一种具有肿瘤主动靶向及pH敏感性细胞穿膜能力的新型多肽

摘要

本发明提供了一种既能主动靶向肿瘤细胞高表达的整合素受体，同时又能高效介导入胞的新型多肽。所述的新型多肽TR（c(RGDfK)- AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys）是由特异性靶向整合素受体的环状RGD肽（c(RGDfK)） 和非特异性的pH敏感性细胞穿膜肽TH(AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys)通过共价键连接而成。将该新型多肽TR修饰于载药系统表面，其能介导载药系统更加高效地传递到肿瘤内部，从而更加有效地治疗肿瘤。

说明书

技术领域

本发明涉及药物制剂技术领域。具体地说，本发明涉及一种既有主动靶向肿瘤细胞高表达的整合素受体的能力又具有pH敏感性细胞穿膜能力的新型多肽。该新型多肽经修饰于载药系统表面用于介导载药系统高效主动靶向高表达整合素受体的肿瘤及高效介导其入胞，达到提高肿瘤治疗效果的目的。

背景技术

1. 癌症的发病率和死亡率近年来呈逐年上升的趋势，已经严重威胁了人类健康。尽管有多种治疗癌症的手段，但目前最为常用的仍然是化疗。由于化疗药物往往在正常组织和肿瘤组织间缺乏选择性，因此其治疗效果和应用范围常受到限制。目前，纳米载药系统的发展给靶向肿瘤治疗带来新的突破。

2. 相对于普通的载药系统，特异性配体修饰的载药系统增加了其在肿瘤部位的蓄积，同时降低了在非靶向性器官中的蓄积（如肝，脾等）。其中,整合素（integrin）是一类细胞黏附受体分子，在所有的有核细胞表面均广泛表达，其在体内能够介导细胞与细胞之间，以及细胞与细胞外基质的互相黏附。整合素是由α和β亚基通过非共价键结合形成的异二聚体，在脊椎动物体内，整合素有18种α亚基和8种β亚基，其可以组成约24种不同的异二聚体结构。其中整合素α_vβ₃在神经胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌等多种肿瘤细胞及肿瘤相关的内皮细胞表面高度表达，与肿瘤的血管发生、肿瘤转移及肿瘤的抗放射治疗密切相关。因此，整合素α_vβ₃常被用作肿瘤靶向的特异性靶点。已有研究证实，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）的三肽序列能够特异性识别含α_v亚基的整合素家族。进一步的研究也已证实，具有环状结构的RGD能够高度地与整合素α_vβ₃、α_vβ₅结合。然而，特异性配体（如RGD、Tf等）虽能主动靶向高表达相关受体的肿瘤细胞，但受制于优于受体的饱和效应不能高效地介导载药系统进入肿瘤细胞。

3. 另一方面，细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPPs)是一类具有很强的穿透细胞膜能力的短肽。穿膜肽在生理条件下带有正电荷，它既可以从生物体内提取，也可以通过人工合成。目前，细胞穿膜肽已经成功地应用于蛋白、多肽、核苷酸及小分子物质的递释，这类载药系统的优势在于穿膜效率高。但因为其本身具有下述两个特征而不能广泛地被使用：①细胞穿膜肽带正电荷的特性使得其在血液循环过程中容易与调理蛋白结合从而使所介导的载药系统快速地被网状内皮系统清除；②细胞穿膜肽在正常的组织以及肿瘤之间不具有选择性。

4. 相对于正常的细胞，肿瘤细胞是一种快速增长的细胞，在生长过程中需要消耗大量的氧气和营养，产生过剩的乳酸，导致肿瘤部位的pH偏酸。另外，正常组织中的微血管内皮间隙致密、结构完整，载药系统不易透过血管壁，而实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成载药系统具有选择性高通透性和滞留性，这种现象被称作实体瘤组织的高通透性和滞留效应，简称EPR效应。

5. 为屏蔽穿膜肽的正电性，最新的研究利用组氨酸的修饰使穿膜肽获得pH敏感性。在Biomaterials [34 (2013) 7980-7993]杂志上，本课题组介绍了一种肿瘤微环境敏感的TH肽修饰的脂质体在治疗肿瘤方面的应用。TH肽上的组氨酸的等电点Ip约为6.5, 因此TH肽修饰的脂质体在血液循环中（pH7.4）带负电荷从而延长了TH肽修饰的脂质体在血液中的循环时间；当通过EPR效应被动靶向蓄积到肿瘤部位时，在肿瘤的微酸环境中（pH6.2~pH6.8）TH肽中的组氨酸被质子化而带正电荷，使得TH肽在微酸环境中恢复穿透细胞膜的能力，即转变为激活的细胞穿膜肽。TH肽的上述特性增强了TH肽修饰的脂质体在肿瘤部位的蓄积以及进入肿瘤深部的能力。然而，在肿瘤部位具有较强细胞穿膜能力的TH肽却不具有在正常细胞和肿瘤细胞间的选择性，仍然会造成一定的副作用。

6. 因此，我们希望构建一种既具有主动靶向能力，又能高效介导入胞的新型多肽。本发明拟将环RGD与pH敏感的细胞穿膜肽TH通过共价键链接起来，达到既有主动靶向高表达整合素受体的肿瘤，同时又能高效介导入胞的能力。

发明内容

1. 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种既能主动靶向肿瘤高表达的整合素受体又有pH敏感性细胞穿膜能力的新型多肽，可修饰于载药系统表面用于介导载药系统主动靶向高表达整合素受体的肿瘤及高效介导其入胞。

2. 具体而言，其特征在于，新型多肽TR的c(RGDfK)部分能主动靶向肿瘤高表达的整合素 受体。新型多肽TR的TH部分上的组氨酸等电点Ip约为6.5，在肿瘤微酸环境中TH肽中的组氨酸被质子化而具有穿过细胞膜的能力；而在体内循环过程中，组氨酸不被质子化使得TH肽穿过细胞膜的能力被屏蔽。因此，新型多肽TR既具有受体介导入胞又具有与带负电荷的肿瘤细胞静电吸附高效介导入胞的双重功效，经其修饰的载药系统能高效地进入肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。

3. 本发明中，新型多肽TR的氨基酸序列为c(RGDfK)-AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys。

本发明的突出优点是，新型多肽TR在肿瘤微酸环境中，既可以通过高表达的整合素受体介导入胞，同时又可以通过静电吸附作用入胞，这两种作用同时发挥协同效应。将新型多肽TR修饰于载药系统表面后用于介导载药系统主动靶向肿瘤的高表达的整合素受体及高效介导其入胞。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的新型多肽TR修饰的载药系统进行详细的描述。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

1. 图1为本发明的结构示意图。

2. TR肽修饰的载药系统的表征，图2（A）TR修饰的脂质体（TR-Lip）在微酸环境中穿膜能力转换的示意图； （B） TR修饰的纳米粒 （TR-NPs） 的粒径分布； （C） TR修饰的胶束（TR-micellar）在不同pH条件下的电位分布； （D）TR修饰的脂质纳米粒复合物（TR-L-NPs）与整合素α_vβ₃的结合能力。

3. 图3为TR修饰的脂质体 （TR-Lip） 在B16F10细胞（高表达整合素α_vβ₃）上的摄取能力。

4. 图4（A）包载DiR的经TR肽修饰的纳米粒 (DiR-TR-NPs)在荷瘤小鼠体内的分布。    （B）载DiD的经TR肽修饰的脂质纳米粒复合物(DiD-TR-L-NPs)穿透肿瘤的深度。

具体实施例

实施例1

TR肽修饰的脂质体（TR-Lip）的制备以及表征

采用薄膜分散法制备脂质体。分别称取1.2 mg大豆磷脂、0.4 mg胆固醇、0.05 mg单甲氧基修饰的聚乙二醇和1 mg TR肽修饰的聚乙二醇，将其全部溶于氯仿/甲醇混合液中，旋转，蒸发，形成薄膜层，置于真空干燥器中过夜，使得有机溶剂充分挥发干净。加入1 ml Hepes缓冲液（pH 7.4），置于摇床（180 rpm×30 min，37 ℃）震摇后，用超声仪超声（5次×5 s×15 s）后，得到粒径均一的TR-Lip。取100 μl TR-Lip稀释10倍，采用Zetanano粒径仪测其粒径分布以及电荷分布。TR-Lip的粒径在150 nm左右。在pH 7.4条件下，TR-Lip的Zeta电位在-7 mV左右；在pH 6.5条件下，TR-Lip的Zeta电位在+5 mV左右。用表面等离子共振仪（SPR）测定不同多肽修饰的脂质体与整合素的结合力，结果证明TR-Lip与整合素的结合能力最强。

实施例2

TR肽修饰的纳米粒（TR-NPs）的制备以及表征

采用W/O/W型乳化-溶剂蒸发法制备TR肽修饰的纳米粒。将一定量的PLA-PLL-TR溶于二氯甲烷中构成有机相，以纯水为水相，按一定比例混合有机相与水相，超声形成初乳。将初乳倾入含泊洛沙姆F-18乳化剂的外水相中，继续超声得到复乳后置烧杯中，搅拌挥尽有机溶剂得到纳米粒胶体分散体系。采用Zetanano粒径仪测其粒径分布以及电荷分布；用SPR仪测定其与整合素的结合力。TR-NPs的粒径为90 nm 左右。 在pH 7.4条件下，TR-NPs的Zeta电位为-7.5 mV左右；在pH 6.5条件下，TR-NPs的Zeta电位为+6 mV左右。用表面等离子共振仪（SPR）测定不同多肽修饰的纳米粒与整合素的结合力，，TR-NPs与整合素的结合能力最强。

实施例3

TR肽修饰的胶束（TR-micelle）的制备以及表征

分别取10 mg DSPE-PEG-TR 与20 mg DSPE-PEG-OMe溶于无水氯仿，旋转蒸发成膜后减压干燥过夜，加入20 mM Hepes缓冲液（pH 7.4）5 ml，37 ℃水浴振荡20 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤，得到TR肽修饰的聚合物胶束 （TR-micelle）。采用Zetanano粒径仪测其粒径分布以及电荷分布；用SPR仪测定其与整合素的结合力。TR-micelle的粒径为112 nm左右。在pH 7.4条件下，TR-micelle的Zeta电位为-8 mV左右；在pH 6.5条件下，TR-micelle的Zeta电位为+4 mV左右。用表面等离子共振仪（SPR）测定不同多肽修饰的胶束与整合素的结合力，TR-micelle与整合素的结合能力最强。

实施例4

TR肽修饰的脂质纳米粒（TR-L-NPs）的制备及表征

将卵磷脂和DSPE-PEG-TR溶于4 %的乙醇溶液中，加热到65 ℃。将含20%的PLGA乙腈溶液逐滴加入到上述预热的脂质溶液中，轻轻的振荡，然后涡旋3 min。继续搅拌2 h，使得纳米粒充分地完成自主装，然后在37 ℃下减压蒸发除去有机溶剂。用纯水重悬TR-L-NPs，使得最终浓度是1 mg/ml。采用Zetanano粒径仪测其粒径分布以及电荷分布；用SPR仪测定其与整合素的结合力。TR-L-NPs的粒径为 100 nm左右。在pH 7.4条件下，TR-L-NPs 的Zeta电位为-6.5 mV左右；在pH 6.5条件下，TR-L-NPs 的Zeta电位为+5.5 mV左右。用表面等离子共振仪（SPR）测定不同多肽修饰的脂质纳米粒与整合素的结合力，TR-L-NPs与整合素的结合能力最强。

实施例5

TR修饰的脂质体 （TR-Lip） 在B16F10细胞（高表达整合素α_vβ₃）上的摄取

将B16F10 按密度5×10⁵ 个/孔细胞接于6孔板中，在孵箱中孵育24 h后，将载CFPE的四种脂质体在不同的pH（pH 7.4 和pH 6.5）条件下孵育2 h，弃培养液，用冷PBS洗两次，2%的胰酶消化得到单个细胞后，培养基终止消化。加入0.5 ml的PBS使成单个悬浮的细胞，用细胞流式仪检测细胞摄取量。如图3所示，载CFPE的TR肽修饰的脂质体（CFPE-TR-Lip）在pH 6.5条件下进入高表达整合素受体的细胞的能力最强。

实施例 6

载DiR的TR肽修饰的纳米粒（ DiR-TR-NPs）在荷瘤小鼠体内的分布以及载DiD的TR肽修饰的脂质纳米粒复合物（ DiD-TR-L-NPs）穿透肿瘤的能力

将每只C57/BL6的左背部接种 2 ×10⁵个B16F10细胞，一周后即可看到70 mm³的肿瘤，待用。将载DiR染料的长循环纳米粒（PEG-NPs）、RGD修饰的纳米粒（RGD-NPs）、TH修饰的纳米粒（TH-NPs）和TR-NPs经过尾静脉注射到荷瘤小鼠内，24 h后，活体成像仪检测不同载体在荷瘤小鼠的肿瘤部位的蓄积量。如图4（A）所示，相对于其他三组的纳米粒，DiR-TR-NPs在荷高表达整合素的B16F10肿瘤的C57小鼠的肿瘤部位的蓄积能力最强。

按如上方式建荷瘤小鼠模型，将载DiD染料的长循环脂质纳米粒复合物（PEG-L-NPs）、RGD修饰的脂质纳米粒复合物（RGD-L-NPs）、TH修饰的脂质纳米粒复合物（TH-L-NPs）和TR修饰的脂质纳米粒复合物（TR-L-NPs）经过尾静脉注射到荷瘤小鼠内，24 h后，将小鼠处死，取出肿瘤，做成切片，观察不同载体穿透肿瘤的能力。如图4（B）所示，DiD-TR-L-NPs穿透肿瘤的能力最强。