氧化型低密度脂蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的应用

摘要

本发明提供了氧化型低密度脂蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化中的应用，实验证明，在骨髓间充质干细胞的培养基中添加浓度为5μg/mL的氧化型低密度脂蛋白，BMMSCs具有显著的细胞增殖，并能检测到心肌样细胞特异性蛋白和心肌细胞标志性分子的表达，表明骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化，其心肌样细胞转化率高达30％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的方法，特别是 涉及氧化型低密度脂蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的应用。

背景技术

骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)是 存在于骨髓内的一类成体干细胞，具有很强的自我更新能力和多向分化潜能， 在特定的生理环境下或体外诱导培养条件下，可向成骨、软骨、脂肪、成肌、 神经和内皮等多种成体细胞分化。BMMSCs是目前在组织工程和再生医学中应 用最广泛的种子细胞之一，已被临床上应用于神经系统和心血管系统疾病的治 疗。动物实验研究表明，将BMMSCs移植到特定组织和器官中，其可向该组织 和器官的功能细胞分化。

心肌细胞是不可再生细胞，一旦死亡，只能靠邻近组织的心肌成纤维细胞 的增殖来补充。然而，成纤维细胞会分泌大量的胶原蛋白，这将造成心肌纤维 化，会导致心肌功能下降，严重者可导致心力衰竭。而利用干细胞的心肌分化 特性和干细胞移植来治疗心肌梗死，已成为心血管和干细胞领域的一个热点问 题。近年来，有关BMMSCs向心肌细胞分化以及移植治疗心肌梗死的研究已成 为国内外研究的重点课题之一。相关研究显示，移植到心肌梗死部位的BMMSCs 可通过向心肌细胞分化而补充部分损失的心脏固有心肌细胞，不同程度地改善 心脏功能，缩小心肌梗死面积。但是，目前有关干细胞移植治疗心肌梗死仍存 在诸多问题，其中最主要的是向心肌细胞转化效率较低的问题。相关研究显示， 移植到心肌梗死部位的干细胞，包括脐带来源的干细胞、脐带血来源的干细胞 和骨髓间充质干细胞，均不能产生有效治疗数量的心肌细胞。

研究显示，血管紧张素II(Angiotensin II，Ang II)可促进BMMSCs向心肌 样细胞转化，5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)也可通过活化细胞外信号调节 激酶1/2(Extracellular Signal-Regulated Protein 1/2，ERK1/2)而促进BMMSCs 向心肌样细胞转化。然而，采用血管紧张素II体外诱导BMMSCs向心肌样细胞 分化时，存在用量大、成本高、诱导转化效率低等问题，而且血管紧张素II在 体内容易引发高血压等副作用。5-氮杂胞嘧啶核苷则属于化学诱导剂，会对机体 产生不良刺激作用，例如肝功能损伤、白细胞减少等，此外，5-氮杂胞嘧啶核苷 在临床上亦用作化疗药物，其容易引起细胞凋亡。

发明内容

基于此，有必要针对现有技术所存在的问题，提供一种诱导转化效率高、 副作用少的诱导剂，以高效地诱导BMMSCs向心肌样细胞定向分化。

本发明所采用的技术方案如下：

氧化型低密度脂蛋白在诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向心肌样细胞 定向分化中的应用。

在其中一个实施例中，在骨髓间充质干细胞的培养基中添加浓度为5μg/mL 的氧化型低密度脂蛋白。

实验证明，氧化型低密度脂蛋白(Oxidized Low Density Lipoprotein,ox-LDL) 能够诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向心肌样细胞定向分化，心肌样细胞 转化率高达30％。BMMSCs经ox-LDL诱导培养后，促细胞增殖基因Mdm2表 达增高，显著促进BMMSCs细胞增殖，并能检测到心肌样细胞特异性蛋白—— 波形蛋白(Vimentin)的表达，同时，心肌细胞标志性分子——心钠素(Atrial  Natriuretic Peptide，ANP)、B型钠素(B-type Natriuretic Peptide，BNP)、α-肌球 蛋白重链(α-MHC)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)和α-心肌肌动蛋白(α-Cardiac  Actin)的mRNA表达量亦显著增高。

氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)作为诱导剂，不但能够有效诱导BMMSCs 向心肌样细胞分化，而且能够促进细胞增殖，同时，氧化型低密度脂蛋白属于 内源性物质，不会对机体产生不良的刺激作用。

附图说明

图1为BMMSCs的细胞形态图；

图2为BMMSCs对Dil-ox-LDL的摄入检测图；

图3为BMMSCs经ox-LDL诱导后的MTT检测结果；

图4为Western-blotting检测BMMSCs促细胞增殖基因Mdm2的表达；

图5为免疫荧光检测BMMSCs中Vimentin的表达，其中，A为Heochest3342 染色细胞，B为Vimentin阳性细胞，C为Heochest3342染色细胞与Vimentin阳 性细胞的叠加；

图6为ox-LDL诱导BMMSCs向心肌样细胞转化的转化率；

图7为Western-blotting检测Vimentin的表达量；

图8A至图8E为RT-PCR检测心肌细胞标志分子的mRNA表达量。

具体实施方式

实施例一：小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的分离和培养

在无菌条件下，从小鼠后肢股骨骨髓中分离出骨髓间充质干细胞，加入含 20％胎牛血清的DMEM培养基中，以5×10⁵/mL的浓度接种于细胞培养瓶，置 于37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养，培养3周后获得高纯度的BMMSCs(如 图1所示)。

实施例二：小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的诱导分化

取培养3周后的BMMSCs，用0.25％胰蛋白酶消化，PBS缓冲液清洗后， 加入含20％胎牛血清的DMEM培养基中充分混匀；以5×10⁶/mL的细胞浓度将 BMMSCs接种于培养瓶中，并向培养基中加入5μg/mL的氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL)，然后在37℃、5％CO₂的条件下进行诱导培养，每3天换液一次并 添加5μg/mL的ox-LDL，诱导分化4周。

分别取诱导1周、2周、3周和4周的细胞液，于荧光显微镜下观察诱导后 的细胞形态，并通过MTT法测定细胞增殖数量，通过细胞免疫组织化学方法检 测Vimentin阳性细胞的数量和心肌样细胞转化率，以及通过RT-PCR法检测心 肌细胞标志性分子的mRNA表达情况(详见实施例三至实施例八)。

实施例三：二辛酰基四甲基吲哚花青过氯酸盐(Dil)荧光标记的ox-LDL (Dil-ox-LDL)摄入检测

将BMMSCs以1×10⁵/cm²的密度接种于12孔培养板中，培养4天后向培 养基中添加5μg/mL的Dil-ox-LDL，置于37℃、5％CO₂的培养箱中孵育30分 钟，然后用无血清的DMEM培养基洗涤细胞2次，置于荧光显微镜下观察并拍 照，检测结果如图2所示。

检测结果表明，BMMSCs具有很强的摄取ox-LDL的能力。

实施例四：MTT法检测细胞增殖情况

将BMMSCs以1×10³/cm²的密度接种于96孔培养板中，同时设置对照组 和样品组，对照组采用常规DMEM培养基，样品组在DMEM培养基中加入 5μg/mL的ox-LDL，于37℃、5％CO₂的培养箱中孵育24小时后，向每孔加入 10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续孵育2小时，然后向每孔加入100μL DMSO溶液，再孵育2小时后，采用酶联免疫检测仪检测570nm处的吸光值。

检测结果显示，对照组的吸光值为0.14OD，样品组的吸光值为0.21OD，由 样品组吸光值与对照组吸光值的比值计算样品组的相对细胞增殖数值，结果如 图3所示。实验结果证明，与对照组相比，样品组的BMMSCs在培养24小时 后细胞数量显著增加，表明ox-LDL能够刺激BMMSCs的增殖。

实施例五：免疫印迹(Western-blotting)检测促增殖基因Mdm2的表达

以实施例一培养得到的BMMSCs作为对照组，以实施例二中经诱导分化4 周后的细胞作为样品组，分别用总蛋白提取试剂盒提取对照组、样品组细胞的 总蛋白，用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并将其转到PVDF膜(聚偏 二氟乙烯膜)上(电流为200mA，转膜时间为2小时)；室温下用5％的BSA封 闭PVDF膜1小时，然后加入兔抗小鼠Mdm2抗体(1∶1000稀释)，置于摇床 上在4℃下过夜孵育；用含有0.1％Tween20的Tris碱缓冲液(TBS)洗膜3次， 然后加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗IgG-HR(1∶1000稀释)，置于摇床 上在室温下孵育1小时；用含有0.1％Tween20的TBS洗膜3次，用ECL超敏 发光液(购自美国Thermo Fisher Scientific Inc.)发光并曝光底物。以持家基因 β-actin作为内参对照，经灰度扫描后分别与β-actin的灰度值进行比较，计算对 照组、样品组的心肌样细胞促增殖基因Mdm2的表达量，结果如图4所示。

检测结果显示，样品组的BMMSCs经诱导培养后，促增殖基因Mdm2表达 量显著升高，表明ox-LDL能够刺激BMMSCs的增殖。

实施例六：免疫荧光检测心肌样细胞特异性蛋白Vimentin的表达

将BMMSCs以1×10⁵/cm²的密度接种于12孔培养板中，同时设置对照组 和样品组，对照组采用常规DMEM培养基，样品组在培养4天后向DMEM培 养基中加入5μg/mL的ox-LDL，于37℃、5％CO₂的条件下诱导培养3周；用 4％的中性福尔马林固定细胞，PBS缓冲液洗涤细胞2次，在室温下用1％的牛 血清白蛋白(BSA)作为封闭液封闭细胞30分钟，然后向细胞滴加兔抗小鼠 Vimentin抗体(1∶200稀释)，室温孵育1小时后，用PBS缓冲液洗涤细胞3 次；然后添加荧光素Cy3标记的山羊抗兔二抗IgM(1∶200稀释)，室温避光孵 育30分钟后，用PBS缓冲液洗涤细胞2次；然后滴加Heochest3342染料(细 胞核特异性染料，购自美国ImmunoChemistry Technologies,LLC)溶液(1∶500 稀释)，室温下孵育5分钟后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次；置于荧光显微镜下 观察、拍照，并分别统计细胞总数(即Heochest3342染色细胞数量)、Vimentin 阳性细胞数量，并计算心肌样细胞转化率，结果如图5、图6所示。

心肌样细胞转化率＝Vimentin阳性细胞数量/Heochest3342染色细胞数量

实验结果证明，样品组的Vimentin阳性细胞数量以及心肌样细胞转化率均 显著高于对照组，表明ox-LDL能够诱导BMMSCs向心肌样细胞分化。

实施例七：免疫印迹(Western-blotting)检测心肌样细胞特异性蛋白Vimentin 的表达量

以实施例一培养得到的BMMSCs作为对照组，以实施例二中经诱导分化4 周后的细胞作为样品组，分别用总蛋白提取试剂盒提取对照组、样品组细胞的 总蛋白，用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并将其转到PVDF膜(聚偏 二氟乙烯膜)上(电流为200mA，转膜时间为2小时)；室温下用5％的BSA封 闭PVDF膜1小时，然后加入兔抗小鼠Vimentin抗体(1∶1000稀释)，置于摇 床上在4℃下过夜孵育；用含有0.1％Tween20的Tris碱缓冲液(TBS)洗膜3 次，然后加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗IgG-HR(1∶1000稀释)，置于 摇床上在室温下孵育1小时；用含有0.1％Tween20的TBS洗膜3次，用ECL 超敏发光液(购自美国Thermo Fisher Scientific Inc.)发光并曝光底物。以持家 基因β-actin作为内参对照，经灰度扫描后分别与β-actin的灰度值进行比较，计 算对照组、样品组的心肌样细胞特异性蛋白Vimentin的表达量，结果如图7所 示。

实验结果证明，样品组的Vimentin表达量显著高于对照组，表明ox-LDL 能够诱导BMMSCs向心肌样细胞分化。

实施例八：反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测心肌细胞标志分子ANP、 BNP、α-MHC、β-MHC和α-Cardiac Actin的mRNA表达量

以实施例一培养得到的BMMSCs作为对照组，以实施例二中经诱导分化4 周后的细胞作为样品组，分别用RNA提取试剂盒从对照组、样品组的细胞提取 总RNA，并用DnaseI(脱氧核糖核酸酶)处理RNA样品，以除去DNA污染。 分别将对照组、样品组的RNA样品稀释为100μg/mL，分别取10μL样品，用反 转录试剂盒合成第一链cDNA。分别以对照组、样品组的第一链cDNA作为模 板，采用表1所示的引物进行PCR反应，以测定BMMSCs经ox-LDL诱导后的 心肌细胞标志性分子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC和α-Cardiac Actin表达量。

PCR反应体系：cDNA模板100ng、引物0.3μM、10×PCR反应液2μL，加 入去离子水至20μL。

PCR反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72 ℃延伸2分钟，30个循环后，72℃终延伸10分钟。

表1 PCR反应引物

以持家基因GAPDH作为内参对照，经灰度扫描后分别与GAPDH的灰度值 进行比较，分别计算对照组、样品组的心肌细胞标志性分子ANP、BNP、α-MHC、 β-MHC和α-Cardiac Actin的表达量，结果如图8A至图8E所示。

实验结果证明，样品组的ANP(图8A)、BNP(图8B)、α-MHC(图8C)、 β-MHC(图8D)和α-Cardiac Actin(图8E)的表达量均显著高于对照组，表明 ox-LDL能够诱导BMMSCs向心肌样细胞分化。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。