利用分子标记鉴别瓠瓜品种果实苦味的方法及其引物

摘要

本发明涉及作物分子育种技术领域，尤其涉及利用分子标记检测瓠瓜果实苦味的方法。发明采用特殊混池的BSA方法，筛选到杭州长瓜和蒲县瓠瓜中与苦味互补基因连锁的InDel标记BID89及BID50，利用这两个标记扩增待检测的材料，可以根据两标记的基因型组合，推测其含有的互补基因的类型，进而推测该品种的果实是否会出现苦味，鉴别技术简单，易于应用。

说明书

技术领域

本发明涉及作物分子育种技术领域，尤其涉及利用分子标记检测瓠瓜果实苦味的方法。

背景技术

瓠瓜[Lagenaria siceraria (Molina) Standl.]，又名长瓜、蒲瓜、夜开花、葫芦等，隶属葫芦科(Cucurbitaceae)葫芦属(Lagenaria)。瓠瓜主要以嫩果做蔬菜用，在我国已经有7000多年的栽培历史，是南方地区夏季重要的瓜类蔬菜作物之一。瓠瓜果实变苦是影响瓠瓜生产最突出的问题之一，即使少量食用苦味瓠瓜也会造成人畜中毒；在生产中只要出现少量苦味瓠瓜，其它同批的瓠瓜就无法进入市场，给生产者特别是专业化、规模化生产基地带来巨大的经济损失，严重影响了瓠瓜产业的健康发展。前人研究表明，瓠瓜苦味受一对互补基因控制，即只有显性基因Bt与I共同存在时全株果实才产生浓烈苦味(张谷曼 1981)。遗传分析显示，基因型为BtBtII、BtBtIi、BtbtII、BtbtIi的单株果实呈现苦味，基因型为BtBtii、Btbtii、btbtII、btbtIi、btbtii的单株果实不会出现苦味。目前在生产中，苦味的鉴别主要依赖于植株开花结果后对果实的感官品尝，受时间限制强，感官品尝后又极易对人体造成为害。对单个瓠瓜品种来说，果实苦味源于其双亲分别携带的苦味互补基因聚合后互作的表型。利用与目标基因（苦味基因）紧密连锁的分子标记，可以方便地检测出某一品种是否携带目标基因，进而推断目标性状的表型（果实苦味有无），对指导瓠瓜育种和生产上避免损失具有重要的实际意义。

分子标记即可识别的等位变异，简单的说，就是对两个材料同时扩增基因组上的一段序列后，可以通过电泳技术或杂交信号区分出二者之间的差异。目前在瓠瓜上，尚未报道与苦味基因连锁的分子标记及利用分子标记鉴别果实苦味的方法。

分子标记类型众多，检测手段各有差异。基于PCR的分子标记，因其技术简单、成本低，重复性高在作物中得到广泛的应用，一般的实验室均可操作。常见的基于PCR的分子标记包括SSR、InDel、CAPs等类型。(说明：SSR，Simple Sequence Repeat，简单序列重复，即在某一基因组区段上出现几个核苷酸组合的串联重复，通过扩增两亲本的串联区段，根据串联重复数目的差异区分不同品种；InDel，Insertion-deletion，插入缺失标记，指的是两种亲本在基因组上的差异，相对于另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失；CAPs, Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，酶切扩增多态性序列，根据已知某一段基因组序列上的酶切位点设计引物，扩增该片断后用专一的限制性内切酶酶切扩增产物，电泳分离后能够酶切的亲本将出现两条带，不能酶切的亲本依然出现一条带，据此区分不同亲本。)。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种与瓠瓜品种果实苦味基因连锁的InDel标记，本发明的第二个目的是提供一种筛选上述的InDel标记的方法，本发明的第三个目的是提供一种利用分子标记鉴别瓠瓜品种果实苦味的方法， 本发明首先利用特殊混池BSA方法,获得与苦味基因连锁的分子标记,进而利用这些标记扩增需要鉴别的品种，根据其基因型判断该品种所结的果实是否呈现苦味。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种与瓠瓜品种果实苦味基因连锁的InDel标记，该InDel标记由BID50引物组和BID89引物组构成，其引物序列如下：

BID50上游引物：5’- ccatgagccaagagcca-3’；

BID50下游引物：5’- gctgtgtctcttgaagctctaa-3’；

BID89上游引物：5’- cgcttctggtttataggtttac-3’；

BID89下游引物：5’- gctaaaccaatcaaaacctaag-3’。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种筛选上述的InDel标记的方法，该方法包括以下的步骤：

1)群体及材料准备：选择无苦味的杭州长瓜和蒲县瓠瓜杂交，其F₁代植株所结的果实均呈现苦味，F₂代植株果实苦与不苦出现9:7的分离；

2) 特殊BSA池构建：在F₂代，选择6株果实无苦味的单株构建杂合池，；将果实出现苦味的F₂代单株继续种植，鉴定其子代的果实，选择子代果实苦味不分离的F₂单株建成纯合池；

3)标记筛选：利用162对InDel标记在亲本间和两池间进行多态性筛选，筛选到InDel标记BID89在纯合池中只出现和杭州长瓜一致的条带，在杂合池中同时出现了两亲本的条带；BID50在纯合池中只出现和蒲县瓠瓜一致的条带，在杂合池中同时出现两亲本的条带。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种利用分子标记鉴别瓠瓜品种果实苦味的方法，该方法包括以下的步骤：

1）DNA提取、PCR反应及电泳：DNA提取采用试剂盒，按照说明提取；PCR反应体积为12.5μl，包含10–20 ng模板DNA，1×PCR buffer，50 mM KCl，0.1 mM dNTP，0.75–1.5 mM MgCl₂，0.2 μM引物，1U Taq聚合酶；所述的引物采用权利要求1所述的BID50引物组或BID89引物组，BID89引物组与BID50引物组的PCR反应程序为94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸40秒，循环35次，最后72℃总延伸5分钟，4℃保存；取3μl PCR产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，Acr:Bis = 19:1或39:1，指示剂为二甲苯青，电泳电压为200V，电泳时间1小时，用银染法染色显带，照相后用Photoshop软件对图片进行处理，观察；

2)检测结果分析：根据电泳结果对BID50、BID89的带型进行赋值，带型与杭州长瓜一致的赋值为1，与蒲县瓠瓜一致的赋值为0，杂合带型赋值为2，赋值后的组合将出现以下情况：

本发明的有益效果是：

(1)所筛选到的两对InDel标记可以直接用来鉴别两个品种杂交后代中不同单株的果实是否会出现苦味，PCR技术简便，易于应用。

(2)利用所筛选到的两对InDel标记可以直接鉴别不同瓠瓜品种是否为苦味品种，为瓠瓜生产和品种选育提供直接的检测技术。

附图说明

图1为BID89和BID50在亲本和池间的筛选情况。泳道1-6依次为杭州长瓜、蒲县瓠瓜、纯合池1、纯合池2、杂合池1、杂合池2。

图2为BID89和BID50在苦味单株中的扩增情况。泳道1-8依次为杭州长瓜、蒲县瓠瓜、JF20、JF27、JF46、JF72、JF78、JF102。

图3为BID89和BID50在不苦单株中的扩增情况。泳道1-5依次为杭州长瓜、蒲县瓠瓜、JF9、JF40、JF81。

图4为BID89和BID50在5个品种中的扩增情况。泳道1-7依次为杭州长瓜、蒲县瓠瓜、G6-3-5、牛腿蒲、早生、青腰葫芦（苦味）、九山圆蒲。

具体实施方式

实施例1

鉴别杭州长瓜x蒲县瓠瓜F₂群体中不同单株的果实苦味情况：

(1)植物材料：杭州长瓜x蒲县瓠瓜F₂群体中，随机选择6株果实呈现苦味的单株：JF20、JF27、JF46、JF72、JF78、JF102；3株果实不苦的单株：JF9、JF40、JF81。

(2)DNA提取与PCR扩增：DNA提取采用天根公司的试剂盒，按照说明提取。PCR反应体积为12.5μl，包含10–20 ng模板DNA，1×PCR buffer (10 mM Tris-HCl (pH8.3)，50 mM KCl，0.1 mM dNTP，0.75–1.5 mM MgCl₂，0.2 μM引物，1U Taq聚合酶。BID89与BID50的PCR反应程序为94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸40秒，循环35次，最后72℃总延伸5分钟，4℃保存。取3μl PCR产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(Acr:Bis = 19:1或39:1)，指示剂为二甲苯青，电泳电压为200V，电泳时间1.5小时，用银染法染色显带，照相后用Photoshop软件对图片进行处理，观察。

(3)果实苦味鉴别分析：根据电泳后BID89、BID50读带后的组合情况，分析表明所有苦味单株的基因型组合属于苦味类型(图2；表2)，所有不苦单株的基因型组合属于不苦类型(图3；表3)，根据基因型推测的苦味表型完全符合各单株果实的实际苦味情况。

表2. 苦味单株的基因型

表3. 不苦单株的基因型

实施例2                  

鉴别不同品种的果实苦味情况

 (1)品种：随机挑选5份瓠瓜纯系材料鉴别其果实的苦味情况，品种为G6-3-5、牛腿蒲、早生、青腰葫芦、九山圆蒲，感官品尝发现除青腰葫芦果实有苦味外，其它材料果实均不苦。DNA提取及PCR扩增、电泳读带同上。

 (2)结果分析：青腰葫芦的基因型为苦味类型，其他4份品种的基因型均为不苦类型，所有鉴别材料的基因型与感官品尝的结果完全一致(图4、表4)。

表4. 5份材料的基因型与果实苦味

　

<110>浙江省农业科学院

<120>利用分子标记鉴别瓠瓜品种果实苦味的方法及其引物

<160>

 

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

      ccatgagcca agagcca 17

  

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

      gctgtgtctc ttgaagctct aa 22

 

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

      cgcttctggt ttataggttt ac 22

 

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

      gctaaaccaa tcaaaaccta ag 22