用于引产的包含硫酸化的葡糖胺聚糖的联合治疗

摘要

本发明涉及某些硫酸化的葡糖胺聚糖用于引产的用途。硫酸化的葡糖胺聚糖具有降低的抗凝血活性并且用于与能够促进宫颈成熟或者促进子宫的子宫肌层收缩的治疗一起的联合治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及某些硫酸化的葡糖胺聚糖用于引起妇女分娩的用途。

背景技术

在产科学，由于延迟妊娠，例如超过41-42周妊娠时间，或者由于众多医学并 发症，例如先兆子痫、糖尿病、原发性高血压(essential hypertonia)和宫内发育 迟缓(IUGR)而需要引产是常见的临床表现。

在引产中，作为宫颈细胞外基质(ECM)的不充分重塑(remodeling)的结果， 宫颈经常是未成熟的。具有低浓度硫酸乙酰肝素的子宫ECM的不充分重塑与难产 相关联。在已确定的分娩期间正常的宫颈成熟和1至10cm的宫颈打开意味着具 有导致胶原和蛋白聚糖浓度降低的炎症反应的宫颈ECM的完全重建 (reconstruction)。如果该过程过早启动，在宫颈成熟中的干扰导致早产。另一方 面，不充分的宫颈成熟可以导致具有高频率滞产的过期分娩，因此导致机器分娩。 因此，宫颈成熟和子宫肌层收缩是两个过程，其必须协调以完成正常分娩。

分娩可以多种方式诱导。引产方法的非限制性例子为物理刺激过程；催产素、 前列腺素E或其衍生物的施用，例如米索前列醇和地诺前列酮(dinoproston)；使 羊膜囊破裂；扩张宫颈，施用宫颈内气球和使用宫颈内的弗利导管(提供前列腺 素从蜕膜和宫颈的内源性释放)。还可以使用这些引产方法的组合。虽然施用这些 试剂或方法引产是常见作法，然而事实上经受引产的妇女遭受频繁的难产发生率， 包括分娩停止(labor arrest)、延长的分娩潜伏期和缓慢的分娩过程(滞产)。另外 据估算局部应用前列腺素E2之后，不良宫颈的妇女中15-20％的引产干预会失败。 尽管存在这些事实，很少有过努力开发新的药物旨在改善引产和其后的事件直至 分娩。在建立可靠和安全的治疗方面的失败导致了越来越多的剖腹产手术和手术 分娩。

在Acta Obstetricia et Gynecologica.2010；89:147–150)中报道了已经发现达肝 素钠(一种低分子量肝素(LMWH))改善分娩过程，由此降低分娩时间，并且其提 示在分娩中达肝素钠增加诱导催产素的子宫平滑肌收缩并且还刺激从取自宫颈的 活检培育的宫颈细胞中细胞因子的释放。虽然达肝素钠通常看来对分娩过程产生 阳性结果，但是由于其抗凝血作用导致的出现风险它在临床上是不可行的。

WO 03055499教导具有100BP单位/mg或更少的抗凝血活性的硫酸化的葡糖 胺聚糖(例如肝素)通常能够有效预防性启动或治愈性治疗宫颈和子宫平滑肌以 在妇女中建立有效的分娩。在该文献中提示硫酸化的葡糖胺聚糖可以和催产素联 合用于低内源性催产素水平情况下的子宫平滑肌的启动。然而，该文献没有提示 当要求直接治疗功效的并发症出现时，硫酸化的葡糖胺聚糖可用于直接干预治疗。

需要一种试剂，其可以用作现有治疗的支持以在被选择直接干预治疗进入分 娩的妇女中引产。因此，将需要提供一种快速起效的治疗，其既可以有助于建立 不成熟宫颈的宫颈成熟过程，也可以促进子宫的子宫肌层的收缩，从而避免或消 除与难产相关的任何并发症。

发明内容

在描述本发明之前，还应了解本文所用的术语仅为了描述特定实施方案的目 的而使用，并不旨在限定，因为本发明的范围仅由所附权利要求书及其等同方式 进行限定。

必须指出的是，除非上下文另有明确规定，如在本说明书和所附权利要求书 中使用的，单数形式“一(a)”，“一(an)”和“该(the)”包括复数指代。

此外，在适用的情况下，术语“约”用于表示一个给定值的+/-2％的偏差，优 选数值的+/-5％的偏差，最优选数值的+/-10％的偏差。

在本发明的文本中，“引产”通常定义为一种干预，其直接或间接启动分娩从 子宫的子宫肌层收缩(子宫收缩)至导致分娩和孩子诞生过程的完成。引产的原 因包括，但不限于，延迟妊娠，例如超过41-42周妊娠时间或者医学并发症，例如 先兆子痫、糖尿病、原发性高血压和宫内发育迟缓(IUGR)。除了众多很好实践的 方法，通常通过施用前列腺素，例如地诺前列酮和通过施用催产素触发引产。

在本发明的文本中，术语“引产”涉及治疗，其中从施用中要求直接应答效 应。在分娩情况下，要求该施用直接导致宫颈成熟的启动或子宫收缩的促进或刺 激中的至少一种。换言之，本发明不指向预防性治疗，其中在被选择引产之前， 妇女可以接受治疗以预防或抵消延迟的分娩。

术语“被选择引产”是指由于临床原因，如“引产”列出的，或者由于人道 主义原因进入分娩的已经被选择的产妇，并且直接干预施用治疗将诱导分娩，所 述治疗在施用之后触发直接或间接导致分娩启动的过程。在本发明的文本中，导 致分娩启动的过程可以包括宫颈成熟的启动或促进或子宫的子宫肌层收缩的促进 或刺激中的至少一种。

如描述本发明的文本中所使用的术语“难产(dystocia)”或“难产(labor  dystocia)”为涵盖数种病况的上位术语，包括分娩停止、延长的分娩潜伏期和缓慢 的分娩过程(滞产)。难产特别常见于引产之后并且相比于多经产产妇在初产妇中 更频繁。

术语“联合治疗(combination treatment)”或“联合治疗(treatment in  combination)”在文中被定义为采用如本文描述和要求保护的化学修饰的肝素或硫 酸乙酰肝素的治疗和另一种对完成引产有效的治疗。另一种治疗为有效促进宫颈 成熟或子宫的子宫肌层收缩的不同治疗。另一种治疗可以包括施用能够促进宫颈 成熟或子宫的子宫肌层收缩的试剂，或者它可以包括有创治疗和无创治疗，其例 如可以触发有助于引产的前列腺素的内源性释放。熟练的产科医生知晓许多这类 的治疗。联合治疗可以包括采用如本文描述和要求保护的化学修饰的肝素或硫酸 乙酰肝素的治疗与另一种治疗附属地、同时地或连续地进行。其还可以指如本发 明描述的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素被施用作对另一种用于引产的治疗的追 加治疗。在这方面，当联合治疗为追加治疗时，化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素 的施用在触发另一种治疗之后的任何时间被添加至另一种用于引产的治疗中。

具有低抗凝血作用(例如抗因子Xa活性200IU/mg以下)的硫酸化的葡糖胺 聚糖在本文中被公开用于引产。

葡糖胺聚糖为硫酸化的葡糖胺聚糖，其选自硫酸乙酰肝素、解聚的硫酸乙酰 肝素、硫酸皮肤素、解聚的硫酸皮肤素、肝素、解聚的肝素(低分子量肝素)、硫 酸软骨素和解聚的硫酸软骨素。

硫酸化的葡糖胺聚糖为硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸皮肤素和硫酸软骨素，其 由交替的己糖胺和糖醛酸残基构成。D-葡萄糖醛酸(GlcA)和其C-5差向异构体L- 艾杜糖醛酸(IdoA)的存在和己糖胺和糖醛酸(uronosyl)残基的特异性硫酸化赋予了 聚合物极大的结构差异。此结构由重复的二糖构建，所述二糖包含从无或极少至 接近100％的含艾杜糖醛酸的二糖。含GlcA-和IdoA-N-己糖胺的二糖组建 (organization)可以从长嵌段至交替的二糖模式变化。硫酸化的变化和艾杜糖醛 酸硫酸盐的程度产生众多生物活性。有不同的定义明确的硫酸皮肤素、硫酸软骨 素、硫酸乙酰肝素和解聚肝素的多糖。

硫酸软骨素是硫酸化线性多糖，其由交替的葡糖醛酸和N-乙酰-半乳糖胺残基 组成，后者在4或6位被硫酸化。它们可以由牛气管软骨或鼻软骨制备。硫酸软 骨素对于细胞外基质的组建很重要，其产生间质的膨胀压力并参与中性粒细胞的 募集。

硫酸皮肤素是硫酸化线性多糖，其由交替的糖醛酸和N-乙酰-半乳糖胺残基组 成。糖醛酸是D-GlcA或L-IdoA并且所述二糖可以分别在半乳糖胺和IdoA的4和 6和2位上被硫酸化。硫酸皮肤素可以从猪皮肤或肠粘膜和牛肺制备，其具有生物 学活性，例如细胞外基质的组建、与细胞因子相互作用、抗凝血活性和中性粒细 胞的募集。

硫酸乙酰肝素，具有葡糖胺和糖醛酸作为重复二糖，且由主要以分隔方式排 列的N-乙酰化和N-硫酸化二糖组成，其在细胞表面和细胞外基质中具有广泛分布。 其与肝素相比通常较少硫酸化且具有较低的艾杜糖醛酸含量并且具有更加多变的 结构。硫酸乙酰肝素和蛋白质之间的相互作用牵涉多种生理过程，例如细胞粘附、 细胞增殖、酶调节、细胞因子作用、病毒入侵和抗凝血特性。硫酸乙酰肝素具有 依赖于特定抗凝血五糖存在的抗凝血活性，然而明显不如肝素。硫酸乙酰肝素是 线性多糖，可以如Fransson等人，Structural studies on heparan sulphates，Eur.J. Biochem.106，59-69(1980)所述，从猪的肠粘膜或从牛肺，使用氯化十六烷基吡啶 部分和随后的盐提取物从肝素支链部分制备。

肝素是天然存在的葡糖胺聚糖，其是一种有效的抗凝血剂，并已经作为优选 的预防和治疗血栓栓塞性疾病的药物用于临床60余年。肝素治疗的主要潜在副作 用是其抗凝血特性引起的出血并发症。肝素是高度多分散性的并由分子量范围在5 至40kDa(平均大约在15至18kDa)的多糖异质群体组成。低分子量肝素或解聚 肝素是线性寡糖，主要由交替的N-硫酸化葡糖胺和IdoA残基组成，并且常包含抗 凝血五糖。它们可以通过特异性化学裂解由肝素制备。它们的主要临床功能是抑 制因子Xa，产生抗血栓形成作用。已提出其具有抗转移(antimetastatic)性质。 (Pfizer,美国)是通过受控的肝素解聚获得的低分子量肝素的例子，其由 于因子Xa的抑制而具有抗血栓形成作用。具有选择性抗凝血活性的肝素片段及其 制备方法描述于美国专利号4,303,651中。根据欧洲药典(PharmEur)，肝素如果 被称为低分子量肝素(低分子质量肝素)应当具有不在70IU(国际单位)/mg以 下的抗因子Xa活性并且M_w在8000Da以下。肝素、低分子量肝素和其它肝素衍 生物的抗凝血活性通常以它们通过抗凝血酶增强凝血因子Xa和因子IIa的抑制的 能力被测量。测量抗因子Xa-和抗因子IIa活性的方法对技术人员而言是已知的， 还描述于药典中，例如欧洲药典(Pharm Eur)和美国药典(USP)。通过例如选择性 高碘酸盐氧化(见例如FranssonLA和Lewis W,Relationship between anticoagulant  activity of heparin and susceptibility,to periodate oxidation,FEBS Lett.1979, 97:119-23；Lindahl等人,Proc Natl Acad Sci USA,1980；77(11):6551-6555)和技术人 员已知的其它手段可以取消抗凝血活性。

在一方面，本发明涉及化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其具有10IU/mg以 下的抗因子II活性、10IU/mg以下的抗因子Xa活性，其包含：

(i)基本上不含调节抗凝血作用的化学完整的糖序列的多糖链；和

(ii)对应于1.2至12kDa之间的分子量的多糖链，所述多糖链具有根据(式I) 的主要出现的二糖，

其中，

n是2至20的整数

其在与能够促进宫颈成熟或促进子宫肌层收缩的治疗联合用于引起妇女分娩 中的用途。

在本文中，包含基本上不含调节抗凝血作用的化学完整的糖序列的多糖链的 化学修改的肝素或硫酸肝素，意味着多糖链已经被化学处理以基本上修饰全部通 过抗凝血酶(AT)特异性调节抗凝血作用的五糖。

在一方面，所述治疗包括至少施用一种有效促进宫颈成熟的试剂或者一种有 效促进子宫的子宫肌层收缩的试剂。

在一方面，所述化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素作为追加治疗用于能够促进 宫颈成熟或者促进子宫的子宫肌层收缩的治疗。

在一方面，所述治疗包括以下至少一种：使羊膜囊破裂(羊膜穿破术)；扩张 宫颈，施用宫颈内气球和使用宫颈内的弗利导管(提供前列腺素从蜕膜和宫颈的 内源性释放)。根据该方面，所述治疗可以包括触发内源性前列腺素释放的其它方 法或手段从而促进引产。

在一方面，化学修饰的肝素或硫酸肝素的使用指向被选择引产的妇女，其属 于与妇女或胎儿/新生儿临床并发症风险相关的患者群，或者所述妇女出于人道主 义原因被选择。患者群包括延迟妊娠超过41-42周妊娠时间的妇女，遭受医学并发 症，例如先兆子痫、糖尿病、原发性高血压和宫内发育迟缓(IUGR)的妇女。

在一方面，本发明涉及定义的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其用于与促 进具有未成熟宫颈的妇女中的宫颈成熟的治疗联合。在一方面，促进宫颈成熟包 括施用前列腺素，前列腺素和前列腺素衍生物通常被用作或提示用作试剂以促进 宫颈成熟。在一方面，其可以阴道内、宫颈内或羊膜外施用。在一方面，前列腺 素选自地诺前列酮(PGE2)和米索前列醇(PGE1)。还可以使用其它前列腺素或其衍 生物，例如PGF2α，或如抗妊娠素类(anti-progestine)试剂。

可以通过产科医生的常规方法，例如Bishop评分(宫颈评分)确定宫颈的状 态。已经得到确认Bishop评分为5或更少的妇女具有不成熟的宫颈。用PGE2确 定宫颈成熟度的常规治疗包括每12小时的施用，最多四次。一种常规使用的评估 成熟度的方式为评估宫颈扩张。4cm或更多的扩张可以被认为显示了成熟的宫颈。

在一方面，所述治疗包括施用能够促进或刺激子宫肌层收缩的试剂。在一方 面，向妇女施用所述试剂用于具有成熟的宫颈但是缺乏子宫的子宫肌层收缩的妇 女中的引产。根据该方面的妇女可以经受采用如早前描述的化学修饰的肝素或硫 酸肝素的联合治疗，或者经受促进宫颈成熟的治疗，例如接受前列腺素，或根据 产科医生进行的常规方法所确定的自发获得的成熟的宫颈。

在一方面，能够促进或刺激子宫收缩的试剂为催产素。

在一方面，本发明指向具有从约4.6至6.9kDa平均分子量(Mw)的化学修饰的 肝素或硫酸乙酰肝素的用途。

在一方面，化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的主要出现的多糖链具有分子量 从3.6至7.2kDa的6至12个二糖单元。

在一方面，本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素已经被高碘酸盐处理从 而通过消除抗凝血酶III结合亲和力根除抗凝血作用。获得该类化学修饰的肝素或 硫酸乙酰肝素的一个非限制性方式为经受高碘酸盐氧化，接着经受产物的碱性β- 消除。美国专利4,990,502(Lormeau等人)公开的方法阐明了一种处理天然肝素 的方式，以选择性裂解负责抗凝血作用的五糖残基的残基和随后的解聚，其得到 低抗凝血、平均分子量5.8至7.0kDa的低分子量肝素。

在一方面，至少70％的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的多糖链具有3kDa 以上的分子量。多糖分布及其对应的以重量累积％表示的分子质量可以是根据下 表：

此外，多糖包含糖链，所述糖链可以具有如式I所示的还原末端残基并且基本 上不含有完整的非硫酸化的艾杜糖醛酸和/或葡萄糖醛酸。

在一方面，该化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素包含修饰的葡糖胺，其信号存 在于¹H-NMR光谱的5.0至6.5ppm之间，其强度(比例％)相比于来自于天然肝 素的5.42ppm处的信号在4％以下。这些葡糖胺信号可以存在于6.15ppm和5.95 ppm处。在一方面，葡糖胺总量的1％以下被修饰。

在本文中，“修饰的葡糖胺”是指具有残基结构的葡糖胺，所述残基结构不预 期出现在肝素产品或低分子量肝素产品(解聚的肝素)的¹H-NMR光谱中。修饰 的葡糖胺的出现可以归因于用于氧化非硫酸化的艾杜糖醛酸和/或葡萄糖醛酸以基 本上消除抗凝血作用的化学修饰过程。合意的是使修饰的葡糖胺的存在最小化， 因为它们可以代表化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素产品的不可预测的性质，例如 在存储期间的解聚。

在一方面，化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素包含在非还原性末端具有不饱和 键的修饰的葡糖胺。这类修饰的葡糖胺信号存在于¹H-NMR光谱中的5.95ppm和 6.15ppm处。

在另一方面，本发明涉及一种妇女中引产的方法，其包括施用有效量的任何 一种早前定义的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素联合另一种引产的治疗。在该方 面，引产的其它治疗与本说明书早前章节已经定义或讨论的治疗一致。

在所述方法的一方面，所述妇女具有不成熟的宫颈并且包括施用试剂或进行 能够促进宫颈成熟的治疗，例如前列腺素。在本发明该方面的例子中，每2至6 小时静脉内或皮下施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，联合使用PGE2的治疗直 到12至48小时，或者每4小时静脉内或皮下施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝 素，联合使用PGE2的治疗直到36至48小时。

在所述方法的一方面，被选择引产的妇女已经被确定宫颈成熟，但是遭受不 充分或者没有子宫收缩。在该方面，所述方法包括施用能够促进子宫的子宫肌层 收缩的试剂，例如催产素。在本发明该方面的非限制性例子中，至少每24小时施 用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素一次，并且辅助催产素的治疗直至约36小时。 在另一方面，施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素1-24次/24小时。在另一方面， 施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素6次/24小时。在本发明该方面的例子中，每 4小时静脉内或皮下施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，联合催产素。在一方面， 通过持续输注施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素。在目前临床实践中，静脉内 施用催产素。

在所述方法的一方面，所述妇女每24小时接受直至1.5g化学修饰的肝素或 硫酸乙酰肝素。在另一方面，所述妇女每24小时接受直至1.2g化学修饰的肝素 或硫酸乙酰肝素，并且作为非限制性例子，1.2g/24小时以200mg剂量施用6次。

在所述方法的一方面，通过化学修饰的和/或能够促进宫颈成熟的试剂，例如 前列腺素的使用，所述妇女已经确定宫颈成熟，但是由于缺少子宫的子宫肌层收 缩而没有进入分娩。在该方面，引产的方法包括施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰 肝素，联合能够促进或刺激子宫收缩的试剂，例如催产素。

所述方法可以包括施用具有如本说明书任何部分定义的特征的化学修饰的肝 素或硫酸乙酰肝素。

在另一方面，本发明涉及如本说明书任何章节定义的化学修饰的肝素或硫酸 乙酰肝素在制备用于联合治疗引起妇女分娩的药物中的用途。所述治疗与本说明 书早前章节的定义一致。

用于本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素可以作为药物组合物通过胃肠 外施用而系统地施用，例如通过皮下或静脉内注射。对于胃肠外施用，活性化合 物可以合并入溶液剂或混悬剂，所述溶液剂或混悬剂还含有一种或多种佐剂，例 如无菌稀释剂如注射用水、生理盐水、固定油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其 它合成溶剂、抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、缓冲剂和调节渗透度的试剂。可以在 安瓶、小瓶、一次性注射器中或作为输液装置递送胃肠外制剂，还可以用于自我 给药。

用于本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素可以皮下施用并因此使用合适 的自我给药工具，例如注射器。

进一步，用于本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素可以通过粘膜渗透局 部施用，例如，但不限于阴道、直肠、子宫内和鼻腔施用。

在一方面，用于本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素可以与有效量的能 够促进宫颈成熟或促进子宫的子宫肌层收缩的试剂配制在一起，并因此通过前面 建议的施用途径在一个组合物中一起施用(共施用)。

在一方面，用于本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的组合物与能够促 进宫颈成熟的试剂的组合物和促进子宫的子宫肌层收缩的组合物的至少一种被包 含在试剂盒中。依据不同临床情况，可以单剂量形式或多剂量形式提供组合物。 剂型可以适合于施用工具，所述施用工具也可以是试剂盒的一部分。为此目的， 所述试剂盒可以进一步包含显示如何和何时施用被包含的组合物的临床说明书。

通过根据本发明的引产，可以显著减少缩短的分娩时间和分娩并发症的数量， 例如剖腹产手术。滞产还与其它母婴并发症相关，例如产后出血、器械分娩和子 宫内膜炎以及胎儿窒息和感染的增加风险。催产素对子宫收缩没起作用导致频繁 的剖腹产手术，包括紧急情况下进行的剖腹产手术。

通常对分娩中的妇女施用催产素以确立或重新确立有效的分娩。通常，催产 素的作用受损，这可能由于缺乏充足组织水平的硫酸乙酰肝素，其导致过剂量的 催产素，这可能导致严重的副作用，例如高收缩性。根据本发明的包括施用化学 修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的用途和方法可以逆转受损的催产素作用，因此提供 催产素节约作用并且阻止子宫肌层的高收缩性和由此引起的围产儿并发症的风 险。

根据目前的实践，促进子宫肌层收缩的试剂的浓度被滴定以达到合意的效果， 并且不施用超过妇女必需的所述试剂。滴定通常开始于低剂量，其被增加直至已 经确定了合意的效果(即子宫的子宫肌层收缩)。在一方面，化学修饰的肝素或硫 酸乙酰肝素的组合物与包含一种组合物的多剂量形式一起包含在试剂盒中，所述 组合物包含适合于数个剂量施用的能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂。在一个 例子中，所述试剂盒包含多剂量形式的催产素，并且所述化学修饰的肝素或硫酸 乙酰肝素与初始低剂量或标准剂量的催产素联合施用。如果患者停留在分娩停止 中，可以来自多剂量形式的受控的剂量施用催产素一次或数次直至分娩过程被重 新确立。

化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素可以有效补充子宫肌层的组织水平，以至于 支持催产素在子宫肌层上确立收缩作用，具有可以施用降低量的催产素的作用， 由此降低其消极的副作用。有趣的是，可能缺乏催产素的化学修饰的肝素或硫酸 乙酰肝素不触发任何或仅少量触发子宫肌层收缩。

根据本发明，化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素可以在宫颈和子宫上均发挥作 用。关于宫颈成熟，根据本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素可以与有助于 促进宫颈成熟的前列腺素E2或其它前列腺素或前列腺素衍生物一起发挥作用。

本发明涵盖已公开实施方案的任何组合。

以下非限制性实例进一步公开本发明。

附图说明

图1显示已经用根据本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素治疗的被诱导 妇女和已接受安慰剂的被诱导妇女的分娩时间。

图2显示已经采用前列腺素E2诱导的妇女，和已经用根据本发明的化学修饰 的肝素或硫酸乙酰肝素治疗的妇女，相比于已经采用前列腺素E2诱导但接受安慰 剂的妇女的分娩时间。

图3显示已经采用催产素引产的妇女和已经用根据本发明的化学修饰的肝素 或硫酸乙酰肝素治疗的妇女，相比于已经采用催产素引产但接受安慰剂的妇女的 分娩时间。

图4A-4D显示当用催产素和根据本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素联 合治疗时，子宫肌细胞的钙离子流入。

具体实施方式

根据本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的生产过程的详细描述

以下实施例1至9作为例子说明如何生产根据本发明用途的化学修饰的肝素 或硫酸乙酰肝素。

从肝素钠制备物质。所述制备涉及用高碘酸盐选择性氧化在肝素中的非硫酸 化的糖醛酸残基，包括结合于AT的五糖序列中的葡萄糖醛酸部分。破坏该残基的 结构毁坏了与AT的高亲合性相互作用，并且因此基本上消除抗凝血作用(以a-FXa 或a-FIIa测定)。随后的碱处理，β消除反应导致聚合物在已经被高碘酸盐氧化的 非硫酸化糖醛酸位点上裂解。同时，这些操作处理导致抗凝血活性的丧失和肝素 链的充分解聚。

另外，用NaBH₄还原所得到的裂解位点处的还原末端端子，其将末端醛转化 为相应的更稳定的二醇。然后，通过用乙醇的反复沉淀、过滤和离心除去添加剂、 杂质和副产物。然后通过真空和加热干燥获得粉末形式的物质。将药物物质溶解 于无菌水性缓冲液中以得到药物产品，其旨在用于静脉内或皮下施用。

目前为止描述的方法通常包括氧化、聚合物裂解(碱水解)和还原步骤。开 发根据本发明的方法以抵消或消除肝素链的任何类型的非特异性解聚。在这种情 况下，非特异性解聚通常指与特异性碱性β消除反应无关的解聚。非特异性解聚 导致产物的结构不稳定，其可能产生纯化的产品在储存期间进一步的解聚和变色。 另外，其可能有助于平常在肝素中没有发现的，在NMR光谱中出现的，非典型物 种的出现。

在以下段落中描述和列举的方法包括抵消或消除非特异性解聚的不同方面。

实施例1

非硫酸化葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，结合AT的五糖和抗凝血活性的删除

将约3000克肝素溶解于净化水中以得到10-20％w/v的溶液。将该溶液的pH 调节至4.5-5.5。然后，将偏高碘酸钠(NaIO₄)加入到生产溶液中；高碘酸盐的量 为肝素重量的15-25％。再次将pH调节至4.5-5.5。避光进行反应。在保持13-17 ℃的温度下，在连续搅拌下，使生产溶液反应18-24小时，其中在最后的两个小时 中将温度降至5℃。

氧化反应的终止和含碘化合物的除去

于5-25℃的温度，伴随着温和的搅拌，将乙醇(95-99.5％)经0.5-1小时添加 入反应混合物中。添加的乙醇的体积在1-2体积乙醇/生产溶液体积的范围内。然 后使氧化的肝素沉淀并沉积15-20小时，然后倾倒出并弃除母液。

然后，将沉积物溶解于净化水中以获得15-30％w/v生产溶液。加入NaCl以 获得生产溶液中0.15-0.30mol/升的浓度。在保持5-25℃的温度同时继续搅拌另外 的0.5-1小时。然后在搅拌下，将1.0-2.0体积乙醇(95-99.5％)/生产溶液体积经 0.5-1小时加入到该溶液中。从该溶液中沉淀出产物。

通过碱性β消除过程的多糖链的解聚

倾倒出并弃除母液后，将沉积物于约7升的水中搅拌直至完全溶解，溶液的 浓度现在为15-30％。在保持5-25℃的温度同时缓慢加入4M NaOH溶液直至获得 10.5-12的pH。引发并进行反应15-95分钟。此时，记录溶液的pH并缓慢添加4M HCl直至获得5.5-7的pH。

还原性末端端子的还原

在保持13-17℃的温度同时，将溶液的pH调节至5.5-6.5。然后将130-150克 硼氢化钠加入至溶液中，此时pH将升至10-11，继续反应14-20小时。这段反应 时间后，缓慢加入稀酸以调节pH值至4，这降解剩余的硼氢化钠。维持4的pH 值45-60分钟后，使用稀的NaOH溶液将溶液的pH调节至7。

根据实施例5继续纯化。

实施例2

葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的删除

将约3000克肝素溶解于净化水中以得到10-20％w/v的溶液。将该溶液的pH 调节至4.5-5.5。然后，将偏高碘酸钠(NaIO₄)加入到生产溶液中；高碘酸盐的量 为肝素重量的15-25％。再次将pH调节至4.5-5.5。避光进行反应。在保持13-17 ℃的温度下，在连续搅拌下，使生产溶液反应22-26小时，其中在最后的两个小时 中将温度降至5℃。反应期结束时测定并记录pH。

氧化反应的终止和含碘化合物的除去

于5-25℃的温度，伴随着温和的搅拌，将乙醇(95-99.5％)经0.5-1小时添加 入反应混合物中。添加的乙醇的体积在1-2体积乙醇/生产溶液体积的范围内。然 后使氧化的肝素沉淀并沉积15-20小时，然后倾倒出并弃除母液。

通过碱性β消除过程的多糖链的解聚

倾倒出并弃除母液后，将沉积物于约7升的水中搅拌直至其外表显示完全溶 解。在保持20-25℃的温度同时缓慢加入4M NaOH直至获得10.5-12的pH，因此 允许引发的反应进行15-95分钟。此时，记录溶液的pH并缓慢添加4M HCl直至 获得5.5-7的pH。

还原性末端端子的还原

倾倒出并弃除母液后，通过添加净化水溶解沉积物直至获得15-30％w/v的生 产溶液浓度。在保持13-17℃的温度同时，将溶液的pH调节至5.5-6.5。然后将 130-150克硼氢化钠加入至溶液中并使其溶解，pH立即升至pH 10-11，继续反应 14-20小时。记录该反应时间段之前和之后的溶液的pH。这段反应时间后，缓慢 加入稀酸以调节pH值至4，这降解剩余的硼氢化钠。维持4的pH值45-60分钟 后，使用稀的NaOH溶液将溶液的pH调节至7。

根据实施例5继续纯化。

实施例3

葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的删除

将约3000克肝素溶解于净化水中以得到10-20％w/v的溶液。将该溶液的pH 调节至4.5-5.5。然后，将偏高碘酸钠(NaIO₄)加入到生产溶液中；高碘酸盐的量 为肝素重量的15-25％。再次将pH调节至4.5-5.5。避光进行反应。在保持13-17 ℃的温度下，在连续搅拌下，使生产溶液反应18-24小时，其中在最后的两个小时 中将温度降至5℃。

通过碱性β消除过程的多糖链的解聚

在保持5-25℃的温度同时，缓慢加入4M NaOH溶液直至获得10.5-12的pH。 引发并进行反应15-95分钟。此时，记录溶液的pH并缓慢添加4M HCl直至获得 5.5-7的pH。

还原性末端端子的还原

在保持13-17℃的温度同时，将溶液的pH调节至5.5-6.5。然后将130-200克 硼氢化钠加入至溶液中，此时pH将升至10-11，继续反应14-20小时。这段反应 时间后，缓慢加入稀酸以调节pH值至4，这降解剩余的硼氢化钠。维持4的pH 值45-60分钟后，使用稀的NaOH溶液将溶液的pH调节至7。

还原的产物的沉淀和含碘化合物的初始去除

于5-25℃的温度，在温和搅拌下，将乙醇(95-99.5％)经过0.5-1小时加入反 应混合物中。添加的乙醇的体积在1-2体积乙醇/生产溶液体积的范围内。然后使 得氧化的肝素沉淀并沉积15-20小时，然后倾倒出并弃除母液。

然后，将沉积物溶解于净化水中以获得15-30％w/v的生产溶液。加入NaCl 以获得生产溶液中0.15-0.30mol/升的浓度。

根据实施例5继续纯化。

实施例4

葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的删除

将约3000克肝素溶解于净化水中以得到10-20％w/v的溶液。将该溶液的pH 调节至4.5-5.5。然后，将偏高碘酸钠(NaIO₄)加入到生产溶液中；高碘酸盐的量 为肝素重量的15-25％。再次将pH调节至4.5-5.5。反应器避光。在保持13-17℃的 温度下，在连续搅拌下，使生产溶液反应18-24小时，其中在最后的两个小时中将 温度降至5℃。然后，加入丙三醇以淬灭反应，即，将残余高碘酸盐转化为碘酸盐， 加入150-200ml 85％的丙三醇溶液并搅拌下反应30-60分钟。

沉淀产物，除去含碘化合物和淬灭/反应产物

于5-25℃的温度，在温和搅拌下，将乙醇(95-99.5％)经过0.5-1小时加入反 应混合物中。添加的乙醇的体积在1-2体积乙醇/生产溶液体积的范围内。然后使 得氧化的肝素沉淀并沉积15-20小时，然后倾倒出并弃除母液。

然后，将沉积物溶解于净化水中以获得15-30％w/v的生产溶液。加入NaCl 以获得生产溶液中0.15-0.30mol/升的浓度。在保持5-25℃的温度同时继续搅拌 0.5-1小时。然后，搅拌下，经0.5-1小时，向该溶液加入1.0-2.0体积乙醇(95-99.5％) /生产溶液体积。从该溶液中沉淀出产物。

通过碱性β消除过程的多糖链的解聚

倾倒出并弃除母液后，在约7升的水中搅拌沉积物直至其外观显示完全溶解。 在保持5-25℃的温度同时，缓慢加入4M NaOH直至获得10.5-12的pH，允许由此 引发的反应进行60-95分钟。此时，记录溶液的pH并缓慢添加4M HCl直至获得 5.5-7的pH。

还原性末端端子的还原

倾倒出并弃除母液后，通过添加净化水溶解沉积物直至获得15-30％的生产溶 液浓度。在保持13-17℃的温度同时，将溶液的pH调节至5.5-6.5。然后将130-150 克硼氢化钠加入至溶液中并使其溶解，pH立即升至pH 10-11，继续反应14-20 小时。记录该反应时间段之前和之后的pH。这段反应时间后，缓慢加入稀酸以调 节pH值至4，这降解剩余的硼氢化钠。维持4的pH值45-60分钟后，使用稀的 NaOH溶液将溶液的pH调节至7。

根据实施例5继续纯化。

实施例5

产物的纯化

过程添加剂和杂质的去除，反离子的添加和过滤

根据如下概括的方法处理来自于由硼氢化物还原末端端子的最终化学修饰步 骤的根据实施例1-4的生产溶液。

然后，将一体积的生产溶液添加入1.5-2.5体积的乙醇(95-99.5％)，然后于＜ 20℃，于＞2000G离心20-30分钟，随后倾倒出并弃除上清液。

然后将离心获得的产物糊状物溶解于净化水中以获得10-20％w/v的产物浓 度。然后加入NaCl以获得0.20-0.35mol/升的浓度。然后，每体积生产溶液添加 1.5-2.5体积的乙醇(95-99.5％)，其从溶液中沉淀出产物。如上所述离心。

然后，向剩余的糊状物中添加净化水以溶解。现在的产物浓度在10-20％w/v 的范围内。然后将产物溶液的pH调节至6.5-7.5。然后过滤溶液以除去任何微粒。 然后，向一体积的生产溶液中添加1.5-2.5体积的乙醇(95-99.5％)。然后于＜20 ℃，于＞2000G，进行离心20-30分钟，然后倾倒出并弃除上清液。

沉淀糊状物的脱水和粒径的降低

向反应器中填充入乙醇约2升体积。在搅拌乙醇下，同时加入沉淀糊状物。 机械搅拌固化糊状物并用乙醇替换存在的水得到同质颗粒混悬液。1-2小时后停止 搅拌，然后使颗粒沉积。移除过量的液体后，使颗粒过筛或研磨以获得较小的且 均匀大小的颗粒。

产物的干燥

将产物均匀地分布于托盘上，并置于真空箱中。施用真空并于35-40℃进行加 热。此时，在保持干燥器内低压同时，氮气蒸汽通过干燥器。当产物获得稳定的 重量时，即没有发现进一步的蒸发，视为完成干燥。包装产品并防湿保存。

实施例6

葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的删除

将约3000克肝素溶解于净化水中以得到10-20％w/v的溶液。将该溶液的pH 调节至4.5-5.5。然后，将偏高碘酸钠(NaIO₄)加入到生产溶液中；高碘酸盐的量 为肝素重量的15-25％。再次将pH调节至4.5-5.5。避光进行反应。在保持13-17 ℃的温度下，在连续搅拌下，使生产溶液反应18-24小时，其中在最后的两个小时 中将温度降至5℃。

通过碱性β消除过程的多糖链的解聚

在保持5-25℃的温度同时，缓慢加入4M NaOH直至获得10.5-12的pH，允许 由此引发的反应进行15-95分钟。此时，记录溶液的pH并缓慢添加4M HCl直至 获得5.5-7的pH。

还原性末端端子的还原

倾倒出并弃除母液后，通过添加净化水溶解沉积物直至获得15-30％w/v的生 产溶液浓度。在保持13-17℃的温度同时，将溶液的pH调节至5.5-6.5。然后将 130-200克硼氢化钠加入至溶液中并使其溶解，pH立即升至pH 10-11，继续反应 14-20小时。记录该反应时间段之前和之后的pH。这段反应时间后，缓慢加入稀 酸以调节pH值至4，这降解剩余的硼氢化钠。维持4的pH值45-60分钟后，使 用稀的NaOH溶液将溶液的pH调节至7。然后向溶液中加入净化水直至获得15-20 mS/cm的反应溶液导电性。

通过离子交换色谱法纯化产物

将直径500mm的色谱柱用介质、DEAE-Sepharose或QAE-Sepharose填装至 对应于10-15cm床高的25-30升体积。进行色谱法3-4轮以纯化所有的产物。

然后制备缓冲液，

平衡缓冲液，缓冲液A，15mM磷酸盐，150mM NaCl

洗脱缓冲液，缓冲液B，2M NaCl溶液

装备缓冲液，0.5M NaOH

于15-25℃，以≤200cm/小时或约350升/小时的流速，进行该色谱法步骤。

将柱用平衡缓冲液平衡直至洗脱液具有15-20mS/cm的导电性。然后将氧化肝 素溶液泵入柱内。应用的粗产物的量相当于＜40g/升的色谱法介质。

平衡缓冲液后进行等度(isocratic)冲洗，并当UV 210-254nm达到基线时停 止冲洗。典型地，需要5床体积的缓冲液来达到基线。除去添加入过程中的化学 品和这些化学品形成的产物。

然后，通过进行梯度洗脱，应用于柱上的缓冲液的离子强度线性增加。缓冲 液A从100％降至0％，而被超过5床体积的100％缓冲液B替换。当UV吸收为 ＞0.1AU时收集产物(洗脱物)，并且当信号＜0.1AU时停止收集。然后进行柱的 保洁，随后再次准备色谱柱以用于下一轮色谱法。合并所有轮次的洗脱物并保存 于15-25℃。

产物的脱盐

于15-25℃，连续搅拌下，向一体积上述步骤中获得的合并的洗脱物添加3体 积的95-99.5％乙醇。从该溶液中沉淀出产物。允许产物沉积＞3小时。然后，将沉 积物溶解于净化水中达到15-25％的浓度。然后将溶液加入95-99.5％的冷乙醇(＜ -5℃)，典型地消耗5体积乙醇/一体积产物溶液。然后，于＞2000G，以连续模式 离心，然后收集并制得产物糊状物以干燥。

产物的干燥

将产物均匀地分布于托盘上，并置于真空箱中。应用真空并于35-40℃进行加 热。此时，在保持干燥器内低压同时，氮气蒸汽通过干燥器。当产物获得稳定的 重量时，即没有发现进一步的蒸发，视为完成干燥。粉碎产物并得到同质性，然 后包装产品并防湿保存。

实施例8

使根据实施例1和3制备的低抗凝血肝素经历1H-NMR分析并与天然肝素的 光谱比较。

表II阐明了产生于非还原性末端不饱和葡糖胺的不存在于天然肝素中的5.00 ppm至6.50ppm之间的信号。表II的结果显示能够从天然肝素降低这样的不被预 测存在于光谱中的化合物的存在至一个很低的水平。作为对比，对于5.70-8.00ppm 区域内的任何信号，目前适用于肝素质量控制的限制(EDQM的专题7)为与5.42 ppm的信号相比＜4％。

表II、关于异常信号的低抗凝血肝素的定量结果。1H-NMR光谱中信号6.15 和5.95ppm的信号强度

另外，通过联合1H-NMR和13C-NMR光谱评估(HSQC)还定量了非还原性 末端不饱和葡糖胺的存在，并以mol％的总葡糖胺证明(见表III)。

另外，通过以下的NMR二维(2D)方法分析样品，所述NMR二维方法涉及 如前所述的质子和碳NMR光谱(HSQC)的联合应用(参见Guerrini M.,Naggi A., Guglieri S,Santarsiero R,Torri G.Anal Biochem 2005；337,35-47)。

表III阐明了与低抗凝血肝素的葡糖胺的总量相比的修饰的葡糖胺的部分 (％)，其以¹H-NMR光谱中的5.95ppm和6.15ppm处的信号存在。

表III：总葡糖胺的异常信号5.95ppm、6.15ppm的定量测定结果

实施例9

可以通过常规的无菌工艺将根据上述任何一个实施例生产的产品制成药物产 品，例如pH 6-8的含有150mg/mL的活性产物和15mM磷酸钠的溶液。如此获得 的药物产品主要旨在用于皮下施用，但也适用于静脉内施用。

得到的产品是具有设计的4.6-6.9kDa平均分子量并基本上无抗凝血活性的肝 素的解聚形式。

所述产品具有对应于1.2-15kDa的分子量n为2-20范围内的多糖聚合物的粒 径分布。主要的大小是对应于3.6-9.6kDa分子量的6-16个二糖单元。

通过用TSK 2000和TSK 3000SW串联柱进行的GPC-HPLC测定分子量。使 用折射率来评估。对于LMWH使用第一国际校准物。

下面呈现分子质量分布和总重量累积百分比的对应部分。

表IV、几个批次的多糖分布及以重量累积％表示的其对应的分子质量

重均平均分子量的对应值，Mw落入4.6-6.9kDa的范围内。

实施例10

于环境温度，研究了根据实施例1至3制备的和根据实施例9配制的化学修 饰的肝素的药物物质(粉末)和溶解于磷酸盐水性缓冲溶液中的药物产品的稳定 性达36个月。初始产品为纯白色至浅黄色溶液，在400nm(10％w/v溶液)具有 0.14吸光度，pH为7.0和渗透度为658mOsm/kg，平均分子量为5.6kDa且浓度 为150mg/ml。

36个月之后，药物产品具有相同的视觉外观，在400nm(10％w/v溶液)具有 0.13吸光度，pH为7.1和渗透度为657mOsm/kg，平均分子量为5.4kDa且浓度 为153mg/ml。

(实施例10被重写成依赖于一个概括的稳定性试验)

实施例11

皮下施用

向SD大鼠和狗施用通过实施例1公开的方法制备的和氚标记的化学修饰的肝 素。

结果：

对于大鼠以2、8和24mg化学修饰的肝素/kg/天以及对于狗以3、15和45mg 化学修饰的肝素/kg/天皮下施用后，迅速吸收并且在大鼠和狗中一般分别在0.5和 1.5小时内达到最大血浆浓度。在大鼠和狗中皮下生物利用度约为90％。肝素的对 应的生物利用度约为10％。

实施例12

在晚期妊娠采用DF01治疗

研究设计

这是随机、双盲、安慰剂对照、多中心研究以评价在晚期妊娠采用DF01预处 理减少分娩时间的安全性和疗效。瑞典的十八个研究中心参与了本研究。

DF01为根据本发明的化学修饰的肝素，其是低抗凝血肝素，依据实施例1和 9，通过来自猪的肠粘膜的肝素的高碘酸盐氧化和然后进行产物的β消除而产生。

方案规定每名受试者进入日常门诊，从孕龄38+0周达到40+0周开始治疗直 到分娩，接受皮下注射研究的医药产品。对每名受试者参与本研究的预期持续时 间为1-28天(+筛选时间和后继时间)。所有妇女必须最迟在妊娠42+0周引产。 给予最长28天的治疗[最多28个剂量的研究的医药产品(IMP)]。分娩之后8-16 周进行随访。

治疗

DF01为解聚的肝素，其基本上失去了其抗凝血活性(<10IU/mg依据药典的 抗因子Xa-和抗因子IIa试验)。重均分子量Mw为5000-7000。

DF01和匹配的安慰剂提供为用于皮下注射的溶液。

DF01的药物制剂为用于皮下注射的溶液，8mL分散于橡皮塞密封的和用剥除 型铝盖覆盖的玻璃小瓶中。

每mL的DF01溶液包含下列成分：

□DF01，150mg

□磷酸盐缓冲液，0.015M

□苄醇，14mg。

用苄醇保藏的无菌生理学氯化钠溶液用作安慰剂。以如药物产品相同的方式 在小瓶中提供八(8)mL安慰剂。

每mL的安慰剂溶液包含下列成分：

□氯化钠，9mg

□苄醇，14mg。

受试者接受60mg/天的DF01(0.4mL)(对应于1.00mg/kg/天，60kg受试者) 或安慰剂(0.4mL)。

通过每天皮下注射施用所述产品，治疗开始于孕龄38+0周至40+0周，且治 疗持续直至分娩。如果在42+0周任然没有分娩，则进行引产。治疗最长持续时间 为28天。日常注射之间允许的时间间隔为24+/-6小时，即18-30小时。如果时间 限制偶尔没有满足或者剂量错过，治疗仍然可以继续。

结果

1、采用引产的阴道分娩

总共有30名非剖腹产分娩，采用不同的方式引产且有确定的分娩开始(DF01 组14名和安慰剂组16名)，见图1；产品限定的出生曲线，采用引产的阴道分娩。

时序检验显示出治疗组之间的显著性差异，p值为0.0041。通过Cox比例风险 模型评价的出生率比例为3.365(95％CI 1.428–8.341)。如图1中所示，相比于接 受引产但没有在分娩前接受DF01治疗的妇女，接受引产并且采用DF01预治疗的 妇女具有显著缩短的分娩时间。没有一个DF01治疗的妇女滞产，并且所有新生 儿都健康。

2、采用引产的阴道分娩，其中妇女接受前列腺素E2

在图1显示的30名非剖腹产分娩中，共有12名非剖腹产分娩采用前列腺素 E2引产(DF01组7名和安慰剂组5名)，见图2；产品限定的出生曲线。时序检 验显示出治疗组之间的显著性差异，p值为0.033(中值：DF01：5.7；中值：安慰 剂8.9)。结果表明DF01支持前列腺素促进宫颈成熟的能力，并且接受DF01和前 列腺素E2的妇女相比于仅接受前列腺素E2的妇女具有显著缩短的分娩时间。

3、采用引产的阴道分娩，其中妇女接受催产素

在30名采用引产的非剖腹产分娩中，妇女接受了催产素(DF01组7名和安 慰剂组11名)，见图3；产品限定的出生曲线。时序检验显示出治疗组之间的显著 性差异，p值为0.0336(中值：DF01：3.7；中值：安慰剂6.4)。这表明采用DF01 更少需要催产素，由于高剂量施用催产素的已知副作用(例如子宫肌层高收缩性) 因此采用DF01具有优势。

在引产情况下的治疗方案因此典型地将需要采用DF01的直接干预治疗，然后 是触发内源性催产素的释放(气球/胎膜破裂)或施用外源性催产素的方法。

实施例13

人子宫平滑肌细胞于培养中形成。已经确定用于细胞的采用钙指示剂染料 Fluo-4测量细胞内Ca²⁺的方法和采用共聚焦显微镜使肝细胞成像的方法。采用催 产素处理细胞，并且证明向细胞溶质的Ca²⁺流入。

效应是剂量依赖性的，最大效应已在0.05IU/ml催产素处。使用如实施例12 描述的DF01用于实验。

图4A显示单独的DF01不影响Ca²⁺浓度。然而，当DF01与催产素一起施用 时，相比于单独的催产素，获得了增加的和持续的Ca²⁺水平，见图4B和图4C。 剂量响应通路(见图4D)显示DF01的作用与Ca²⁺峰的数量相关。该结果证明了 DF01如何通过促进和维持催产素的作用而发挥子宫收缩的作用的机理。

通过采用10μM维拉帕米预孵育子宫平滑肌细胞30分钟进一步研究所述机 理。维拉帕米不影响由催产素或由催产素和DF01联合诱导的Ca²⁺流入。因此可以 推断不涉及L通道。

进一步研究主要的肌醇-3磷酸盐(IP3)的运输机理是否刺激内质网的Ca²⁺运 输。为了研究该通路，在与100μM浓度孵育30分钟之后，测试2-氨基乙氧二苯 基硼酸酯(2-APB)对Ca²⁺的作用。该抑制剂强烈减少催产素和催产素/DF01刺激的 Ca²⁺运输。

为了进一步表征催产素和DF01之间的相互作用，使用催产素受体抑制剂阿托 西班的作用，并且经受DF01的细胞增强了催产素对Ca²⁺运输的作用。10^-6M浓 度的阿托西班明显抑制催产素以及催产素/DF01的联合的作用。

这些结果表明DF01本身不影响Ca²⁺运输。然而，当与催产素联合时，注意到 明显的剂量响应增强的Ca²⁺运输的刺激。DF01稳定了催产素的作用，导致更长时 间的刺激。该作用不涉及L通道，但是涉及在催产素信号中刺激Ca²⁺流入的IP3。 催产素拮抗剂的作用提示对于DF01的作用在催产素受体水平起作用。

结论是根据本发明的DF01和化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素是有用的试剂， 其施用以直接改善子宫的子宫肌层收缩并且直接地和干预地治疗与不充分或缺乏 子宫肌层收缩相关的并发症。总之，DF01和类似的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝 素和硫酸肝素被认为在引产所需要的干预治疗中是直接有效的。

尽管本文详细描述了特别的实施方案，其是以实施例的形式完成的，仅用于 阐述目的，并且其并不意味着限制了附上的权利要求的范围。特别地，发明人预 期可以对本发明作出各种替换、变化、和修饰而不偏离由权利要求书所限定的本 发明的精神和范围。