一种维吉尼链霉菌发酵生产维吉尼亚霉素的培养基及补料方法

摘要

本发明涉及一种维吉尼链霉菌发酵生产维吉尼亚霉素的培养基和补料方法，其种子培养基中含有大米酒糟和低温压榨黄豆饼粉，发酵培养中含有大米酒糟、低温压榨黄豆饼粉、陶氏大孔离子交换树脂和非离子表面活性剂。本发明解决了原辅料的成本问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现维吉尼亚霉素稳定、高效的生产，同时利用该培养基和培养方法可提高发酵单位。

说明书

技术领域

本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种维吉尼链霉菌发酵生产维吉尼亚 霉素的培养基及补料方法。

背景技术

维吉尼亚霉素又名维及尼霉素、维及霉素、威里霉素、肥大霉素等。从结构 上被划分为链阳性抗生素，是一类结构较为新颖的兽用抗生素。

目前，国内采用维吉尼链霉菌发酵生产维吉尼亚霉素，存在的主要问题是：

1发酵单位维持在1000～3000u/ml左右，导致发酵产量较低。

2动物性氮源质量影响发酵液质量和发酵效果。目前，国内发酵生产维吉尼 亚霉素的培养基中加入鱼粉或蛋白胨或酵母提取物或选择两种或两种以上氮源 同时加入。导致发酵后期剩余蛋白质较多，发酵液粘度较高，降低了提取收率。

3维吉尼亚霉素的生产成本较高，其中氮源的成本占到发酵成本的40％左右。

发明内容

本发明目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高发酵单位， 同时最大限度的降低原辅料用量，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响， 保证其供应充足，实现维吉尼亚霉素稳定、高效生产的维吉尼链霉菌发酵生产维 吉尼亚霉素的培养基。

本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产维吉尼亚霉素的补料方法。

为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种维吉尼链霉菌发酵生产维吉尼亚霉素的培养基，包括种子培养基和发酵 培养基，其特征在于所述种子培养基的组成为：麦芽糖20～30ml/L、混合淀粉 10～20g/L、橄榄油1～5ml/L、低温压榨一次黄豆饼粉15～25g/L、大米酒糟20～ 30g/L、玉米蛋白粉10～15g/L、轻质碳酸钙1～5g/L、硫酸铵1～5g/L，麦芽糖 酶0.01～0.03g/L；

所述发酵培养基的组成为：麦芽糖30～40ml/L、混合淀粉20～40g/L、橄榄 油1～5ml/L、低温压榨一次黄豆饼粉20～30g/L、大米酒糟30～40g/L、玉米蛋 白粉20～30g/L、磷酸二氢钾0.8～1.2g/L、轻质碳酸钙6～8g/L、硫酸铵5～8g/L、 乙酸钠0.5～1.5g/L、硫酸镁1～5g/L、硫酸亚铁0.3～0.7g/L、非离子表面活 性剂0.01～0.05g/L，陶氏大孔树脂1～5g/L，麦芽糖酶0.04～0.07g/L。

所述大米酒糟的质量要求是：蛋白质含量在50％以上，水分含量控制在5％ 以内，80％的原料能够通过60目筛。

所述低温压榨一次黄豆饼粉质量要求是：黄豆在低于80℃的条件下压榨1 次，要求其油含量控制在7～10％，蛋白质含量在45％以上，80％的原料能够通过 80目筛。

所述混合淀粉是指淀粉中加入其重量的0.006％的泛酸和0.004％的硫辛酸。

所述非离子表面活性剂为脂肪酸甘油酯或脂肪酸山梨坦或聚山梨酯。

一种利用上述培养基发酵生产维吉尼亚霉素的补料方法，其特征在于在发酵 过程中进行补料，包括补油、补水、补糖、补碱和补氮源，其中

a补油控制：采用流加法补橄榄油，

发酵前10h不用进行补油，

发酵11h～20h：期间控制脂肪含量在3.5～4.5％，当脂肪含量低于4％，补 入橄榄油，当脂肪含量超过6％，则停止补油，补油量(L)＝(5-脂肪含量-残油 量)％×发酵液体积(L)，

发酵21h至发酵结束：期间控制脂肪含量在1.5～2％，当脂肪含量低于1.5％， 补入油，当脂肪含量超过2％，则停止补油，补油量(L)＝(1.7-脂肪含量-残油 量)％×发酵液体积(L)；

b补水：

发酵前10h不用进行补水，

发酵11h～20h：当发酵液菌体浓度＞50％时，采用流加法补水，控制菌体浓 度40～50％，

发酵21h至发酵结束：当发酵液菌体浓度＞40％，采用流加法补水，控制菌 体浓度30～40％；

c pH控制：

发酵前10h，pH不进行控制，

发酵11～20h：当发酵液的pH低于6.5，加入5～10％的氢氧化钠溶液控制 其pH在6.5～7.0，

发酵21h至发酵结束：当发酵液的pH低于6.0，加入5～10％的氢氧化钠溶 液控制其pH在6.0～6.5；

d补入氮源：在发酵周期分别在60h和100h时补入浓度为5～10％的硫酸铵， 其补入量为发酵液体积的1～1.5％；

e补糖：

发酵前10h，不加入麦芽糖，

发酵11～20h，当还原糖含量＜4％，加入麦芽糖，当还原糖含量超过6％，则 停止加入麦芽糖，补糖量(kg)＝(5-还原糖量)％×发酵液体积(L)；

发酵21h至发酵结束，当还原糖含量＜2％，加入麦芽糖，当还原糖含量超过 2％，则停止加入麦芽糖，补糖量(kg)＝(2-还原糖量)％×发酵液体积(L)。

本发明的技术优势为：

1)发酵成本低。首先大米酒糟产量较大，市场价格较低，便于采购，其次 使用大米酒糟代替维吉尼亚霉素常规种子培养基、发酵培养基中的氮源，减少用 量，降低了30％以上的生产成本，避免因氮源质量影响种子液和发酵液质量的不 利因素。

2)本发明采用大米酒糟代替了常规培养基中的蛋白胨和鱼粉，满足了维吉 尼亚霉素发酵培养过程中氨基酸的需求量。根据相关文献报道维吉尼亚霉素发酵 所需的主要氨基酸分别是缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸。本发明发酵培养基 中的蛋白质含量达到55％以上，氨基酸含量明显高于国内常规培养基配方，有利 于改善维吉尼链霉菌菌丝形态；提高发酵液的质量和发酵技术水平。

不同原辅料的氨基氮含量对比表

3)发酵培养基中加入表面活性剂和大孔树脂，不仅改变细胞膜的通透性， 而且改善气液表面状态以及发酵液的流动状态，有利于提高发酵技术水平。

4)采用该工艺发酵生产维吉尼亚霉素，适用于单罐发酵规模在10m³以上， 发酵单位达到4000u/ml以上。

具体实施方式

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是 对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

下述实施例中

大米酒糟的质量要求是：蛋白质含量在50％以上，水分含量控制在5％以内， 80％的原料能够通过60目筛。

低温压榨一次黄豆饼粉质量要求是：黄豆饼粉在低于80℃的条件下压榨1 次，要求其油含量控制在7～10％，蛋白质含量在45％以上。80％的原料能够通过 80目筛。

种子培养工艺：

罐压0.02～0.04MPa；罐温25～28℃；空气流量80m³/h；搅拌转速60～ 80r/min；pH6～8；培养时间32～36h。种子培养结束，菌体浓度20～30％，无其 它杂菌污染。

发酵培养工艺

先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后脂肪控 制在4.5～5.5％，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养。其移种量控制在10～ 15％。发酵前20h，培养温度控制在26～28℃；发酵21h～发酵结束，培养温度 控制在25～26℃；搅拌转速120r/min；培养时间65～75h；发酵全程罐压控制 在0.03～0.05MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过程中进行菌检，要求无其它 杂菌；空气流500～700m³/h，发酵培养结束，菌体浓度30～40％；发酵单位 4000u/ml以上。

实施例1

1m³种子罐培养：

麦芽糖20L、混合淀粉10kg、橄榄油1L、低温压榨一次黄豆饼粉15kg、大 米酒糟20kg、玉米蛋白粉10kg、轻质碳酸钙1kg、硫酸铵1kg，麦芽糖酶10g。

种子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温25～28℃；空气流量80m³/h； 搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间32h。种子培养结束，菌体浓度21％， 无其它杂菌污染。

10m³发酵罐培养：

麦芽糖300L、混合淀粉200kg、橄榄油10L、低温压榨一次黄豆饼粉200kg、 大米酒糟300kg、玉米蛋白粉200kg、磷酸二氢钾8kg、轻质碳酸钙60kg、硫酸 铵50kg、乙酸钠5kg、硫酸镁10kg、硫酸亚铁3kg、脂肪酸甘油脂0.1kg，陶氏 大孔树脂10kg，麦芽糖酶0.4kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发 酵罐进行培养。其移种量控制在10％。发酵前20h，培养温度控制在26～28℃； 发酵21h～发酵结束，培养温度控制在25～26℃；搅拌转速120r/min；培养时 间65h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过 程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流500～700m³/h，发酵培养结束，菌体浓 度31％；发酵单位4103u/ml。

上述发酵过程中根据情况进行补料。

实施例2

1m³种子罐培养：

麦芽糖30L、混合淀粉13kg、橄榄油2L、低温压榨一次黄豆饼粉17kg、大 米酒糟23kg、玉米蛋白粉11kg、轻质碳酸钙2kg、硫酸铵2kg，麦芽糖酶30g。

种子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温25～28℃；空气流量80m³/h； 搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间33h。种子培养结束，菌体浓度25％， 无其它杂菌污染。

10m³发酵罐培养：

麦芽糖330L、混合淀粉400kg、橄榄油20L、低温压榨一次黄豆饼粉220kg、 大米酒糟330kg、玉米蛋白粉220kg、磷酸二氢钾9kg、轻质碳酸钙60kg、硫酸 铵60kg、乙酸钠7kg、硫酸镁20kg、硫酸亚铁4kg、司盘0.2kg，陶氏大孔树脂 20kg，麦芽糖酶0.5kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发 酵罐进行培养。其移种量控制在12％。发酵前20h，培养温度控制在26～28℃； 发酵21h～发酵结束，培养温度控制在25～26℃；搅拌转速120r/min；培养时 间67h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过 程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流500～700m³/h，发酵培养结束，菌体浓 度33％；发酵单位4237u/ml。

上述发酵过程中根据情况进行补料。

实施例3

1m³种子罐培养：

麦芽糖25L、混合淀粉15kg、橄榄油3L、低温压榨一次黄豆饼粉15kg、大 米酒糟25kg、玉米蛋白粉15kg、轻质碳酸钙3kg、硫酸铵3kg，麦芽糖酶20g。

种子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温25～28℃；空气流量80m³/h； 搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间34h。种子培养结束，菌体浓度25％， 无其它杂菌污染。

10m³发酵罐培养：

麦芽糖350L、混合淀粉200kg、橄榄油30L、低温压榨一次黄豆饼粉250kg、 大米酒糟400kg、玉米蛋白粉250kg、磷酸二氢钾10kg、轻质碳酸钙70kg、硫酸 铵65kg、乙酸钠10kg、硫酸镁30kg、硫酸亚铁5kg、聚山梨酯0.3kg，陶氏大 孔树脂30kg，麦芽糖酶0.55kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发 酵罐进行培养。其移种量控制在13％。发酵前20h，培养温度控制在26～28℃； 发酵21h～发酵结束，培养温度控制在25～26℃；搅拌转速120r/min；培养时 间70h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过 程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流500～700m³/h，发酵培养结束，菌体浓 度35％；发酵单位4387u/ml。

上述发酵过程中根据情况进行补料。

实施例4

1m³种子罐培养：

麦芽糖27L、混合淀粉20kg、橄榄油4L、低温压榨一次黄豆饼粉23kg、大 米酒糟20kg、玉米蛋白粉14kg、轻质碳酸钙4kg、硫酸铵4kg，麦芽糖酶25g。

种子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温25～28℃；空气流量80m³/h； 搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间35h。种子培养结束，菌体浓度27％， 无其它杂菌污染。

10m³发酵罐培养：

麦芽糖350L、混合淀粉350kg、橄榄油40L、低温压榨一次黄豆饼粉250kg、 大米酒糟350kg、玉米蛋白粉270kg、磷酸二氢钾12kg、轻质碳酸钙75kg、硫酸 铵70kg、乙酸钠12kg、硫酸镁40kg、硫酸亚铁6kg、脂肪酸甘油酯0.4kg，陶 氏大孔树脂50kg，麦芽糖酶0.62kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发 酵罐进行培养。其移种量控制在13％。发酵前20h，培养温度控制在26～28℃； 发酵21h～发酵结束，培养温度控制在25～26℃；搅拌转速120r/min；培养时 间73h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过 程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流500～700m³/h，发酵培养结束，菌体浓 度38％；发酵单位4213u/ml。

上述发酵过程中根据情况进行补料。

实施例5

1m³种子罐培养：

麦芽糖30L、混合淀粉20kg、橄榄油5L、低温压榨一次黄豆饼粉25kg、大 米酒糟30kg、玉米蛋白粉15kg、轻质碳酸钙5kg、硫酸铵5kg，麦芽糖酶30g。

种子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温25～28℃；空气流量80m³/h； 搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间36h。种子培养结束，菌体浓度30％， 无其它杂菌污染。

10m³发酵罐培养：

麦芽糖400L、混合淀粉400kg、橄榄油50L、低温压榨一次黄豆饼粉250kg、 大米酒糟400kg、玉米蛋白粉300kg、磷酸二氢钾12kg、轻质碳酸钙80kg、硫酸 铵80kg、乙酸钠15kg、硫酸镁50kg、硫酸亚铁7kg、脂肪酸山梨坦0.5kg，陶 氏大孔树脂50kg，麦芽糖酶0.7kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发 酵罐进行培养。其移种量控制在15％。发酵前20h，培养温度控制在26～28℃； 发酵21h～发酵结束，培养温度控制在25～26℃；搅拌转速120r/min；培养时 间73h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过 程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流500～700m³/h，发酵培养结束，菌体浓 度40％；发酵单位4120u/ml。

上述发酵过程中根据情况进行补料。

上述实施例1-5中补料控制按照下述方式实现：

a补油控制：采用流加法补橄榄油，

脂肪控制：发酵培养基灭菌后脂肪控制在4～6％；发酵前10h，脂肪含量控 制在4.5％以上；发酵11～20h，脂肪含量控制在3.5～4.5％；21h至发酵结束， 脂肪含量控制在1.5～2％。

发酵前10h不用进行补油。

发酵11h～20h：如果脂肪含量低于4％，补入橄榄油；如果脂肪含量超过6％， 则停止补油。其计算公式为：补油量(L)＝(5-脂肪含量-残油量)％×发酵液体积 (L)。

发酵21h至发酵结束：如果脂肪含量低于1.5％，补入油；如果脂肪含量超 过2％，则停止补油。其计算公式为：补油量(L)＝(1.7-脂肪含量-残油量)％× 发酵液体积(L)。

b补水：

发酵前10h不用进行补水。

11h～20h：当发酵液菌体浓度＞50％，控制菌体浓度40～50％。

21h至发酵结束：当发酵液菌体浓度＞40％，采用流加法补水，控制菌体浓度 30～40％。

c pH控制：

发酵前10h，pH不进行控制。

发酵11～20h：如果发酵液的pH低于6.5，加入5～10％的氢氧化钠溶液控 制其pH在6.5～7.0。

发酵21h至发酵结束：如果发酵液的pH低于6.0，加入5～10％的氢氧化钠 溶液控制其pH在6.0～6.5。

d补入氮源：在发酵周期分别在60h和100h时补入5～10％的硫酸铵，其补 入量为发酵液体积的1～1.5％。

e补糖：

发酵前10h，不加入麦芽糖。

发酵11～20h，如果还原糖含量＜4％；加入麦芽糖；如果还原糖含量超过6％， 则停止加入麦芽糖。其计算公式为：补糖量(kg)＝(5-还原糖量)％×发酵液体积 (L)。

发酵21h至发酵结束，如果还原糖含量＜2％；加入麦芽糖；如果还原糖含量 超过2％，则停止加入麦芽糖。其计算公式为：补糖量(kg)＝(2-还原糖量)％× 发酵液体积(L)。

对比实施例

种子培养：

在1m³一级种子罐中加入葡萄糖14L、可溶性淀粉22kg、玉米油3L、黄豆饼 粉31kg、蛋白胨12kg、鱼粉13kg、轻质碳酸钙2.6kg、硫酸铵3.4kg。

首先将种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将 已经培养好的维吉尼链霉菌母瓶发酵液接入种子罐进行培养，接种量为1L。种 子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温25～28℃；空气流量80m³/h；搅拌转 速60～80r/min；pH6～8；培养时间34h。种子培养结束，菌体浓度21％，无其 它杂菌污染。

发酵培养：

在10m³发酵罐中加入葡萄糖200kg、淀粉320kg、玉米油20L、黄豆饼粉350kg、 蛋白胨130kg、鱼粉120kg、磷酸二氢钾7kg、轻质碳酸钙45kg、硫酸铵43kg、 乙酸钠10kg、硫酸镁34kg、硫酸亚铁6kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养。发酵 前20h，培养温度控制在26～28℃；发酵21h～发酵结束，培养温度控制在25～ 26℃；搅拌转速120r/min；培养时间75h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa； 发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流500～ 700m³/h，发酵培养结束，菌体浓度32％；发酵单位2641u/ml。