一种硅藻提取物抗菌材料的安全性能评价方法

摘要

本发明提供了一种硅藻提取物抗菌材料的安全性能评价方法，由皮肤变态反应试验、一次皮肤刺激试验、多次皮肤刺激试验、急性眼刺激试验四部分试验组成。该方法具有简便易行、重复性好、试验结果真实可靠等特点，填补了过去无法检测硅藻提取物抗菌材料安全性能的空白，为监控硅藻提取物及其衍生产品对人体安全性提供了有效手段，使用范围广泛，可用于各类检验医学实验室、科研院所实验室、企业研发部门、质量控制部门、社会公共检测机构，适用于各种硅藻提取物抗菌材料的安全性能评价和鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及硅藻提取物抗菌材料的安全性能评价方法，属于材料成分的性能评价领 域。

背景技术

长期以来，有害微生物对人们的生产和生活造成巨大的危害，SARS病毒的肆虐， 超级细菌的出现都使人们对环境的恶化给人类健康带来的危险表示担忧，因而世界各国 对抗菌剂的研究更加重视，抗菌材料在世界范围内已成为一个新兴的产业。随着科学技 术的进步，抗菌材料方面也取得了较快的发展，出现了很多结构不同、功能全面的新型 抗菌材料。这类材料不仅可以减少感染致病菌的可能性，还能促进皮肤快速愈合，减少 瘢痕增生。依据抗菌材料的材质,将其分成传统类材料、天然类材料、合成类材料、药用 性材料和组织工程类材料。天然硅藻提取物抗菌材料具备了天然无机硅藻泥所有优点， 又有天然有机高分子聚合物的无色、无嗅、对皮肤无刺激性、无毒性、无腐蚀性的特性； 并且硅藻提取物抗菌材料与皮肤有良好的生物相容性，不会引起过敏变态反应，是天然 的安全的环保高效型双机抗菌材料。因为抗菌材料的种种优势，市场上各类以硅藻提取 物为名目的抗菌材料也不断出现，卫生检验部门需要全力监督和配合检测，对硅藻提取 物产品本身的性能进行客观地评价，为产品质量把关，使消费者使用安全放心，因此， 急需一种能够对硅藻提取物抗菌材料安全性能指标进行评价的方法，以便于检验部门的 检测工作，也便于区分安全高效的硅藻提取物抗菌材料与普通无硅藻提取物胶质材料的 差别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硅藻提取物抗菌材料安全性能指标评价方法，为了便于 检验部门的检测工作，也便于区分安全高效的硅藻提取物抗菌材料与普通无硅藻提取物 胶质材料的差别。

本发明采用的技术方案如下：

一种硅藻提取物的安全性能评价方法，其特征在于包括皮肤变态反应试验、一次皮 肤刺激试验、多次皮肤刺激试验和急性眼刺激试验步骤。

其中，所述皮肤变态反应试验,用于检测配伍的各硅藻提取物(即受试物)重复接触 后，实验动物产生皮肤变态反应的可能性及其强度；将动物随机分入受试动物组与阴性 对照组，每组16只；每次涂皮前24h背部去毛备皮3cm×3cm；致敏接触：取0.5ml受 试物滴在2cm×2cm的二层纱布上，并敷贴于受试物组左侧去毛区，以一层油纸覆盖， 并用胶布封闭固定6h，第7d、第14d以同样方法重复1次；激发接触：末次致敏后14d， 受试物组与阴性对照组脊柱右侧去毛备皮3cm×3cm，次日取0.5ml受试物筒致敏接触 方法敷贴在备皮去，一层油纸覆盖，胶布封闭固定6h，6h后将敷贴的受试物洗去，激 发接触后24h和48h皮肤反应；阳性对照物为2,4-二硝基苄，丙酮：麻油以1:1v/v溶液 作为溶剂，诱导浓度和激发浓度分别为2.5％(w/v)、1.0％(w/v)步骤同试验组；

所述一次皮肤刺激试验，用于检测配伍的各硅藻提取物(即受试物)对实验动物皮 肤的刺激/腐蚀作用和强度，动物试验前24h脊柱两侧剪毛备皮各约3cm×3cm，次日取 受试物0.5ml，滴于面积为2.5cm×2.5cm的2层纱布上，并敷贴在一侧去毛完整皮肤上， 用1层油纸覆盖，然后以无刺激胶布固定，另一侧不处理作空白对照，敷用4h后以温 水洗去残余受试物，于1、24、48h后观察并记录皮肤反应；

所述多次完整皮肤刺激试验，用于进一步检测配伍的各硅藻提取物(即受试物) 对实验动物皮肤的刺激/腐蚀作用和强度，动物试验前24h脊柱两侧剪毛备皮各约3cm ×3cm，次日取受试物0.5ml，涂抹在一侧去毛皮肤上，另一侧涂蒸馏水作为对照，涂抹 面积为2.5cm×2.5cm，每天涂抹一次，连续涂抹14d，涂抹后4h，用温水清洗，除去残 余物，24h后观察结果；

所述急性眼刺激试验，用于检测配伍的各硅藻提取物(即受试物)对实验动物眼睛 的急性刺激和腐蚀作用，取受试物0.1ml直接置入家兔一侧眼结膜囊内，被动闭合眼睑 4s，30s后用生理盐水冲洗，另一眼滴以生理盐水作为对照，于滴眼后1、24、48、72h 观察记录刺激反应。

本发明具有以下优点：(1)检测范围广，适用于各种硅藻提取物的安全性能鉴定； (2)适用机构多，各卫生消毒检验部门、科研院所、社会公共检测机构、企业的研发、 质量控制部门均可依据本方法进行安全效果评价；(3)检测方法简便易行，试验成本低； (4)试验方法可重复性好，稳定可靠；(5)试验结果客观，真实可信。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本 发明保护的范围。

本发明实施例中，提供的检测方法，由皮肤变态反应试验、一次皮肤刺激试验、多 次完整皮肤刺激试验、急性眼刺激试验四种检测方法内容组成。

一、检测方法及评价指标(安全性能评价依据)：

(一)、皮肤变态反应试验

1、实验动物

选用皮肤完好的健康白色豚鼠，雌雄各半，体重200g～300g。

2、试验分组

将豚鼠随机分为试验组、阴性对照组和阳性对照组，每组动物至少16只。

3、操作程序

(1)对试验组豚鼠，给予各硅藻提取物(即受试物)诱导和激发处理。阳性对照组 给予阳性致敏物(如：2，4-二硝基氯苯)诱导和激发处理。阴性对照组仅给以受试物 激发处理。

(2)诱导处理浓度允许引起皮肤轻度刺激反应。激发浓度可低于诱导浓度，并不 得引起原发性刺激反应。如果原液不引起皮肤刺激反应，诱导和激发均使用原液。

(3)于试验前24h将豚鼠背部左侧3cm×3cm范围内去毛。取诱导浓度的硅藻提取 物0.5ml(g)，直接涂在2cm×2cm左侧去毛皮肤上或滴于同样大小的2～4层纱布上， 再将其敷贴在左侧去毛区。用一层无刺激塑料膜或油纸复盖，再以无刺激胶布固定，持 续6h。第7天和第14天以同样方法重复一次。

(4)在末次诱导后14天，将激发浓度的硅藻提取物0.5ml(g)直接涂在2cm×2cm 右侧脱毛皮肤上或滴于同样大小的2～4层纱布上，敷贴于豚鼠背部右侧3cm×3cm去毛 区。然后，用一层塑料膜或油纸和无刺激胶布固定，6h后将敷贴的受试物洗去。24h和 48h后观察皮肤反应，按表4-17对皮肤反应进行评分。

(5)实验室开展皮肤变态反应试验初期，或使用新的动物种属或品系时，需同时设 阳性对照组，阳性对照物可使用2，4-二硝基氯代苯。为保证试验方法的可靠性，在进 行该类试验时，每隔半年应使用阳性对照物检查一次。若检测报告中需用非本次阳性对 照组的实验数据时，应注明其实验日期。阳性对照组的操作程序同试验组，以阳性致敏 物替代受试物。

(6)阴性对照组，仅对动物给予受试物的激发接触，每次试验必须设置。

4、评价标准

化学物质引起的过敏性接触性皮炎，属迟发型变态反应。对于动物，仅见皮肤红斑 和水肿。

根据表1标准，将出现皮肤反应(评分≥1)的动物数除以该组实验动物数，求得致 敏率(％)，按表2定致敏强度。

表1 皮肤反应的评分标准

皮肤反应 评分 A 红斑形成: 无红斑 0 轻微红斑 1 中度红斑 2 严重红斑 3 水肿性红斑 4 B 水肿形成: 无水肿 0 轻度水肿 1 中度水肿 2 严重水肿 3

表2 致敏强度分级标准

致敏率(％) 致敏强度 0～8 极轻度 9～28 轻度 29～64 中度 65～80 强度 81～100 极强度

注：致敏率为0％时，可判为未见皮肤变态反应。

5、安全评价：

根据表1标准，将出现皮肤反应(评分≥1)的动物数除以该组实验动物数，求得致 敏率(％)，按表2定致敏强度。0～8％为无致敏性至极轻度致敏性，我们可判断其产品 变态反应试验为阴性，安全性较高，9～100％为轻度至极强度致敏性，我们可判断其产 品变态反应试验为阳性，安全性较低。

(二)、皮肤刺激试验

1、实验动物

每次试验至少需3只皮肤完好的健康家兔或豚鼠。

2、操作程序

3、一次完整皮肤刺激试验

(1)在试验前24h，用脱毛剂或剪刀将家兔或豚鼠背部脊柱两侧的毛去掉，不得损 伤皮肤。去毛范围，左、右各约3cm×3cm。

(2)次日将各硅藻提取物(受试物:浓度一般为皮肤消毒应用液的5倍或原液0.5ml (g)直接滴于面积为2.5cm×2.5cm的一侧去毛完整皮肤上，或滴于同样大小的2～4层 纱布上并敷贴在一侧去毛皮肤表面，然后用一层无刺激塑料膜或油纸覆盖，再用无刺激 胶布固定。另一侧去毛皮肤作为空白对照。敷贴时间为4h。对于用后清洗的消毒剂， 敷用时间至2h。试验结束后，用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物。

(3)分别于去除受试物后1h、24h和48h观察皮肤局部反应，并按表2进行刺激反 应评分。

4、一次破损皮肤刺激试验

(1)涂各硅藻提取物(受试物)前，在2.5cm×2.5cm的去毛皮肤上，用75％酒精清 洁、消毒暴露皮肤，待酒精挥发后，用灭菌刀片或注射针头在皮区内划一个“井”形的 破损伤口，并在该破损皮区内染毒。注意皮肤破损仅达表皮，不要伤及真皮。

(2)手术前的皮肤准备，手术后受试物涂抹和局部皮肤反应的观察，评分方法同 上注意鉴别感染和原发性刺激反应的区别，若有感染可疑，应进行重复测试。

5、多次完整皮肤刺激试验

(1)试验前动物皮肤准备同上。

(2)次日将各硅藻提取物(受试物)0.5ml(g)涂在一侧皮肤上，另一侧涂溶剂 作

为对照，在涂抹后4h，用水或无刺激的适宜溶剂清洗，除去残留物。每天涂抹一次，连 续涂抹14d。在每次涂抹后24h观察结果，按表2评分。为了便于受试物的涂抹和结果 观察，必要时应剪毛。对照区的处理方法同试验区。

6、评价标准

(1)、一次皮肤刺激试验

在各个观察时间点，按照表2对动物的皮肤红斑与水肿形成情况进行评分，并分别 按时间点将3只动物的评分相加，除以动物数，获得不同时间点的皮肤刺激反应积分均 值(刺激指数)。取其中最高皮肤刺激指数，按表3评定该受试物对动物皮肤刺激强度 的级别。

(2)、多次皮肤刺激试验

按下列公式计算每天每只动物平均积分(刺激指数)，并以表4判定皮肤刺激强度。

表3 皮肤刺激反应的评分标准

皮肤刺激反应 皮肤刺激反应评分 红斑形成：   无 0 勉强可见 1 明显 2 严重 3 紫红色红斑，并有焦痂 4 水肿形成:   无 0 勉强可见 1 皮肤隆起，轮廓清楚 2 水肿隆起约1mm 3 水肿隆起超过1mm 4

表4 皮肤刺激强度分级

皮肤刺激指数 刺激强度级别 0～＜0.5 无刺激性 0.5～＜2.0 轻刺激性 2.0～＜6.0 中等刺激性 6.0～8.0 强刺激性

7、安全评价：

根据表3标准评定该受试物对动物皮肤刺激强度的级别，以表4标准判定皮肤刺激 强度。0～＜0.5为无刺激性，我们可判断其产品皮肤刺激试验为阴性，安全性较高，0.5～ 8.0为轻度至强刺激性，我们可判断其产品皮肤刺激试验为阳性，安全性较低。

(三)、急性眼刺激试验

1、实验动物

使用3只家兔。试验前检查家兔双眼，有异常者不能用于试验。

2、操作程序

(1)各硅藻提取物(受试物)一般为使用时的5倍浓度的溶液。吸取受试物0.1ml， 滴入家兔一侧眼结膜囊内。另一侧眼以生理盐水作为正常对照。

(2)滴受试物后，将眼被动闭合4s，30s后用生理盐水冲洗。于滴眼后1h、24h、 48h、72h、7d、14d和21d，肉眼观察家兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤与恢复情况。如 果72h内未出现刺激反应，或第7天或第14天，眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终 止试验。必要时，用2％荧光素钠溶液或裂隙灯、放大镜检查角膜及虹膜变化。

3、评价指标

按表5对家兔眼角膜、虹膜和结膜的急性刺激反应进行评分，并分别计算每只动物在三 个不同观察时间(24h、48h和72h)的角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿四方 面的“平均评分”(即每只动物的24h、48h和72h评分之和除以观察数3)。分别以动物 眼角膜、虹膜和结膜充血、水肿的平均评分和恢复时间，按表6、7眼刺激反应分级标 准判定受试物对眼睛的刺激强度。

4、安全评价：

根据表5标准对家兔眼角膜、虹膜和结膜的急性刺激反应进行评分，分别以动物眼 角膜、虹膜和结膜充血、水肿的平均评分和恢复时间，按表6、7标准进行眼刺激反应 分级标准判定受试物对眼睛的刺激强度。眼刺激性反应分级标准属可逆性损伤，我们可 判断其产品眼刺激试验为阴性，安全性较高，眼刺激性反应分级标准属不可逆性损伤， 我们可判断其产品眼刺激试验为阳性，安全性较低。

表5 家兔急性眼刺激反应的评分标准

表6 眼刺激性反应分级标准

注：完全恢复是指动物的眼刺激反应评分：角膜损害＝0，虹膜损害＝0，结膜充血＝0 或1，结膜水肿＝0或1。

①刺激性：接触受试物后所产生的可逆性炎性反应。

②腐蚀性：接触受试物后所产生的不可逆性组织损伤。

表7 眼刺激性反应分级标准

③：恢复时间：为动物刺激反应评分恢复至角膜损害＝0，虹膜损害＝0，结膜充 血＝0或1，结膜水肿＝0或1的时间。

④：腐蚀性：至少有1只动物于21d尚存在角膜粘连或血管翳，也可判为腐蚀 性。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此， 无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围 由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范 围内的所有变化囊括在本发明内。