一种提高大豆在盐碱地适应能力的方法

摘要

本发明公开了一种提高大豆在盐碱地适应能力的方法，所述方法为：将营养土与珍珠岩混匀，即为菌肥基质，再将根瘤菌液与菌肥基质混合，拌匀，即为根瘤菌菌肥；将大豆幼苗移栽至根瘤菌菌肥中，在23℃～27℃、光照度2000～2500lx、光照12h/d的条件下培育；本发明利用根瘤菌肥，促使大豆在含高浓度盐的土壤中整株鲜重增加22.50～125.00％；促进大豆耐盐相关基因表达水平显著提高，过氧化物酶APX，SOD等mRNA表达水平提升3～8倍。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种盐碱地大豆生长方法，特别涉及一种利用根瘤菌肥促 进大豆在盐碱地生长的方法。

(二)背景技术

我国是大豆种植的发源地，距今已有3000多年的栽培历史。近年来， 土壤的盐碱化问题已日益威胁着人类赖以生存的有限土地资源。然而随着 国民经济的发展和人民生活水平的提高，加工业、食品业和畜牧业的发展， 我国对植物蛋白的需求急剧增加，目前国内市场在供求方面存在巨大的缺 口，只能通过大量进口美国和南美的大豆弥补。大豆产量的不足已经成为 “立足于基本靠国内保障粮食供给”国策的重要障碍，也已经成为我国经 济和社会发展在“实现小康”后的新软肋，对于今后我国国民经济发展的 不利影响将逐步显现。增加大豆种植面积无疑是大豆增产最有效的途径之 一，但由于种植大豆要与粮争地，简单依赖扩增原有肥沃田地补充大豆种 植面积的方式显然不可持续。开发利用盐碱地是大豆增产的重要趋势，同 时也对现有的大豆栽培技术提出新的挑战。本技术力求探索出一条无转基 因疑虑的微生物肥料辅助的栽培技术，在保障大豆营养品质的前提下，提 高植株的耐盐碱能力。

微生物菌肥促进植物生长的研究是农业微生物领域的一个研究热点。 能与豆科植物共生固氮，根瘤菌常被探索作为豆类作物的微生物肥料提高 其产量。植物耐盐研究揭示查尔酮——类黄酮代谢途径的关键酶是重要的 响应基因，能调节拟南芥、大豆等植物的耐盐能力。而根瘤菌——豆科植 物共生体系中查尔酮-类黄酮代谢途径也是显著上调表达的核心信号途 径。显然，根瘤菌——豆科植物生物固氮和植物耐盐响应机制有着内在的 联系，但目前国内外尚未见相关研究的报道。发明人经过了长期的努力， 研发了一种根瘤菌肥料及其相应使用技术，制作工艺简单，成本低廉，且 能显著提高大豆在盐碱地的适应能力。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种根瘤菌肥及其提高大豆在盐碱地适应能力的 应用，解决大豆在盐碱地适应能力的问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种提高大豆在盐碱地适应能力的方法，所述方法 为：

一种提高大豆在盐碱地适应能力的方法，所述方法为：(1)将根 瘤菌(Bradyrhizobium)菌落接种于TY/Ca²⁺培养液中，在28～30℃，225 rpm摇床孵育8～12小时，获得母液；TY/Ca²⁺培养液组成：4.9～5.1g/L 胰蛋白胨，2.9～3.1g/L酵母提取物，5～7mmol/L的CaCl₂，pH＝7.1 ～7.3，溶剂为水；优选TY/Ca²⁺培养液组成：5g/L胰蛋白胨，3g/L酵 母提取物，6mmol/L的CaCl₂，pH＝7.2，溶剂为水；

(2)将步骤(1)母液以终体积浓度0.1～0.5％的接种量接种至 TY/Ca²⁺培养液中，在20～30℃，200～225rpm摇床增殖至OD₆₀₀值 达到1.0～1.2，获得根瘤菌菌液；

(3)将营养土与珍珠岩以体积比2.5～3.5：1混匀，即为菌肥基 质，然后再将步骤(2)制备的根瘤菌液用纯净水稀释至OD600为0.001 ～0.005，稀释后的根瘤菌液与菌肥基质以体积比1：4～5混合，拌匀， 即为根瘤菌菌肥；

(4)将大豆幼苗移栽至步骤(3)的根瘤菌菌肥中，在23℃～27 ℃、光照度2000～2500lx、光照12h/d的条件下培育。

进一步，步骤(2)所述母液终体积浓度为0.1～0.2％。

进一步，步骤(3)所述营养土为水藓泥炭土，更优选德国进口 KLASMANN水藓泥炭土。

进一步，步骤(3)所述营养土与珍珠岩体积比为1：2.8～3.0。

进一步，步骤(3)所述根瘤菌液用纯净水稀释至OD600为0.001～ 0.002，稀释后根瘤菌液与菌肥基质以体积比1：4.0～4.1。

进一步，步骤(4)所述大豆幼苗培育条件为：温度24℃～25℃、 光照度2400～2500lx，光照12h/d。

进一步，步骤(4)所述大豆幼苗的培养方法为：将大豆种子先用漂 白水(优选市售的立白漂白水)浸泡5～10分钟，再用自来水冲洗5分 钟；然后用体积浓度75％乙醇水溶液消毒5分钟，再用双蒸水冲洗3遍， 0.1％升汞消毒10分钟，继而用无菌水清洗5遍，至残留的升汞清洗干 净，用灭菌过的吸水纸将种子表面的水吸干，即为灭菌后的种子；将灭菌 后的种子放置于垫有湿润无菌滤纸的培养皿上，37℃黑暗条件下培养2～3 天，直至种子萌发，两片子叶打开，芽长2～3厘米，获得大豆幼苗。

进一步，所述大豆种子为耐盐大豆Wenfeng07或盐敏感大豆Union 85140(中国农科院种质资源库编号)。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明利用根瘤菌肥， 促使大豆在含高浓度盐(高达150mM NaCl)的土壤中整株鲜重增加 22.50～125.00％；促进大豆耐盐相关基因表达水平显著提高，过氧化物酶 APX，SOD等mRNA表达水平提升3～8倍。

(四)附图说明

图1为实施例2中施用根瘤菌肥后，大豆在含不同浓度NaCl盐的土 壤中生长情况。

图2为施用根瘤菌肥后大豆在过氧化物酶的mRNA表达水平热值图。

图3为实施例3中施用根瘤菌肥后，大豆在含不同浓度NaCl盐的土 壤中生长情况。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1根瘤菌菌液

(1)将根瘤菌菌落接种于TY/Ca²⁺培养液中，在30℃，225rpm摇 床孵育12小时，获得母液；TY/Ca²⁺培养液组成：5g/L胰蛋白胨，3g/L 酵母提取物，6mmol/L的CaCl₂，pH＝7.2，溶剂为水。

(2)将步骤(1)种子液以体积浓度0.1％的接种量接种至TY/Ca²⁺培养液中，在30℃，225rpm摇床增殖12小时，直至OD₆₀₀值达到1.0， 获得根瘤菌菌液。

实施例2

1)取颗粒饱满，粒径大小一致的耐盐大豆Wenfeng07品种50颗， 用立白漂白水浸泡5分钟，用自来水冲洗5分钟。然后用体积浓度75％乙 醇水溶液消毒5分钟，再用双蒸水冲洗3遍，0.1％升汞消毒10分钟， 继而用无菌水清洗5遍，至残留的升汞清洗干净，用灭菌过的吸水纸将种 子表面的水吸干，即为灭菌后的种子；

2)将灭菌过的种子放置于垫有湿润无菌滤纸的培养皿上，37℃黑暗 条件下培养2～3天，直至种子萌发，两片子叶打开，芽长2～3厘米，获 得大豆幼苗；

3)将实施例1制备的根瘤菌菌液用纯净水稀释至OD₆₀₀为0.001，将 步骤2)获得的大豆幼苗浸泡于稀释过的根瘤菌菌液中，30℃，225rpm 摇床孵育30分钟；

4)将德国进口KLASMANN水藓泥炭土与珍珠岩按照3：1的体积 比混匀，即为菌肥基质。然后将经过步骤3)稀释过的OD₆₀₀为0.001的 根瘤菌液与菌肥基质按照体积比1：4混合，拌匀，即为根瘤菌菌肥。

5)将步骤3)浸染过根瘤菌的大豆幼苗移植于步骤4)制备的根瘤菌 菌肥(作为移栽基质)中，放在培养室培养，培养温度(25±2)℃，光 照度2000lx，光照12h/d，培养3天后，向移栽基质中浇灌含100mmol/L  NaCl的TY/Ca²⁺培养液，继续培养3周，获得大豆苗；同样条件下，以 含0mmol/L、200mmol/L和300mmol/L NaCl的TY/Ca²⁺培养液进行实验， 同时以未施用根瘤菌肥，含0mmol/L、100mmol/L、200mmol/L和300 mmol/L NaCl的TY/Ca²⁺培养液作为对照。

6)将步骤5)培养得到的大豆苗，进行形态指标、生理生化指标和 mRNA表达水平等分子指标的测定。

植株鲜重称量：大豆幼苗采收后，洗净，用吸水纸吸干表面水分，立 即用分析天平上称重。

蛋白酶mRNA表达水平测定：称取大豆根1克，在液氮中研成粉末。 趁粉末自然液化之前，迅速转入1.5mL离心管，采用康为试剂RNA提取 试剂盒进行总RNA抽提，然后取3μg总RNA，采用康为试剂反转录试 剂盒获得cDNA，Real-time PCR实验参考康为试剂SYBR Green说明书， 在Step one plus仪器上进行定量分析。

过氧化物酶活性测定：将0.5克鲜样加入3ml预冷的pH 7.8磷酸缓 冲液研磨成匀浆，转入25ml容量瓶，容量瓶置于5℃冰箱中静置10min， 取上清液在4000r/min下离心15min,上清液(即粗提酶液)与愈创木酚反 应，测定OD470吸光值变化。

测定结果为，相比未施用根瘤菌的样品，施用根瘤菌肥的幼苗植株鲜 重：在100mM NaCl胁迫下提高22.50％±3.66％，在200mM NaCl胁 迫下提高125.00％±19.67％，在300mM NaCl胁迫下提高58.33％±15.33 ％；过氧化物酶活性在100mM NaCl胁迫下提高51.23％±7.11％，在200 mM NaCl胁迫下提高56.76％±5.43％，在300mM NaCl胁迫下98.16％± 12.01％；过氧化物酶(GmCC1～GmCC10)mRNA表达水平在100mM NaCl 胁迫下提高2～5倍，在200mM NaCl胁迫下提高8～12倍，在300mM NaCl 胁迫下13～15倍。结果见图1和图2所示。结果表明添加根瘤菌肥植株 耐盐能力显著增强，施用根瘤菌肥后大豆在过氧化物酶的表达水平显著提 高2～15倍。

实施例3：

具体步骤同实施例2过程，不同的是大豆品种采用主栽的盐敏感品 种Union 85140，其他操作同实施例2，结果见图3所示，结果表明添加 根瘤菌肥植株耐盐能力显著增强。

最后，还需注意的是，以上实施例子仅是本发明的若干个具体实施例 子，本发明不限于上述的实施例，还有许多变形，本领域相关的人员能从 本发明内容中直接导出或者联想出的所有变形，均认为是本发明的保护范 围。