR外正向引物(POF):TAGGGTTACCCGCTGAACTT

PCR外反向引物(POB):GCGCAAAACACCATGTCTGA。

图2显示在所述检验中所用引物的位置。

按照如下单步或两步检验对模板样品进行检验：

括号表示给定反应中包括的引物及其浓度。

常规单步

qPCR(0.4μM F3；0.4μM B3)

LAMP(1.6μM FIP；1.6μM BIP；0.8μM LF；0.8μM LB；0.2μM F3；0.2μM B3)

对照单步

LAMP(1.6μM FIP；1.6μM BIP)

常规两步

PCR外引物(0.4μM POF；0.4μM POB)，然后进行qPCR(0.4μM F3；0.4μM B3)

本发明的两步

PCR外引物(0.4μM POF；0.4μM POB)，然后LAMP(1.6μM FIP；1.6μM BIP；0.8 μM LF；0.8μM LB；0.2μM F3；0.2μM B3)

PCR F3/B3(0.4μM F3；0.4μM B3)，然后LAMP(1.6μM FIP；1.6μM BIP；0.8μM  LF；0.8μM LB；0.2μM F3；0.2μM B3)

PCR FIP/BIP(0.4μM FIP；0.4μM BIP)，然后LAMP(1.6μM FIP；1.6μM BIP)

PCR FIP/BIP(0.4μM FIP；0.4μM BIP)，然后LAMP(1.6μM FIP；1.6μM BIP；0.8 μM LF；0.8μM LB)

PCR FIP3’/BIP3’(0.4μM FIP3’,0.4μM BIP3’)，然后LAMP(1.6μM FIP,1.6μM  BIP,0.8μM LF,0.8μM LB)

使用Brilliant III Ultra fastGREEN QPCR master mix(Agilent  Technologies)根据制造商说明书进行qPCR反应，包括在以上列出的引物、2μL来自 光滑念珠菌的纯化DNA、或用于NTC的水。使用热循环仪(Applied Biosystems的7500 快速实时PCR仪)，使qPCR试剂混合物进行95℃下的起始3分钟，然后40个热循 环，热循环为95℃下5秒，60℃下20秒。该装置实时以荧光信号测定进展，并且相 关软件计算C_T值，C_T值对应于在哪个循环能够检测出PCR产物。通过考虑热启动 时间、热循环时间和加热及冷却时间将C_T值转化成检出时间。

PCR反应、PCR外引物、PCR F3/B3和PCR FIP/BIP以及PCR FIP3’/BIP5’如下 进行。PCR试剂混合物(20μL)由下述物质组成：2μL来自光滑念珠菌的纯化DNA或 用于无模板对照的H2O；10μl的2x Mastermix TrueHOT(VWR)；以上列出的引物。 使用热循环仪，使PCR试剂混合物进行95℃下15分钟的起始热启动，然后12或15 个如表1和表2中规定的热循环，热循环为在95下30秒，在60℃下30秒，在72 ℃下45秒，并且在72℃进行5分钟的最终延伸。

LAMP反应如下进行：LAMP反应混合物(25μL)由下述物质组成：15μL的 Isothermal Mastermix(Optigene)；2μL的来自光滑念珠菌的DNA或第一阶段PCR扩 增产物或用于无模板对照的H2O；和以上列出的引物。利用来自Optigene的Genie II 装置在63℃进行反应70分钟。该装置以荧光信号实时测定进展。通过相关软件确定 检出时间。

结果

结果示于表1和2中。

表1

表1.对于由不同数量的光滑念珠菌(100,000～10)的样品纯化的DNA模板进行的 反应显示出检出时间。该值仅表示检出时间，而不是预扩增时间。横线(-)表示在检测 反应中没有出现扩增，即阴性检测。时间以小时：分钟：秒显示。

表2

表2.对于表1中给出的检出限(LOD)示出检验的总时间。N/A＝不适用。不包括 上机时间(Hands on time)。时间以小时：分钟：秒显示。

结果显示如下：

-在单步检验中，qPCR比LAMP更灵敏。qPCR的LOD为10，LAMP的LOD 为1000。在两步检验中，根据本发明使用PCR预扩增然后进行LAMP，LOD从1,000 增加至10，即与qPCR相当。

-当根据本发明在第一步中使用利用外引物的PCR预扩增(01:00:18)、利用 F3/B3引物的PCR预扩增(01:00:49)或使用利用FIP/BIP引物的PCR预扩增(00:58:43) 时，LOD和检出时间非常相似。

-根据本发明的PCR/LAMP方法(PCR外引物，PCR F3/B3或PCR FIP/BIP，然 后进行LAMP)显示了与巢式PCR(PCR外引物+qPCR)相同的LOD，但是快9分钟至 11分钟检出(01:09:50，对比于01:00:18/01:00:49/00:58:43)。

-利用12个循环的PCR预扩增与15个循环的PCR预扩增可以解释对于PCR  FIP/BIP+LAMP(FIP,BIP,LF,LB)样品与PCR外引物或PCR F3/B3继之以LAMP (FIP,BIP,LF,LB,F3,B3)相比所观察到的稍微更长的检出时间。

-在根据本发明的组合PCR/LAMP中，环引物(LF和LB)改善了LOD并加速了 检出时间。使用FIP/BIP的LAMP能检测100个拷贝，检出时间为00:42:39。使用 FIP/BIP/LF/LB的LAMP能检测10个拷贝，检出时间为00:17:43。

-对于PCR预扩增使用FIP3’/BIP3’引物组与FIP/BIP引物组相比，产生更高的 LOD(1,000相比于10)和较慢的检出时间。

实施例3

实施例3的目的在于调查：使用本发明的PCR预扩增和LAMP扩增和检测的组 合是否可以对败血症通常涉及的5种代表性生物的低拷贝数的靶序列进行等温检测。 所述生物包括革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和酵母菌。此外，包括MRSA抗性 标记。

所检测的生物和具体菌株示于表3。

表3

生物 类型 菌株 铜绿假单胞菌 革兰氏阴性 DSM 50071 金黄色葡萄球菌(MSSA) 革兰氏阳性 DSM 6148 金黄色葡萄球菌(MRSA) 革兰氏阳性 ATCC BAA-42 白色念珠菌 酵母菌 DSM 6569 光滑念珠菌 酵母菌 DSM 11226

表3.研究中包括的败血症相关生物

细胞的制备

培养

对于各生物(菌株)，准备具有10mL的Tryptone Soya Broth(TSB)和0.5mL的悬 浮菌株(自-80℃)的Falcon管。使管在37℃温育24小时±2小时。

检查生长

使用DAPI显微术检查所有菌株的细胞密度。DAPI显微术将已知体积的细胞悬 浮液施加至过滤器，该过滤器用DAPI进行荧光染色。该方法将来自活细胞和死细胞 的双链DNA染色，由此可用于确定在细胞悬浮液中存在的细胞总数。

稀释系列

对于各个具有已确定细胞密度的管，使用Peptone Salt Solution(SPO)作为稀释介 质由108～101细胞/mL制备稀释液系列。对于各生物，对109/108、107和104个 细胞/mL进行DNA的培养、提取和DAPI显微检查。

集落形成单元

从各细胞悬浮液转移2x 1mL至陪替皿。向各细菌菌株添加Tryptone Soya Agar (TSA)(15mL～20mL)，向各酵母菌菌株添加Yeast Extract Agar(深度接种)(15mL～ 20mL)。使平板在37℃温育24小时±2小时，确定集落形成单元。

DNA提取和纯化

对5mL的来自108～101个细胞/mL的各稀释液的细胞悬浮液进行DNA提取。 将细胞悬浮液进行珠破碎(bead beat)，随后通过在离液盐的存在下使DNA结合至二 氧化硅而进行纯化。在100μL洗脱缓冲液中进行洗脱，并在-20℃贮存，直至进一步 处理。

预扩增(PCR)

使用PCR反应如下进行预扩增：PCR试剂混合物(20μL)由下述物质组成：2μL 的对应于100,000、10,000、1,000、100、10个细胞的来自DNA洗脱液的纯化DNA 或用于无模板对照的H2O、10μl的2x Mastermix TrueHOT(VWR)和0.4μM的PCR 外正向(POF)引物或PCR外反向(POC)引物，分别如表4中所列出。对于扩增来自单 特异性生物的靶序列，使用仅一组POF和POB引物单重地进行反应，或者对于同时 扩增所有的生物，使用包括的POF和POB引物多重地进行反应。使PCR试剂混合 物进行热循环，具有95℃下15分钟的起始热启动，然后是15个热循环，热循环为 95℃下30秒、60℃下30秒和72℃下45秒。在72℃进行最终延伸5分钟。预扩增的 总时间包括热启动和最终延伸，为46分钟15秒。

检测(LAMP)

LAMP反应在来自Optigene的具有实时荧光检测的Genie II装置上运行。LAMP 反应如下进行(25μL每个反应)；15μL的Isothermal mastermix(Optigene)；2μL的纯 化DNA或PCR预扩增产物或者用于无模板对照(NTC)的H2O，以及用于检测特定靶 标的引物，1,6μM FIP；1,6μM BIP；0,8μM LF；0,8μM LB；0,2μM F3；0,2μM B3，对 于引物序列参见表4。反应在63℃运行60分钟。

表4

表4.用于检测特定靶标的引物列表。序列字母K表示G或T。如果引物序列已 经公开，则示出参考文献；或者如果它们通过设计获得，则显示空白；Goto 2010＝Goto, M.等,J.Microbiol.Methods,2010,81,247-52；Hanaki 2011＝Hanaki,K.-I.等,J. Microbiol.Methods,2011,84,251-254；Inacio 2008＝Inácio,J.等,J.Clin.Microbiol., 2008,46,713-720。

检出限

使用荧光LAMP反应来检测在纯化DNA样品中或在预扩增产物上特定生物 DNA的存在。表5显示在所述检验中进行预扩增的影响，其通过对来自光滑念珠菌 的纯化DNA上和对相同DNA的预扩增产物进行检出限(LOD)实验显示。当使用预扩 增时，LOD降低超过100倍，至10个光滑念珠菌。

表5

表5.使用或不适用PCR预扩增的靶向光滑念珠菌的LAMP的检出限(LOD)的说 明。示出相对于荧光的时间(小时：分钟：秒)。

对于各靶标及其相应的稀释液系列进行类似的试验，将其总结于表6中。表6 显示为了获得<1000个拷贝的LOD需要PCR预扩增。使用预扩增，对于5种测试生 物中的4种观察到10的LOD，对于第5种观察到为100的LOD。

表6

表6.LAMP反应中的检出限(LOD)和检出时间(时间)，以小时：分钟：秒表示。 预扩增时间为46分钟15秒，不包括在检出时间之内。LOD<10表示成功地检测具 有最低测试拷贝数(10)的样品。

检测多种生物

已知在临床样品中出现多种生物的存在。在这方面，调查了所述检验是否能够检 测和区分样品中多于1种生物的存在。这通过使用多重预扩增来实现，所述预扩增使 用所有5个引物组，对来自不同生物的所收集DNA洗脱液进行。将该多重预扩增产 物分成子样品，每个子样品进行LAMP扩增，所述LAMP扩增靶向不同的靶序列， 具有同时的实时检测。

表7显示通过使用多重LAMP反应对来自一种或多种生物的DNA同时进行检 测。在该研究中包括来自人血液样品的纯化DNA，以阐释复杂DNA来源对检出时间 的影响。

表7

表7.多种靶标的同时检测。对于以一种或多种生物的DNA(1,000个拷贝)洗脱液 进行的多重PCR预扩增的产物，进行LAMP检测。人：来自人全血样品的纯化DNA。 (+)表示阳性检测，标出有检出时间(分钟：秒)。(-)表示阴性检测。

结论

通过使用DNA提取和纯化、预扩增和荧光LAMP检测，已经显示了对5种败血 症相关生物的检测。该结果显示，当使用预扩增时在所有情况下检出限均降低了至少 100倍。使用预扩增，结果显示对于5种生物中的4种检出限<10个拷贝，对于第5 种生物检出限为100个拷贝。该检验显示了可对多种生物同时进行正确检测。此外， 对于MRSA呈阳性或阴性的样品总是被正确地验出。

结果证明了可以在包含复杂的DNA混合物的样品中对以非常低拷贝数存在的靶 序列进行多重检测。利用预扩增，该样品可以被分成多个检测室或管而不会损失灵敏性。

实施例4

使用RT-isoPCR来同时多重检测24个靶标，即CAD中涉及的23个mRNA靶标 和一个阳性对照。使用QIAamp RNA血液迷你试剂盒根据制造商说明从全血中纯化 RNA。样品大小对应于22.5uL的全血。

材料和方法

使用LAMP设计者程序涉及用于靶向表8中列出的23个基因的引物。基于来自 Elashoff等(“Development of a blood-based gene expression algorithm for assessment of  obstructive coronary artery disease in non-diabetic patients”,BMC Medical Genomics 2011,4:26)的数据选择相关基因。该程序针对每个靶标设计FIP、BIP、LF、LB引物。 包括HuPO基因作为阳性对照，因为其在全血中高度一致性地表达。

表8：引物序列

使25x 1.5μl RNA样品进行RT-PCR。用于24个靶基因中的每一个进行一个反 应，并进行一个多重RT-反应。进行RT-PCR，在单重反应中每个靶标使用一个引物 组FIP和BIP，在多重反应中使用包含所有24个引物组的引物组集合。

RT-PCR步骤

对于RT-PCR使用Agilent AffinityScript One-Step RT-PCR试剂盒。

20或50uL的RT-PCR反应体积含有：

-50％Hercules II RT-PCR 2x Master Mix

-引物(终浓度，FIP:0,4uM；BIP:0,4uM)

-1,5uL样品RNA(1ng～100ng)

-1％AffinityScript RT/Rnase block

-H2O

温度:

-45度5分钟

-95度1分钟

-8个热循环，其为

o 95度20秒

o 60度20秒

o 72度30秒

-72度3分钟

所有25个反应在RT-PCR中通过8个循环同时扩增。将来自多重RT-反应的反应 产物分成24个子样品。

随后将多重样品RT-PCR反应产物分成24个子样品。

对于1μl RT-反应产物(或其子样品)使用Optigene Isothermal Mastermix试剂盒进 行等温扩增。

10uL反应体积含有：

-6uL等温mastermix

-1uL引物(终浓度：1,6uM FIP；1,6uM BIP；0,8uM LF；0,8uM LB)

-1uL PCR产物或NTC

-2uL H2O

每个靶标使用一个引物组(FIP、BIP、LF和LB)进行等温扩增。

(等温反应的)检出时间示于表9。

表9：isoPCR、单重和各种靶向24个基因的多重反应的检出时间

在等温扩增后立即对所有样品进行解链温度分析。确认了多重反应构建中所检测 靶标的正确身份。

如对所有24个靶标所预期的，当以多重反应进行isoPCR时与单重反应相比，检 出时间稍微增加。

但是，证明了在单个多重isoPCR步骤中在小于1小时内其可以在1.5μl RNA样 品(源自22.5μl血液样品)中正确地鉴定存在24个靶RNA序列。