高产吲哚-3-乙酸的重组细胞及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了高产吲哚-3-乙酸的重组细胞及其构建方法。采用本申请的重组细胞的构建方法构建的重组解淀粉芽孢杆菌菌株SQR9-E和重组枯草芽孢杆菌菌株168-E均能够表达出吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质。重组菌株SQR9-E和168-E中吲哚-3-乙酸的产量均高于每株菌株的对照。本发明的高产吲哚-3-乙酸的重组细胞及其构建方法可以有效提高重组菌株中吲哚-3-乙酸的产量，可广泛应用于农业生产领域。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中高产吲哚-3-乙酸的重组细胞及其构建方法与应用。

背景技术

吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，简称IAA)是一类含有一个不饱和芳香族 环和一个乙酸侧链的内源激素，属吲哚类化合物，又名茁长素、生长素、异生长素。 现已证实，吲哚-3-乙酸存在于细菌、真菌、藻类和许多高等植物中。在高等植物中, 它主要存在于生长旺盛的部位,如胚芽鞘、根尖、受精后的子房和幼嫩的种子等。虽然 在植物体内含量甚微,但参与了许多生理生化过程的调节与控制,具有十分广泛的生理 作用。从细胞水平看,它可以影响细胞的伸长、分裂和分化；从器官水平看,它可以影 响营养器官和生殖器官的生长、成熟和衰老。吲哚-3-乙酸的基本作用在于调节植物的 生长，不仅能促进生长，而且具有抑制生长和器官建成的作用。吲哚-3-乙酸在农业生 产领域具有广泛的用途，它能促进植物生根，提高农作物产量；用于木本和草本植物 的扦插(插枝)生根，以加速根的形成和提高植株生根的百分率。

微生物具有体积小、结构简单、生长繁殖快、代谢旺盛等特征，如能得到高效合 成吲哚-3-乙酸的微生物，将为吲哚-3-乙酸的生产提供新的途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何利用微生物生物合成吲哚-3-乙酸。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种重组细胞的构建方法。

本发明所提供的重组细胞的构建方法，包括向受体细胞中导入用于生物合成吲哚 -3-乙酸的DNA得到产吲哚-3-乙酸的重组细胞；所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA 编码吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相 关蛋白C这三种蛋白质；

所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A为下述A1)或A2)的蛋白质：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；

A2)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；

所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B为下述B1)或B2)的蛋白质：

B1)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的蛋白质；

B2)在B1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质；

所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C为下述C1)或C2)的蛋白质：

C1)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的蛋白质；

C2)在C1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由C1)衍生的蛋白质；

所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。

所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA，由吲哚-3-乙酸合成相关基因1、吲哚-3- 乙酸合成相关基因2和吲哚-3-乙酸合成相关基因3连接而成；所述吲哚-3-乙酸合成 相关基因1编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A；所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2 编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B；所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3编码所述吲 哚-3-乙酸合成相关蛋白C。

所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1为如下A11)或A12)或A13)所示的核酸分子：

A11)其编码序列是SEQ ID No.1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子或cDNA 分子；

A12)与A11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述吲哚-3- 乙酸合成相关蛋白A的cDNA分子或基因组DNA分子；

A13)在严格条件下与A11)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述吲哚-3-乙酸合 成相关蛋白A的cDNA分子或基因组DNA分子；

所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2为如下B11)或B12)或B13)所示的核酸分子：

B11)其编码序列是SEQ ID No.1的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子或cDNA 分子；

B12)与B11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述吲哚-3- 乙酸合成相关蛋白B的cDNA分子或基因组DNA分子；

B13)在严格条件下与B11)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述吲哚-3-乙酸合 成相关蛋白B的cDNA分子或基因组DNA分子；

所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3为如下C11)或C12)或C13)所示的核酸分子：

C11)其编码序列是SEQ ID No.1的第2587-4074位核苷酸所示的DNA分子或cDNA 分子；

C12)与C11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述吲哚-3- 乙酸合成相关蛋白C的cDNA分子或基因组DNA分子；

C13)在严格条件下与C11)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述吲哚-3-乙酸合 成相关蛋白C的cDNA分子或基因组DNA分子。

所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA为如下D1)或D2)或D3)所示的核酸分子：

D1)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子；

D2)与D1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述的吲哚-3- 乙酸合成相关蛋白A、所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和所述的吲哚-3-乙酸合成 相关蛋白C这三种蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

D3)在严格条件下与D1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述的吲哚-3-乙酸合 成相关蛋白A、所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋 白C这三种蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

上述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA，本领域普通技术人员可以很容易地采用已 知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的用于生物合成吲哚-3-乙酸的 DNA的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的用于生物合 成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码所述吲哚-3-乙酸 合成相关蛋白A、所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C 这三种蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本 发明的SEQ ID No.1具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同 一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两 个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的 同一性。

上述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的 溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中， 在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种重组细胞的构建方法。

本发明所提供的重组细胞的构建方法，包括对受体细胞进行S1)、S2)和S3)的 改造得到高产吲哚-3-乙酸的重组细胞的步骤：

S1)向所述受体细胞中导入所述的吲哚-3-乙酸合成相关基因1；

S2)向所述受体细胞中导入所述的吲哚-3-乙酸合成相关基因2；

S3)向所述受体细胞中导入所述的吲哚-3-乙酸合成相关基因3。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的吲哚-3-乙酸合成相关基因1或吲哚-3-乙酸合成相关基因2或吲哚-3- 乙酸合成相关基因3的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得 到的吲哚-3-乙酸合成相关基因1的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码所述的 吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A，或与吲哚-3-乙酸合成相关基因2的核苷酸序列具有75％ 或者更高同一性且编码所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B，或与吲哚-3-乙酸合成相 关基因3的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋 白C，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本 发明的SEQ ID No.1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更 高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ ID No.1的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％ 或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ ID No.1 的第2587-4074位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高， 或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进 行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其 可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每 次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上文中，所述微生物可为细菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。 所述革兰氏阳性细菌可为芽孢杆菌属细菌。所述革兰氏阴性细菌可为埃希氏菌属细菌。 进一步所述芽孢杆菌属细菌为解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。所述埃希氏菌属细菌 可为大肠杆菌(Escherichia coli)。所述解淀粉芽孢杆菌可为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168 和所述大肠杆菌(Escherichia coli)可为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21。

由上述重组细胞的构建方法构建的重组细胞也属于本发明保护的范围。

上述重组细胞的构建方法和上述重组细胞在生物合成吲哚-3-乙酸中的应用也属 于本发明的保护范围。

所述应用中，所述重组细胞以色氨酸为底物生产吲哚-3-乙酸。

实验证明，采用本申请的重组细胞的构建方法构建的重组解淀粉芽孢杆菌菌株 SQR9-E和重组枯草芽孢杆菌菌株168-E均能够表达吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、吲哚 -3-乙酸合成相关蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质。SQR9-E菌株的 吲哚-3-乙酸的产量是其受体菌株SQR9菌株的4.2倍，是空载体对照菌株SQR9-CK菌 株的4倍(SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸产量为42±2.41mg/L发酵液,SQR9菌株的吲哚 -3-乙酸产量为9.8±1.31mg/L发酵液，SQR9-CK菌株的吲哚-3-乙酸产量为10.5±1.08 mg/L发酵液)；168-E菌株的吲哚-3-乙酸的产量是其受体菌株168菌株的10倍，是空 载体对照菌株168-CK菌株的10倍(168-E菌株的吲哚-3-乙酸产量为22±2.32mg/L 发酵液,168菌株的吲哚-3-乙酸产量为2.2±0.30mg/L发酵液，168-CK菌株的吲哚-3- 乙酸产量为2.2±0.26mg/L发酵液)。本发明的高产吲哚-3-乙酸的重组细胞及其构建 方法可以有效提高重组菌株中吲哚-3-乙酸的产量，可广泛应用于农业生产领域。

附图说明

图1为重组载体pUBC19-P43-E示意图。

图2为重组菌株蛋白差异分析的变性聚丙烯酰胺凝胶。泳道1和泳道8为蛋白分 子量标准15-170KDa的Ladder，泳道2为168-CK菌株蛋白条带，泳道3为168-E菌 株蛋白条带，泳道4为BL21-CK菌株蛋白条带，泳道5为BL21-E菌株蛋白条带，泳道 6为SQR9-CK菌株蛋白条带，泳道7为SQR9-E菌株蛋白条带。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的解淀粉芽孢杆菌SQR9(Bacillus amyloliquefaciens SQR9)(Xu  Z,Shao J,Li B,Yan X,Shen Q,Zhang R.2013.Contribution of Baci llomycin  D in Bacillus amyloliquefaciens SQR9 to Antifungal Activity and Biofilm  Formation.Appl.Environ.Microbiol.79:808–815.)公众可从中国农业科学院农 业资源与农业区划研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可 作为其它用途使用。解淀粉芽孢杆菌SQR9(Bacillus amyloliquefaciens SQR9)在 下文中简称SQR9。

下述实施例中的枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)(Kunst F, Ogasawara N,Moszer I,etal.1997.The complete genome sequence of the  Gram-positive bacterium Bacillus subtilis.Nature 390:249–256.)公众可 从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得，该生物材料只为重复本发明的 相关实验所用，不可作为其它用途使用。枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168) 在下文中简称168。

下述实施例中的pUBC19(Zhang X-Z,Cui Z-L,Hong Q,Li S-P.2005.High-Level  Expression and Secretion of Methyl Parathion Hydrolase in Bacillus subtilis  WB800.Appl.Environ.Microbiol.71:4101–4103.)公众可从中国农业科学院农业 资源与农业区划研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作 为其它用途使用。

实施例1、生物合成吲哚-3-乙酸

一、高产吲哚-3-乙酸的重组菌体细胞的制备

高产吲哚-3-乙酸的重组菌体细胞的构建方法，包括向受体细胞中导入用于生物 合成吲哚-3-乙酸的DNA，得到产吲哚-3-乙酸的重组菌体细胞的步骤。其中，用于生 物合成吲哚-3-乙酸的DNA，由吲哚-3-乙酸合成相关基因1、吲哚-3-乙酸合成相关基 因2和吲哚-3-乙酸合成相关基因3连接而成；用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核 苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1。具体方法如下：

将pUBC19载体的BamHI和PstI识别位点间的序列替换为SEQ ID No.2所示的P43 启动子的核苷酸序列保持其它序列不变，得到重组载体pUBC19-P43。

将重组载体pUBC19-P43的KpnI和PstI识别位点间的序列替换为SEQ ID No.1 所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列，保持其它序列不变，得到重组 载体pUBC19-P43-E(图1)。pUBC19-P43-E可表达SEQ ID No.3所示的吲哚-3-乙酸合 成相关蛋白A、SEQ ID No.4所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和SEQ ID No.5所示 的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质。SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚 -3-乙酸的DNA编码SEQ ID No.3所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、SEQ ID No.4 所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和SEQ ID No.5所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白 C这三种蛋白质。SEQ ID No.1中，第1-1164位为吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A的编码 序列，第1165-2586位为吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B的编码序列，第2587-4074位为 吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C的编码序列。

采用化学方法将pUBC19-P43-E导入解淀粉芽孢杆菌SQR9菌株中，得到含有SEQ ID  No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株，将该菌株命 名为重组解淀粉芽孢杆菌SQR9-E(下文中简称SQR9-E菌株)；将pUBC19-P43-E导入 枯草芽孢杆菌168菌株中，得到含有SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的 DNA的核苷酸序列的重组菌株，将该菌株命名为重组枯草芽孢杆菌168-E(下文中简称 168-E菌株)；将pUBC19-P43-E导入大肠杆菌BL21菌株中，得到含有SEQ ID No.1所 示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株，将该菌株命名为重组 大肠杆菌BL21-E(下文中简称BL21-E菌株)；将pUBC19-P43导入解淀粉芽孢杆菌SQR9 菌株中，得到不含有SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序 列的重组菌株，将该菌株命名为重组解淀粉芽孢杆菌SQR9-CK(下文中简称SQR9-CK 菌株)，该菌株是SQR9-E的空载体对照菌株；将pUBC19-P43导入枯草芽孢杆菌168 菌株中，得到不含有SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序 列的重组菌株，将该菌株命名为重组枯草芽孢杆菌168-CK(下文中简称168-CK菌株)， 该菌株是168-E的空载体对照菌株；将pUBC19-P43导入大肠杆菌BL21菌株中，得到 不含有SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株， 将该菌株命名为重组大肠杆菌BL21-CK(下文中简称BL21-CK菌株)，该菌株是BL21-CK 的空载体对照菌株。

二、用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白质的提取及分析

1、不同处理的菌体细胞收集

将步骤一的BL21-CK、BL21-E、168-CK、168-E、SQR9-CK和SQR-E菌株分别接种 于含有3mL液体LB培养基的试管(卡那霉素的浓度为20μg/mL)中，过夜培养作为 种子液，分别得到BL21-CK、BL21-E、168-CK、168-E、SQR9-CK和SQR-E菌株的种子 液。将上述种子液分别以1％体积比的接种量接种于100mL含3mM色氨酸的Landy培养 基(在Landy培养基中加入色氨酸，使色氨酸的含量为3mM得到的液体即为含3mM色 氨酸的Landy培养基)中(Landy M,Warren GH,RosenmanM SB,Colio LG. 1948.Bacillomycin:an antibiotic from Bacillus subtilis active against  pathogenic Fungi.Exp.Biol.Med.67:539-541.)，22℃，90rpm避光培养72小时后 在4℃，8000g离心收集菌体，分别得到BL21-CK、BL21-E、168-CK、168-E、SQR9-CK 和SQR-E菌株的菌体。

2、用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白质的提取

将收集到的菌体用0.2M pH 6.8磷酸缓冲液洗涤，4℃，8000g离心10min收集菌 体，共进行上述操作三次。将收集到的菌体采用Bacteria Protein Extraction  Reagent(Thermo Scientific)试剂盒提取菌体蛋白。具体流程如下：离心沉淀的菌体 用10mL B-PER Reagent重悬，并且加入2μL 100mg/mL溶菌酶；其中BL21-CK和BL21-E 菌体置于室温反应10-15min，得到BL21-CK菌体裂解液和BL21-E菌体裂解液； SQR9-CK、SQR9-E、168-CK和168-E菌株置于室温反应45min，得到SQR9-CK菌体裂解 液、SQR9-E菌体裂解液、168-CK菌体裂解液和168-E菌体裂解液，将各裂解液15000g 离心5min，所获上清液即为菌株的蛋白粗提液，获得BL21-CK蛋白粗提液、BL21-E 蛋白粗提液、SQR9-CK蛋白粗提液、SQR9-E蛋白粗提液、168-CK蛋白粗提液和168-E 蛋白粗提液。将各菌株的蛋白粗提液置于-70℃冰箱中保存。

3、BCA法测定蛋白总量

蛋白定量采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京鼎国生物技术有限责任公司)，具体 流程如下：根据标准品和样品的数量，将试剂A(BCA碱性溶液)和试剂B(硫酸铜溶 液)以50：1(V/V)的比例混合配制BCA工作液；将0、1、2、4、6、8、10μL的标 准BSA蛋白溶液(1mg/mL)分别加入96孔板的不同孔中，并加ddH₂O使得每孔的体积 为10μL，每个浓度设置3个复孔。分别取10μL稀释的待测蛋白样品加入96孔板的 不同孔中，每个样品设置3个复孔。向BSA蛋白标准品孔和待测样品孔中每孔分别加 入200μL配置好的BCA工作液，充分混匀后于37℃反应30min，反应结束后将96孔 板冷却至室温，采用酶标仪测定各样品的吸光度OD₅₆₂。以BSA蛋白标准品浓度作为横 坐标，吸光度值作为纵坐标制作标准曲线。根据标准曲线，计算各样品的蛋白质含量。

4、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

SDS-PAGE凝胶制备：先灌制浓度为10％的分离胶，浓度为10％的分离胶包含5.3mL 30％Acr/Bis(29:1)贮存液、4.0mL下层缓冲液、0.8mL 10％APS、0.008mL TEMED 和6.7mL去离子水，分离胶灌好后置于37℃凝固30min；待分离胶凝固后灌制浓度为 5％的浓缩胶，浓度为5％的浓缩胶包含0.75mL 30％Acr/Bis(29:1)贮存液、1.25mL 上层缓冲液、0.015mL 10％APS、0.005mL TEMED和3.0mL去离子水，浓缩胶灌好后置 于室温凝结15-20min。

在电泳槽内加入新鲜配置的1×电极缓冲液。根据待测蛋白浓度取适量的待测蛋 白样品，加入10μL样品缓冲液混合均匀，然后去离子水补齐至30μL，各个样品的 蛋白质质量浓度均相同，将样品进行沸水浴5min，14000rpm离心5min后上样，每个 泳道的上样体积均相同。首先采用80V的电压使样品先从浓缩胶迁移至分离胶，随后 采用100V的电压使得样品跑至分离胶底部。

凝胶的染色及脱色：电泳结束后，将凝胶从玻璃板上轻轻拨下，放入已加入适量 固定液的干净玻璃皿内，固定30min，固定结束后倒出固定液加入适量考马氏亮蓝 R-250染色液，震荡染色1h，然后倒出染色液加入脱色液进行震荡脱色，每隔10min 更换脱色液，重复脱色洗脱四次，之后加脱色液连续脱色4-8h，期间更换脱色液3-4 次，脱色完全后进行扫描拍照。

吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A的分子量为43KDa，吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B的 分子量为53KDa和吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C的分子量为54KDa，图2中显示含有用 于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株BL21-E、SQR9-E和168-E均 能够表达出吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和吲哚-3-乙酸 合成相关蛋白C。相对于不含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组 菌株，含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株BL21-E、SQR9-E 和168-E表达出的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和吲哚 -3-乙酸合成相关蛋白C的含量均明显增多，168-E菌株蛋白条带中在约43KDa处明显 比168-CK菌株增强，而由于菌株在55KDa大小的蛋白很多，只能推测168-E菌株与 168-CK菌株相比能更多的表达55KDa左右的蛋白；与BL21-CK菌株相比，在菌株BL21-E 蛋白条带中能清晰分辨出在43KDa、54KDa和53KDa大小处条带增强；在SQR9-E菌株 蛋白条带中可清晰分辨出在43KDa、54KDa和53KDa大小处条带比SQR9-CK菌株蛋白条 带增强。

三、吲哚-3-乙酸产量检测

将SQR9菌株、SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168菌株、168-E菌株和168-CK菌株 分别接种于含有3mL液体LB培养基的试管(卡那霉素的浓度为20μg/mL)中，过夜 培养作为种子液，分别得到SQR9菌株、SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168菌株、168-E 菌株和168-CK菌株的种子液。将上述种子液分别以1％体积比的接种量接种于100mL 含3mM色氨酸的Landy培养基(在Landy培养基中加入色氨酸，使色氨酸的含量为3mM 得到的液体即为含3mM色氨酸的Landy培养基)中，SQR9菌株、SQR9-E菌株和SQR9-CK 菌株的接种量以菌体含量计相同，168菌株、168-E菌株和168-CK菌株的接种量以菌 体含量计相同。在22℃，90rpm避光培养72小时，分别得到SQR9-E菌株、SQR9-CK 菌株、168-E菌株和168-CK菌株的发酵液。实验设三次重复，每次重复每个菌株均接 入10个装有100mL含3mM色氨酸的Landy培养基的容积为500mL三角瓶在上述条件下 进行发酵。

分别将各菌株的100mL发酵液在4℃，8000rpm离心10min去除菌体细胞，收集 SQR9菌株、SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168菌株、168-E菌株和168-CK菌株的上清 液。将各菌株的上清液分别倒入不同的无菌三角瓶中，用2M HCl溶液调节各菌株的上 清液pH值至2.0，然后加入与上述三角瓶中等体积的乙酸乙酯萃取三次，萃取结束后 8000rpm，4℃离心10min，将各菌株的乙酸乙酯相37℃旋转蒸发获得旋转蒸发后的样 品。将各菌株的旋转蒸发后的样品分别用1mL甲醇溶解，过0.22μm滤膜，放入-20℃ 冰箱保存。甲醇溶解的样品采用HPLC进行定量分析，HPLC的分析条件为：采用Agilent TC-C18色谱柱，柱温25℃，流动相为A(甲醇)和B(0.1％乙酸)的体积比为60：40， 进样量为10μL，流速为0.4mL/min，紫外吸收波长为220nm。HPLC分析中，以吲哚-3- 乙酸(Sigma，CAS NO:87-51-4)为标准品，根据标准品的保留时间定性和采用标准 曲线法(外标法)进行定量分析。

试验所有数据采用SPSS12.0(SPSS Inc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理 统计。

不同菌株的吲哚-3-乙酸产量如表1，结果表明含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的 DNA的核苷酸序列的重组菌株SQR9-E和168-E中吲哚-3-乙酸的产量均高于每株相应 的受体菌株和空载体对照菌株。SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸产量是SQR9菌株的4.2倍， 是SQR9-CK菌株的4倍(SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸产量为42±2.41mg/L发酵液,SQR9 菌株的吲哚-3-乙酸产量为9.8±1.31mg/L发酵液，SQR9-CK菌株的吲哚-3-乙酸产量 为10.5±1.08mg/L发酵液)；168-E菌株合成吲哚-3-乙酸的产量是168菌株的10倍， 是168-CK菌株的10倍(168-E菌株的吲哚-3-乙酸产量为22±2.32mg/L发酵液,168 菌株的吲哚-3-乙酸产量为2.2±0.30mg/L发酵液，168-CK菌株的吲哚-3-乙酸产量为 2.2±0.26mg/L发酵液)。

表1、各菌株的吲哚-3-乙酸产量

注：各列数值后面的英文字母表示差异显著程度，相同字母的处理间在0.05水平 无显著差异，字母不同的处理间在0.05水平有显著差异。