实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法及其应用，方法包括以下步骤：S1：在待测基因的编码区的任意区段设计一对实时定量PCR引物作为对照引物；S2：对待测基因的转录起始位点进行定位：启动子区自起始密码子起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第一引物，第一引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向上游步移预定距离；S3：对待测基因的PolyA位点进行定位：自终止密码子起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第二引物，第二引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向下游步移预定距离；S4：对对照引物、第一引物和第二引物进行扩增，并对扩增片段进行特异性分析，确定待测基因的转录起始位点和PolyA位点。

说明书

技术领域

本发明涉及基因转录技术领域，更具体地，涉及一种实时荧光定量PCR定位基因转录 起始位点和PolyA位点的方法及其应用。

背景技术

真核生物的DNA转录发生在细胞核中，是遗传信息由DNA转换到RNA的过程，包括启 动、延伸和终止阶段。在起始阶段，RNA聚合酶在σ亚基引导下识别并结合到启动子上， 形成由酶、DNA和核苷三磷酸(NTP)构成的三元起始复合物。在延伸阶段，核心酶沿着DNA 分子向前移动，随着碱基的加入，新生的RNA链不断生长。在转录终止阶段，RNA聚合酶 在Nus A因子帮助下识别转录终止信号，停止转录，RNA链离开模板。此时生成的mRNA称 为前体mRNA，须经过一系列转录后加工过程并转移到细胞质中才能表现出翻译功能。mRNA 的加工过程主要包括加帽(5’端形成特殊的帽子结构)，加尾(3’端切断并加上多聚腺甘 酸尾巴)、剪接(去除内含子并拼接外显子)和甲基化(链内核苷酸甲基化)。真核生物的 mRNA都有5’帽子结构，即在转录起始后不久在5’端三磷酸脱去一个磷酸，然后与GTP 反应生成5’,5’-三磷酸相连的键，并释放出焦磷酸，最后以S-腺甘蛋氨酸(SAM)进行 甲基化产生帽子结构。5’帽子有助于mRNA穿过核膜，保护5’端不被降解以及翻译起始 阶段时供eIF4E识别等作用；5’非翻译区(5’Untranslated region，5’UTR)在AUG附 近含有核糖体结合位点，核糖体在此组装。真核生物的前体mRNA通常还含有终止密码子下 游0.1-9kb长的序列，核酸内切酶在PolyA位点上切除多余序列，并在PolyA聚合酶的作 用下添加20-200个腺甘酸残基，形成多聚腺甘酸的尾巴结构。多聚腺甘酸的尾巴具有增强 mRNA的稳定性、控制mRNA的亚细胞定位和指导特定氨基酸的编码等作用。完整的基因转 录本包括5’UTR、编码区和3’UTR。

全基因组测序提供了大量的DNA序列，要从中将遗传信息解读出来首先要识别基因， 特别是基因转录调控信息。通常情况下，先利用软件如GRAIL、FGENEH、WebGene、GENSCAN 对全基因进行扫描，然后再用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)技术克 隆基因的非翻译区，从而确定转录起始位点和PolyA位点。

CLONTECH开发的5’-Full RACE kit(货号：D315)基于去帽子原理克隆cDNA 5’末 端的完整序列，3’-Full RACE Core Set with PrimerScript RTase(货号：D314)使用 改良的PrimeScript反转录酶克隆cDNA 3’末端的完整序列。其原理是将目的基因的5’ 非翻译区的5’端和3’非翻译区的3’端连上接头，在接头的不同部位设计一条外侧引物 和一条内侧引物(公司提供)，再在基因编码区设计对应的外侧和内侧引物(用户自备)， 利用套式PCR克隆cDNA的5’非翻译区和3’非翻译区。但是任何克隆技术都不能从根本 上解决特异性差和扩增效率低下的问题。尽管RACE试剂盒采用两轮PCR扩增以提高目的片 段的特异性，但是由于每对引物中要有一条引物与接头配对，导致实际只有用户自备的两 条与编码区配对的引物参与筛选，仅相当于一次普通PCR，因此不可避免地出现非特异性 扩增。未知基因的非翻译区长度很难利用软件准确预测，更加大了克隆的难度，如果能够 确认目的片段的长度，就可以通过改变PCR反应条件来提高特异性，例如改变引物退火温 度、延伸时间和控制模板的量等。扩增效率低下是目前所有PCR扩增都面临问题，片段越 长，扩增效率越低。同一物种中非翻译区长度变化很大，从十几个碱基到数千个碱基不等， 例如Mignone等人(2002)分析了5464个无脊椎动物5’UTR，最长的为4498bp；3736 个3’UTR，最长的为9142bp。在理想状态下，5’-Full RACE kit(货号：D315)最长也 仅能得到3.2kb的PCR扩增产物(见D315技术手册)；而实际情况下，500bp以上的片 段扩增效率明显下降，克隆难度增加。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于 提出一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法，该方法使用范围 宽，灵敏度和精确度高。

本发明还提出一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法在检 测试剂盒中的应用。

根据本发明第一方面实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点 的方法，包括以下步骤：S1：在待测基因的编码区的任意区段设计一对实时定量PCR引物 作为对照引物；S2：对所述待测基因的转录起始位点进行定位：启动子区自起始密码子起， 每隔第一预定个数的碱基对设计一对第一引物，所述第一引物的扩增片段大小为第二预定 个数的碱基对，并向上游步移预定距离；S3：对所述待测基因的PolyA位点进行定位：自 终止密码子起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第二引物，所述第二引物的扩增片段 大小为第二预定个数的碱基对，并向下游步移预定距离；S4：对所述对照引物、第一引物 和第二引物进行扩增，并对扩增片段进行特异性分析，确定所述待测基因的转录起始位点 和PolyA位点。

根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法， 用qRT-PCR技术同时检测基因不同区段的表达丰度，对转录起始位点和PloyA位点进行精 确定位，解决目的基因非翻译区长度不确定性问题，使RACE克隆过程中的引物设计摆脱对 编码区的依赖，将设计位点前移到起始位点和PloyA位点附近，只需扩增500bp以内的小 片段，就可以克隆出非翻译区，该方法使用范围宽泛，并且定位的灵敏度和准确度高。

另外，根据本发明上述实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位 点的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的一个实施例，所述第一预定个数为180-220，所述第二预定个数为50-250， 所述预定距离为1000-8000个碱基对。

根据本发明的一个实施例，所述对照引物、第一引物和第二引物的长度均为18-25个 碱基对。

根据本发明的一个实施例，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度为60-65 ℃，GC含量为40-60％。

根据本发明的一个实施例，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度差小于等 于2℃。

根据本发明的一个实施例，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度相等。

根据本发明的一个实施例，所述转录起始位点定位的对照引物和第一引物的模板量相 同，所述PolyA位点定位的对照引物和第二引物的模板量相同。

根据本发明的一个实施例，所述对照引物和第一引物的扩增反应在同一批次进行；对 照引物和第二引物的扩增反应在同一批次进行。

根据本发明的一个实施例，对扩增片段进行特异性分析时，产物变性数据为：从72℃ 到95℃，每5s升温0.2℃。

根据本发明第二方面实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点 的方法在检测试剂盒中的应用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显 和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的 方法的流程图；

图2是本发明一个实施例中qRT-PCR引物的位置图，其中，P1-P6分别表示引物对所对 应的位置，P1引物为对照引物，位于编码区内，P2-P6引物为定位引物，其中P2引物的反 向引物位于编码区，正向引物位于启动子区，P3-P6位于启动子区，ATG表示翻译起始密码 子；

图3a是图2中实施例的不同qRT-PCR引物的起峰图谱，图3b是图2中实施例的不同 qRT-PCR引物的扩增产物的熔解曲线；

图4是Ax1的转录起始位点定位图；

图5是本发明另一个实施例中qRT-PCR引物的位置图，其中，P1-P5分别表示引物对所 对应的位置，P1引物为对照引物，位于编码区内，P2-P5引物为定位引物，其中P2引物的 正向引物位于编码区内，反向引物位于3’非翻译区，其余引物均位于3’非翻译区，ATG 表示翻译起始密码子，TGA表示终止密码子；

图6a是图5中实施例的不同qRT-PCR引物的起峰图谱，图6b是图5中实施例的不同 qRT-PCR引物的扩增产物的熔解曲线；

图7是Ax1的PolyA位点定位图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同 或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面首先结合附图具体描述根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始 位点和PolyA位点的方法。

如图1所示，根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA 位点的方法包括以下步骤：

S1：在待测基因的编码区的任意区段设计一对实时定量PCR引物作为对照引物。

S2：对所述待测基因的转录起始位点进行定位：启动子区自起始密码子起，每隔第一 预定个数的碱基对设计一对第一引物，所述第一引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱 基对，并向上游步移预定距离。

S3：对所述待测基因的PolyA位点进行定位：自终止密码子起，每隔第一预定个数的 碱基对设计一对第二引物，所述第二引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向 下游步移预定距离。

S4：对所述对照引物、第一引物和第二引物进行扩增，并对扩增片段进行特异性分析， 确定所述待测基因的转录起始位点和PolyA位点。

由此，根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的 方法，用qRT-PCR技术同时检测基因不同区段的表达丰度，对转录起始位点和PloyA位点 进行精确定位，解决目的基因非翻译区长度不确定性问题，使RACE克隆过程中的引物设计 摆脱对编码区的依赖，将设计位点前移到起始位点和PloyA位点附近，只需扩增500bp以 内的小片段，就可以克隆出非翻译区，该方法使用范围宽泛，并且定位的灵敏度和准确度 高。

采用根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方 法，能够准确定位基因的转录起始位点和PolyA位点。定位的精确性取决于定位引物的密 度，转录起始位点和PolyA位点附近的定位引物密度越大，定位越精确。

根据本发明的一个实施例，所述第一预定个数为180-220，所述第二预定个数为50-250， 所述预定距离为1000-8000个碱基对。

其中，根据本发明实施例的引物的设计可以利用Primer 5.0软件：具体地，所述对照 引物、第一引物和第二引物的长度均为18-25个碱基对，进一步地，所述对照引物、第一 引物和第二引物的退火温度为60-65℃，GC含量为40-60％。

相比于传统的qRT-PCR，根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点 和PolyA位点的方法的反应体系均使用等量的同一样品做模板，即所述转录起始位点定位 的对照引物和第一引物的模板量相同，所述PolyA位点定位的对照引物和第二引物的模板 量相同。

优选地，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度差小于等于2℃。在本发明的 一些具体实施方式中，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度相等，即PCR反应 均使用同一退火温度。PCR反应须在同一批次运行，即所述对照引物和第一引物的扩增反 应在同一批次进行；对照引物和第二引物的扩增反应在同一批次进行。

为了确保引物的扩增特异性，还应该进行扩增片段特异性分析，产物变性的具体参数 是：对扩增片段进行特异性分析时，产物变性数据是从72℃到95℃，每5s升温0.2℃。

根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法的 数据分析具体如下：

1)产物特异性判断：熔解曲线峰单一。

2)转录区与非转录区的区别：在PCR扩增图谱中，转录区起峰(对照引物为阳性对照)， 非转录区不起峰。

3)转录起始位点：被定位在起峰引物对的正向引物结合位点和相邻不起峰引物对的正 向引物结合位点之间。

4)PolyA位点：被定位在起峰引物对的反向引物结合位点和相邻不起峰引物对的反向引 物结合位点之间。

由此，根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的 方法能够准确定位基因的转录起始位点和PolyA位点。

下面结合具体实施例描述本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和 PolyA位点的方法。

实施例一利用qRT-PCR精确定位小麦高分子量谷蛋白亚基基因Ax1的转录起始位点

1、总RNA提取

以中优9507小麦为材料，取开花后14天的未成熟种子5-6粒，加液氮研磨后用于总 RNA提取。

1)将采集的小麦种子(约50mg)放入液氮预冷的研钵中，研成粉末，然后转入预冷 的1.5ml离心管中，加入0.5ml提取液，震荡4-6min；再加入0.5ml水饱和酚：氯仿： 异戊醇＝49：49：2，涡旋震荡5min，4℃，13000rpm离心5min；取0.5ml上清至新管， 加入1ml TRIzol充分混匀，冰上放置10min。

2)4℃，12000rpm离心10min，将上清液转移到1.5ml新的无RNase离心管中；加 入0.2ml氯仿，剧烈摇动15s，室温放置5min。

3)4℃，12000rpm离心10min，将上层水相转移到1.5ml新的无RNase离心管中。 加入0.5ml异丙醇，1/10体积3M NaAc(pH＝5.2)颠倒混匀，-70℃放置30min。

4)4℃，12000rpm离心10min。

5)弃上清，加入1ml 70％乙醇；4℃，1000rpm离心5min。

6)重复步骤(6)一次。

7)弃去上清，室温干燥5-10min，加入20μl灭菌的DEPC H2O溶解RNA，-70℃保存 备用。

提取液10ml：

2.cDNA合成

利用PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，6210A)制备。

3.仪器设备

CFX96Touch^TM荧光定量PCR检测系统，伯乐公司。

4.实时定量PCR检测

1)反应体系：

SYBR Green I(TaKaRa，RR420A)：10μl

正向引物(1μM)：1μl

反向引物(1μM)：1μl

cDNA：2μl

ddH2O：6μl

2)反应程序：

95℃预变性1min；95℃变性15s，58℃退火25s,72℃延伸20s，共35个循环。

3)产物特异性分析：

72℃-95℃，变性温度每5s升温0.2℃。

5、数据分析

1)产物特异性判断：P1、P2两对引物扩增产物熔解曲线峰均单一，扩增产物特异。

2)转录区与非转录区定位：PCR扩增图谱中，如对照引物P1类似，定位引物P2有扩 增产物，而P3-P6引物没有扩增产物，因此判定P2引物位于转录区内，而P3-P6位于非转 录区内。

3)转录起始位点：被定位在P2的正向引物结合位点和P3的正向引物结合位点之间。

对中优9507小麦高分子量谷蛋白亚基基因Ax1转录起始位点进行定位，引物设计位点 如图2所示，引物序列如表1所示：

表1.小麦Ax1转录起始位点定位引物及对照引物序列

qRT-PCR峰图如图3a和图3b所示，其中，仅有对照引物P1与定位引物P2起峰，如箭 头所示。二者产物唯一，如图3b中箭头所示。

定位结果如图4所示，Ax1的转录起始位点被定位在如图4中虚线所示位置，即ATG 上游第56位碱基到第82位碱基之间，而5’RACE克隆的结果表明该基因的实际起始位点 是ATG上游第58位碱基。

实施例二利用qRT-PCR精确定位小麦高分子量谷蛋白亚基基因Ax1的PolyA位点

总RNA提取、cDNA合成、实时定量PCR检测及仪器设备如实施例一中所示。

数据分析

1)产物特异性判断：P1、P2两对引物扩增产物熔解曲线峰均单一，扩增产物特异。

2)转录区与非转录区定位：PCR扩增图谱中，如对照引物P1类似，定位引物P2 有扩增产物，而P3-P5引物没有扩增产物，因此判定P2引物位于转录区内，而P3-P5 位于非转录区内。

3)PolyA位点：被定位在P2的反向引物结合位点和P3的反向引物结合位点之间。

对中优9507小麦高分子量谷蛋白亚基基因Ax1PolyA位点进行定位，引物设计位 点如图5所示，引物序列如表2所示：

表2.小麦Ax1PolyA位点定位引物及对照引物序列

qRT-PCR峰图如图6所示，仅有对照引物(P1)与定位引物(P2)起峰，如箭头所 示。二者产物唯一，如6b中箭头所示。定位结果如图7所示，PolyA位点被定位在如 图中虚线所示位置。

总而言之，根据上述实施例可以看出，根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位 基因转录起始位点和PolyA位点的方法，可以对转录起始位点和PloyA位点进行精确定位， 解决目的基因非翻译区长度不确定性问题，使RACE克隆过程中的引物设计摆脱对编码区的 依赖，将设计位点前移到起始位点和PloyA位点附近，只需扩增500bp以内的小片段，就 可以克隆出非翻译区，该方法使用范围宽泛，并且定位的灵敏度和准确度高。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点 包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一 定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况 下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。